TUTORAT SANTE MONTPELLIER- NIMES METHODES D ETUDE DE LA CELLULE UE2 SPR 2011-2012 1
NOTIONS THÉORIQUES Un microscope est un système grossissant composé de deux lentilles convergentes: L objectif, proche de l objet L oculaire, proche de l œil. L indice de réfraction définit la capacité d un milieu translucide à dévier un rayon lumineux, et est nommé «n»= c/v. Un dioptre est l interface entre deux milieux translucides d indice de réfraction différents. Le pouvoir de résolution est la distance minimale qui doit séparer deux points pour être discernés au travers d un système optique. UE2 SPR 2011-2012 2
GÉNÉRALITÉS Un microscope est caractérisé par: Son grossissement (ou puissance) qui varie selon les lentilles utilisées Son pouvoir de résolution, qui dépend de la longueur d onde du rayonnement utilisé. Il existe deux grands types de microscopes: Le microscope optique (MO), qui utilise les photons de trois façons: transmission, réflexion, réémission Le microscope électronique (ME), qui utilise les électrons. UE2 SPR 2011-2012 3
Le microscope optique La puissance = le grossissement = grossissement oculaire x grossissement objectif Pouvoir de séparation = pouvoir de résolution = distance min entre 2 points pour qu ils soient distinguables = fonction de la longueur d onde du rayon utilisé UE2 SPR 2011-2012 4
LA TRANSMISSION (MO) On parle de transmission quand l objet translucide est traversé par la lumière. Les photons interagissent de deux façons: Absorption par l objet (image nuancée en lumière monochromatique et colorée et lumière polychromatique) Contraste de phase: les photons sont diffractés en décalage, ce qui provoque une différence d intensité lumineuse entre deux points, qui est perçue par l œil. L objet doit être en relief! On utilise la transmission avec le microscope à fond clair, le microscope à contraste de phase, le microscope confocal. UE2 SPR 2011-2012 5
LA RÉFLEXION (MO) On parle de réflexion quand l objet est latéralement éclairé et qu il réfléchit les photons au niveau de sa surface, qui est donc la seule partie visible (on ne voit pas l intérieur). L objet doit être en relief! On utilise la réflexion avec le stéréomicroscope (ou loupe binoculaire ou microscope chirurgical) et le microscope à fond noir. UE2 SPR 2011-2012 6
LA RÉÉMISSION (MO) On parle de réémission quand les molécules instables de l objet réémettent les photons à une longueur d onde différente dans toutes les directions de l espace. On utilise la réémission dans: Le microscope à fluorescence: permet de visualiser des substances fluorescentes ou rendues telles par l utilisation d un fluorochrome. Ceci permet de localiser des éléments dans une cellule. La microscopie bi ou multi photonique: on envoie des rayons de λ > 800 nm (IR) avec des lasers femtoseconde, pouvant donc traverser des objets épais. Ceci augmente la pb d absorption de pls photons simultanément et donc d obtenir beaucoup de fluorescence pour une faible intensité excitatrice. UE2 SPR 2011-2012 7
FABRICATION DE LAMES Pr observer une cellule, il faut inactiver les enzymes, durcir le tissu et le découper en «tranches» très fines de manière à ce qu il soit translucide (coupes). Il y a pls étapes: Fixation avec des solutions diluées d aldéhydes ou de sels oxygénés de métaux lourds Durcissement par congélation, polymérisation ou inclusion dans de la paraffine.. UE2 SPR 2011-2012 8
FABRICATION DE LAMES Découpage en tranches d une épaisseur de qqs microns par un microtome et recueil sur lames de verre traitées chimiquement pour coller la coupe. Réhydratation (s il y a eu une déshydratation préalable) par immersion dans un solvant organique et des bains d alcool de concentrations décroissantes. Coloration par: Les colorants signalétiques: pr la forme de la cellule et des organites volumineux (hématoxyline, éosine, bleu de méthylène). Ils sont basiques (pour les structures acides = basophiles) ou acides (pour les structures basiques = acidophiles). Les colorants cyto/histochimiques colorant une substance de manière spécifique. Observation à sec ou en immersion dans l huile de cèdre. UE2 SPR 2011-2012 9
AUTRES EXAMENS Les extemporanées sont des coupes issues d échantillons congelés au CO2 dans un cryostat et découpés en tranches de plus de 15 microns pour être colorées et observées rapidement lors d un opération chirurgicale (pas de fixation!). Certaines sont conservées pour étudier l activité enzymatique (cyto/histo-enzymologie). Les cellules sur frottis sont observées après dépôt sur lame, dessication et coloration (pas de fixation! en général) L examen de cellules vivantes nécessite un microscope inversé (la lumière arrive par le bas) et l utilisation de colorants non toxiques (=vitaux ex: vert Janus B). On peut aussi utiliser le microscope à contraste de phase. UE2 SPR 2011-2012 10
LE MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE Les rayons de faible λ étant non incurvables, on utilise les électrons pour augmenter la résolution. On utilise trois types d électrons: Les primaires sont ceux qui traversent l objet (MET) Les secondaires sont arrachés aux atomes par les primaires, ont une faible énergie et permettent une bonne résolution (MEB) Les rétrodiffusés sont renvoyés par les noyaux, ont une forte énergie et ne permettent qu une faible résolution (qqs applications du MEB). UE2 SPR 2011-2012 11
LE MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE Il est formé: -D un canon à électrons (une anode et une cathode produisant le flux) -De bobines électromagnétiques focalisant le flux d électrons et dont la variation de puissance est continue (avantage +++ comparé au MO) -Une autre bobine projette l image produite sur un écran fluorescent pour qu elle soit visible, et on observe au travers de hublots teintés de plomb pour arrêter les rayons X nocifs. UE2 SPR 2011-2012 12
LE MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE Il existe deux types de ME: Le MET (à transmission) pour les coupes Le MEB (à balayage) qui récupère les électrons secondaires renvoyés par la surface de l objet par un collecteur. Travail dans le vide Coupes réalisées de 50 nm d épaisseur Grilles et non plaques de verre comme support pour limiter l interaction avec la matière Colorants spécifiques, les métaux lourds, pour optimiser l absorption par l échantillon. UE2 SPR 2011-2012 13
LE MET Il fonctionne comme un MO, mais utilise des électrons. La fixation se fait au glutaraldéhyde et est renforcée par l acide osmique. L objet est ensuite durci par des résines époxy, bcp plus solides que la paraffine: araldite, cyanolite ou métacrylate (polymérisation irréversible). On emploie donc des «colorants» particuliers: Signalétiques: Spécifiques: anticorps fixés à des métaux lourds et spécifiques d une structure de la cellule (avant inclusion!). Négatifs: colorent tout sauf les particules que l on souhaite voir comme les virus ou les protéines. On découpe avec un ultra microtome. UE2 SPR 2011-2012 14
CRYOFRACTURE ET CRYODÉCAPAGE Techniques pour visualiser la surface des objets au MET. Refroidissement de l objet à 196 C en présence d un cryoprotecteur (évite que l objet ne s abîme), puis fracture: Dans la cryofracture, on réalise un ombrage métallique sur la zone de fracture, qui est une zone de moindre résistance (comme la membrane plasmique) Dans le cryodécapage, on réalise une sublimation de l eau contenue dans la zone de clivage pour faire ressortir les objets, puis on réalise un ombrage métallique (cytosquelette). UE2 SPR 2011-2012 15
LE MEB Il balaye l objet avec un faisceau d électrons primaires qui produisent des électrons secondaires. Ceux ci sont collectés pour former une image de la surface de l objet. La fixation et la déshydratation rétractent l échantillon, d ou l utilisation de CO2 pour redonner du volume. L objet ne doit ni être inclus, ni être coupé. Il faut également faire un ombrage métallique pour accentuer la libération d électrons secondaires. UE2 SPR 2011-2012 16
COMPARAISON Grossissement: MET: 500 000 MEB: 100 000 Pouvoir séparateur: MET < MEB (le pouvoir de séparation le meilleur est le plus faible). Ces techniques sont complémentaires pour une étude complète. UE2 SPR 2011-2012 17