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5. MATERIEL ET METHODES : 5.1 ZONE D'ETUDE ET RECRUTEMENT DES SUJETS : L'étude a été menée dans le village de Dienga, présenté dans le chapitre 3.4 page 39. Le protocole a été validé par le comité d'éthique du C.I.R.M.F.. Soixante et un enfants, issus de 10 familles, ont été recrutés après explication du protocole et obtention du consentement des parents. La connaissance de la filiation des enfants repose sur un recensement réalisé sur questionnaire par le Dr André Renaut. D'après les données génétiques obtenues pour les enfants et les adultes au cours des études précédentes, il a parfois été possible de vérifier ou d'exclure du recrutement certains sujets pour leur non-appartenance à une fratrie (groupe sanguin, drépanocytose, HLA, génotype G6PD). Toutefois, si le lien maternel est facilement révélé, l'identité du père est parfois difficilement avouée. Le lien maternel reste donc seul à être fiable pour définir la filiation des fratries. L'ensemble des foyers est distribué de façon homogène dans le village. 5.2 DEROULEMENT DE L'ETUDE. Les enfants ont été recrutés en mai 1998 pour une étude transversale comprenant un prélèvement de sang périphérique et la réalisation d'un frottis et d'une goutte épaisse de sang. A cette occasion, les enfants ont systématiquement reçu un traitement curatif pour éliminer les parasites circulants. Un suivi longitudinal de 30 semaines, jusqu'en décembre 1998, a ensuite été mené pour mesurer simultanément le délai de réinfection, les densités parasitaires à P. falciparum et la fréquence d'infection à P. malariae (voir la Figure 11 page 48). 5.3 COUPE TRANVERSALE. En mai 1998, à J0, un frottis et une goutte épaisse ont été réalisés sur les 61 enfants afin de mesurer la prévalence des infections à P. falciparum, P. malariae et P. ovale. Un prélèvement de sang a été réalisé par voie veineuse sur tube EDTA Vacutainer (Becton Dickinson, Meylan, France) chez les enfants les plus âgés, et par voie capillaire chez les plus jeunes, à l'aide de tubes Microtainer (Becton Dickinson). Durant le trajet menant au laboratoire de Franceville, le sang a été conservé en glacière réfrigérée, puis stocké à +4 C jusqu'à son traitement. Ces échantillons ont été utilisés pour des examens hématologiques (numération et formule sanguine, groupe sanguin, taux d'hémoglobine, drépanocytose, activité de la G6PD) et des dosages sérologiques 47
d'anticorps et de cytokines. Une fois séparés, les plasmas ont été conservés à 80 C jusqu'aux analyses. Les globules blancs ont été isolés par lyse des hématies, stockés à 80 C, et utilisés comme source d'adn. FIGURE 11: DEROULEMENT DE L'ETUDE. J0 J210 Etude transversale. Suivi longitudinal (mesure du délai de réinfection). Moyennes des Densités Parasitaires Ajustées à l'âge et à la date de prélèvement (MDPA à P. falciparum). Fréquence des infections à P. malariae. 5.4 TRAITEMENT CURATIF. A J0, après les prélèvements, les enfants ont été traités de manière systématique par de l'amodiaquine (Flavoquine ; Roussel, Paris, France) par voie orale, à raison de 10 mg/kg/jour. Les enfants les plus jeunes ont reçu le traitement pendant 2 jours (20 mg/kg) et les enfants plus âgés pendant 3 jours (30 mg/kg). Cette différence de posologie est due à l'apparition de douleurs abdominales chez les jeunes enfants qui étaient restés à jeun toute la journée après la seconde prise du traitement. Les médicaments ont été administrés par nos soins pour surveiller leur bonne prise. Les frottis sanguins suivants, effectués selon un rythme hebdomadaire, ont permis de vérifier l'efficacité du traitement. L'échec thérapeutique a été défini par la présence de parasites du stade sanguin dans les 2 semaines qui ont suivi le traitement. Le choix du traitement s'est porté sur l'amodiaquine en raison de la faible fréquence de résistance des souches plasmodiales à cette molécule en Afrique centrale (Pradines, B., et al. 1998; Ringwald, P., et al. 1998), et pour des raisons pratiques de travail sur le terrain (une prise unique par jour). La demi-vie de l'amodiaquine est de 2 semaines. 5.5 MESURE DU DELAI DE REINFECTION. Le suivi longitudinal a débuté au moment de la prise du traitement et s'est terminé à la mi-décembre 1998, englobant la grande saison sèche, et la petite saison des pluies. Le suivi consistait à un prélèvement de sang capillaire hebdomadaire jusqu'à la 11 e semaine, puis bimensuel jusqu'à la 30 e semaine. Les gouttes épaisses et les frottis ont été colorés au Giemsa et 48
examinés au microscope. La présence de plasmodies a été recherchée sur les gouttes épaisses, et la présence de co-infections plasmodiales confirmée sur le frottis. Les densités parasitaires à P. falciparum ont été calculées sur la base d un nombre de 6500 leucocytes par µl de sang, valeur moyenne mesurée chez ces enfants. Pour une lecture de 1000 globules blancs, le seuil de sensibilité est de l'ordre de 7 parasites/µl de sang. Simultanément au comptage des parasites de P. falciparum, la présence des autres espèces a été dépistée. Le délai de réinfection a été défini comme étant la date à laquelle est apparue la première lame positive à P. falciparum sans nécessairement enregistrer la présence de symptômes. La dernière lame négative et la première lame positive ont été confirmées par un second examinateur. Les sujets ont été exclus pour échec thérapeutique si les gouttes épaisses de la 1 ère et de la 2 ème semaine ont été trouvées positives. Des sujets ont été exclus pour une insuffisance de régularité dans le suivi si plus de 2 gouttes épaisses successives étaient manquantes avant la réinfection. 5.6 CALCUL DES MOYENNES DES DENSITES PARASITAIRES AJUSTEES (MDPA). L'ajustement est une méthode de calcul qui permet d'estomper l'effet d'une variable qui influence significativement la variable d'intérêt et dont l'effet peut masquer celui d'une troisième variable. Cette méthode appliquée aux densités parasitaires permet ainsi d'étudier de manière plus spécifique la relation entre la densité parasitaire et des co-variables qui l'influencent dans une moindre mesure. L'ajustement s'effectue généralement sur l'âge, puisque l'immunité antiparasitaire s'installe progressivement avec l'âge, et sur la date de prélèvement, puisque les variations saisonnières de transmission influencent directement les densités parasitaires. La quasi-totalité des études longitudinales sont en accord pour reconnaître que ces deux variables sont liées aux densités parasitaires (Beadle, C., et al. 1995; McElroy, P. D., et al. 1997). Pendant l'étude longitudinale, seules les densités parasitaires, en dehors des périodes symptomatiques, mesurées à partir de la 9 e semaine du suivi, ainsi que la première détermination avant traitement, ont été considérées pour le calcul de la MDPA. Ce schéma d'analyse a été choisi afin d'éviter l'influence du traitement curatif initial. La prévalence parasitaire à l'inclusion était de 67%. La borne inférieure de l'intervalle de confiance 95% de cette prévalence est de 45%, valeur de nouveau atteinte au sein de notre cohorte à la 9 e semaine du suivi. D'autre part, au cours du suivi, les lames obtenues les semaines suivant un traitement pour accès fébrile ont été exclues. De même, les sujets ayant moins de 5 gouttes épaisses ont été exclus ainsi que les fratries dont l'effectif ne dépassait pas 3 enfants. 49
L'ajustement a été réalisé simultanément sur l'âge et la date. Les sujets ont été regroupés par tranches croissantes d'âge (1-2, 3-5, 6-9, 10-13 et 14-17 ans) formant des groupes pour chaque date de prélèvement. Les densités parasitaires sont réduites au Log10 en ajoutant la valeur 1 pour tenir compte des lames négatives: LogDP = Log10 ( DP+ 1) Ensuite, pour chaque groupe d'âge et chaque date de prélèvement, la moyenne arithmétique des LogDP du groupe est soustraite au LogDP de chaque sujet donnant la densité parasitaire ajustée, "n" étant le nombre de gouttes épaisses dans le groupe: DPA = LogDP LogDP La DPA est donc la différence du LogDP du sujet par rapport aux autres sujets du même âge et pour la même date de prélèvement. La MDPA est la moyenne arithmétique des DPA du sujet, "n" étant le nombre de prélèvements : MDPA DPA = n La MDPA est donc une évaluation de la densité parasitaire qu'un sujet est capable de tolérer sans développer de symptômes. Cette valeur n'est sous l'influence ni de l'âge ni des variations saisonnières. n 5.7 VARIATIONS GEOGRAPHIQUES DE L'EXPOSITION AUX VECTEURS : Des données entomologiques (captures de moustiques entre 1994 et 1997) et des données géographiques (plan du village et positions des maisons dans lesquelles ont été réalisées les captures) ont été mises en relation par des tests statistiques pour tenter de mettre en évidence une variation géographique du risque d'exposition. Ce travail étant rétrospectif et les captures ayant eu lieu dans des maisons différentes de celles ou vivaient les sujets de la présente étude, l'analyse des variations d'exposition aux vecteurs a été faite par rapport à la position géographique des foyers à l'intérieur du village. Les captures ont été menées de nuit de janvier à décembre 1996 et de mars 1998 à mars 1999 sur un nombre de 21 maisons réparties dans le village. Durant cette période, 24 nuits de capture ont été réalisées dans 2 ou 3 maisons simultanément par des captureurs volontaires. Le nombre de moustiques infectés capturés à été faible (30 moustiques infectés sur 333 Anopheles au cours de 24 captures comprenant Anopheles gambiae s.l., An. hancocki et An. funestus). En conséquence, l'analyse à été menée en considérant l'agressivité anophélienne et non le taux d'inoculation entomologique. Pour chaque capture, la proportion 50
relative de moustiques capturés dans chaque foyer à été calculée et la moyenne des fréquences pour chaque foyer est représentative du taux d'exposition. 5.8 EXAMENS HEMATOLOGIQUES. Les enfants scolarisés durant la campagne 1995-1997 avaient déjà été caractérisés sur le plan hématologique (groupe sanguin, drépanocytose, génotype G6PD). Ces examens ont été pratiqués pour les plus jeunes enfants (qui ne faisaient pas partie de l'étude antérieure) et un phénotypage de la G6PD a été réalisé pour l'ensemble de la cohorte. Les déterminations du groupe sanguin et de la drépanocytose ont été effectuées respectivement par un test sérologique d'agglutination et par électrophorèse de l hémoglobine, par le laboratoire d'analyses médicales du C.I.R.M.F. à partir du sang total, et ceci dans les 2 jours qui ont suivi le prélèvement. Le phénotypage de la G6PD a été réalisé par la méthode du spot-test sur sang total 5 jours après le prélèvement. Ce test repose sur l'oxydation du glucose-6-phosphate en présence de G6PD et de NADP +, qui produit du 6-phosphogluconate, de l'hydrogène et du NADPH. La production de NADPH est visible sous lumière UV grâce à sa propriété physique de fluorescence. Cette technique est simple et rapide, mais la lecture visuelle ne permet qu'une analyse qualitative ne détectant que des déficiences de plus de 80% de l'activité enzymatique. En conséquence, la plupart des sujets féminins hétérozygotes ne sont pas détectés. Le génotypage de la G6PD a été réalisé par deux amplifications par PCR des régions génomiques encadrant les mutations 376 et 202 situées en amont du site de transcription, et révélées ensuite par migration des fragments de digestion par des enzymes de restriction. Les détails de la technique sont donnés en annexe page 105. 5.9 DOSAGES DE L'IL-10 ET DE L'IFN-γ PLASMATIQUES PAR ELISA. Les puits de microplaques Costar sont revêtus de l'anticorps primaire (IL-10: Pharmingen ; IFN-γ : Mabtech ; 100 µl aux concentrations respectives de 8 et 2 ng/ml dans du tampon carbonate 12 ) pendant une nuit à +4 C. Après 4 lavages en PBS-Tween 0,3%, les puits sont saturés avec 200µl de PBS-Tween 0,3%-BSA 13 4% pendant 2 heures à température ambiante. Après 4 nouveaux lavages dans les mêmes conditions que précédemment, les plasmas non dilués sont déposés en duplicata à raison de 100 µl/puits. Des puits sont réservés à la gamme étalon de cytokines recombinantes (IL-10 et IFN-γ : Pharmingen). L'incubation dure une nuit à 12 Tampon carbonate: 1,59 de Na CO + 2,93 de NaHCO dans l'eau distillée, ajuster à ph 9,6. 2 3 3 13 BSA: Bovine Serum Albumin 51
+4 C. Après 4 nouveaux lavages, le second anticorps, biotinylé, est incubé pendant 1 heure (IL-10: Pharmingen ; IFN-γ : Mabtech ; 100 µl aux concentrations respectives de 2 et 1 ng/ml dans du PBS-Tween 0,3%), puis après 4 lavages, une nouvelle incubation est effectuée avec 100 µl d'avidine peroxydase pendant 30 mn à température ambiante pour l'il-10 ou 100 µl de streptavidine/phosphatase alcaline pendant 2 heures à température ambiante pour l' IFN-γ. Après 4 derniers lavages, les substrats de la peroxydase et de la phosphatase alcaline sont ajoutés ; respectivement le tetra-methyl-benzedine et le pnpp 14. Les plaques sont incubées quelques minutes dans l'obscurité et la densité optique lue respectivement à 405 et 450 nm. Après soustraction pour chaque plaque des valeurs de densité optique des puits contrôles ne comprenant pas de plasma, les concentrations dans les plasmas sont calculées à l'aide de l'équation de la droite de régression de la gamme étalon. Les seuils de détection pour les deux cytokines ont été définis à 2 pg/ml. 5.10 DOSAGE DES ANTICORPS PLASMATIQUES. Les IgG et les sous-classes d'igg spécifiques d'antigènes des stades pré-érythrocytaires de P. falciparum (peptides de synthèses (NANP) 5, voir page 33 ; LSA-Rep et LSA-J voir page 34) et de P. malariae (peptide de synthèse (NAAG) 5, voir dans le chapitre sur la CS protéine de P. falciparum page 33) ainsi que des antigènes des stades sanguins (PfSE du clone HB3, voir page 38 ; et protéines recombinantes MSA-1 19, voir page 35 ; A3 et B3 de MSA-2, voir page 36) ont été mesurés par une méthode ELISA classique détaillée en annexe page 108. Brièvement, les plaques ont été revêtues par les antigènes puis incubées une nuit à +4 C. Après un blocage avec du PBS-BSA 15, les plasmas sont ajoutés dilués au 1/100 et incubés une nuit à +4 C. Les IgG sont révélés immédiatement à l'aide d'un anticorps monoclonal de chèvre anti-humain conjugué à la phosphatase alcaline, dont le produit de la réaction en présence de pnpp donne une coloration proportionnelle à la quantité d'anticorps fixée. Pour le dosage des IgG1, IgG2, IgG3 et IgG4, une incubation d'une nuit à +4 C avec des anticorps monoclonaux de souris anti-humain spécifiques des sous-classes a lieu avant la révélation avec le conjugué chèvre anti-souris. Les densités optiques des puits sont mesurées à 405 nm. Les plasmas sont testés en duplicata et comparés à un mélange de plasmas de sujets fortement répondeurs. Les valeurs sont exprimées en unités arbitraires (U.A.) par rapport au groupe de sujets fortement positif. Afin d'approfondir l'analyse, les ratios entre IgG et sous-classes et les ratios 14 pnpp: p-nitrophenyl phosphate. 15 PBS-BSA: Phosphate Buffer Solution + Bovine Serum Albumin. 52
entre sous-classes ont été calculés afin d'évaluer l'importance des proportions entre les spécificités d'anticorps. Afin de calculer les taux prévalences des réponses, des seuils ont été calculés en dosant, pour chacun des antigènes, les IgG et les sous-classes d IgG de plasmas de 17 sujets non-exposés. Pour les réponses dirigées contre les antigènes des stades pré-érythrocytaires, le seuil a été déterminé par la moyenne + 3 déviations standards de ces sujets non immuns. Pour les réponses dirigées contre les antigènes des stades sanguins, les dosages réalisés sur les plasmas de sujets non immuns ont donné des taux extrêmement faibles d anticorps, produisant souvent des prévalences proches de 100%. Pour cette raison, les seuils ont été calculés par rapport à un taux arbitraire de 20UA de réponse par rapport au pool positif. 5.11 ANALYSES STATISTIQUES. L'analyse multivariée serait la méthode la mieux adaptée pour répondre à nos questions mais les faibles effectifs des différents groupes ne permettent pas d'utiliser ce type d'analyse. Par conséquent, nous avons été contraints d'adapter une méthodologie analytique qui est limitée en final à une comparaison plus descriptive que statistique. Dans un premier temps, les fratries, la variation géographique de l exposition aux vecteurs et les variables parasitologiques (prévalence à J0, délai de réinfection, MDPA, fréquence des infections par P. malariae) seront décrites. Nous analyserons ensuite la distribution des variables parasitologiques parmi les fratries. Une relation mise en évidence au cours de cette analyse supposerait un contrôle familial (au sens large du terme) de la sensibilité au paludisme. Dans ce cas, pour tenter d'expliquer la distribution du ou des facteurs parasitologiques dans les fratries, les variables parasitologiques seront comparées à différents facteurs susceptibles de les influencer (facteurs géographiques et facteurs génétiques) à titre individuel. Ces facteurs étant totalement dépendant des fratries, les relations entre ces facteurs et les variables parasitologiques permettraient d'expliquer la distribution familiale des phénotypes parasitologiques. Les réponses immunitaires sont sous contrôle génétique mais sont fortement influencées par des variations phénotypiques. Ainsi, les réponses immunitaires (cytokines et réponses anticorps) seront comparées aux variables parasitologiques. Puis les réponses immunitaires significativement liées aux variables parasitologiques seront confrontées à la distribution familiale, aux facteurs génétiques et à la position géographique pour déterminer si ces réponses immunitaires sont à l'origine de la distribution des variables parasitologiques dans les fratries (Figure 12 page 54). Les tests statistiques ont été réalisés à l'aide du logiciel StatView version 4.57, Abacus Concepts Inc.. Lorsqu'elles suivent une loi normale, les variables continues ont été comparées 53
entre groupes définis par une variable nominale par le test-t pour les groupes de 2, et par un test ANOVA pour les groupes multiples (analyse des variances). Dans le cas contraire, les tests nonparamétriques de Mann-Whitney (2 groupes) et Kruskal-Wallis (multigroupes) ont été utilisés. Les comparaisons de variables qualitatives sont faites par un test de Chi2. Les valeurs de P <0,05 sont considérées significatives et les valeurs de P comprises entre 0,05 et 0,08 sont considérées comme reflétant une tendance. Prévalence à J0. Délai de réinfection. DONNEES PARASITOLOGIQUES MDPA. Fréquence des infections à Pm. FACTEURS GENETIQUES FACTEURS IMMUNITAIRES FACTEURS GEOGRAPHIQUES FRATRIES INDIVIDUS FIGURE 12: CONDUITE DES ANALYSES STATISTIQUES La distribution des phénotypes des facteurs parasitologiques a été analysée à titre individuel et en tenant compte de la filiation des enfants. La comparaison de ces phénotypes avec les facteurs génétiques, immunitaires et géographiques a pour but d'expliquer la distribution des phénotypes parmi les individus et les fratries lorsque celleci n'est pas due au hasard. Facteurs génétiques: polymorphisme des érythrocytes (groupe sanguin, trait drépanocytaire, G6PD); Facteurs immunitaires: taux de cytokines et taux d'anticorps sériques anti-stades préérythrocytaires et anti-stades sanguins; Facteurs géographiques: position de la maison par rapport au risque d'exposition. 54