Fiche TP n 1 : Initiation aux techniques biochimiques Préparation de la solution mère : Bleu de méthylène (10-5 et 0.5x10-5 M). Lire la densité optique à l aide d un spectrophotomètre des deux solutions à des longueurs d ondes de 400 à 900 nm. Interpréter vos résultats. Préparation des dilutions : Dilution 1 1/2 1/4 1/6 0 Solution mère (ml) 1 1 1 1 0 H 2 O (ml) 0 1 3 5 1 Volume Total (ml) 1 2 4 6 1 DO Déterminer la concentration pour chaque dilution. Lire la densité optique à l aide d un spectrophotomètre, de chaque dilution à une longueur d onde = 640 nm. Tracer les droites DO = f (S) et 1/DO = f (1/ S). Interpréter vos résultats.
Fiche TP n 2 : Préparation d une solution Tampon de ph déterminée. Préparation des solutions Tampons : Préparer les solutions de HCl et de NaOH à 1M, mélanger et diluer à 100ml. - Agiter et mesurer le ph à l aide du ph mètre. Etude des solutions acides et basiques : HCl (ml) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 NaOH (ml) 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ph - Agiter et mesurer le ph à l aide du ph mètre. - Interpréter vos résultats. Etude croissante du ph : HCl (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 NaOH (ml) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 H 2 O (ml) 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ph - Agiter et mesurer le ph à l aide du ph mètre. - Interpréter vos résultats. Etude décroissante du ph : NaOH (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 HCl (ml) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 H 2 O (ml) 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ph - Agiter et mesurer le ph à l aide du ph mètre. - Interpréter vos résultats.
Fiche TP n 3 : Electrophorèse sur gel de ployacrylamide Préparations des gels : L électrophorèse est réalisée en condition dénaturante (PAGE-SDS). Deux gels sont préparés, un gel de concentration à 5% et un gel de séparation à 12.5%. Tampon Tris 1M, ph 8.8 Tampon Tris 1M, ph 6.8 Acrylamide 30% - Bisacrylamide 0.8% Eau distillée Temed 5% SDS 10% Persulfate 10% Concentration finale en Acrylamide 5% (ml) 12.5% (ml) 24.32 2.5 3.32 26.44 13 11.6 0.1 0.32 0.2 0.32 0.2 0.64 Préparations des tampons de l électrophorèse : Glycine (solution mère, ph 7.8) Tris SDS à 1% Eau distillée 14.4g 3.3g 1g 1L Préparations des plaques de l électrophorèse : En premier temps, le gel de séparation est coulé très délicatement à l aide d une seringue entre deux plaques en verre. Après sa polymérisation et en second temps, le gel de concentration est introduit entre les deux plaques. La formation des puits au nombre de 12 est réalisée à l aide d une peigne. Une fois polymérisée, ce second gel est lavé à l aide de l eau distillée, puis introduit dans la cuve d électrophorèse. Après une migration de 3 heures à 75 ma, et à température ambiante, le gel est retiré puis introduit délicatement dans une solution de fixation (trichloro-acétique TCA à 10%) pendant 1 heure. Ensuite, le gel est coloré et décoloré dans des solutions de coloration (bleu de Coomasie) et décoloration. Une fois les bandes sont bien visibles, le gel est pris en photo.
Fiche TP n 4 : Electrophorèse sur gel d agarose Préparation des gels : L électrophorèse est réalisée à raison de 1g d agarose dans un volume de 100ml de TBE, un gel de concentration à 1% La composition du TBE : (tampon de migration) composants Concentrations Tris/Hcl 0.089M EDTA 2.5mM Bleu de bromophénole 0.089M à ph=8 Bromure d Ethidium (BET) 2µl Composition du tampon de charge : Composants Concentrations Tris/Hcl 0.2M à ph=6 EDTA 0.2M à ph=8 Bleu de bromophémole 0.4% Saccharose à 40% 40% Protocole : Electrophorèse sur gel d agarose à 1%, se fait dans un volume de 100ml de TBE 1X (Tris/Hcl : 0.089M, EDTANa 2 : 2.5mM, acide borique : 0.089M, ph=8.0) Contenant 2 µl de bromure d Ethidium (BET) est introduit dans le gel avant qu il ne polymérise. Une fois le gel placé dans la cuve à électrophorèse, préalablement rempli par le tampon de migration (TBE1X), un mélange de 10µl contenant 5µl du produit d amplification st de 5µl de tampon de charge (Tris/Hcl : 0.2M, ph=7.6, EDTA : 0.2M, ph=8.0, bleu de bromophénole 0.4% comme indicateur du fond de migration et du saccharose à 40% alourdisseur de l ADN) sont déposés dans chaque puits, 2 µl de marqueur de de taille exemple : (Smart Ladder) de 14Kb est déposé dans les mêmes conditions afin de déterminer la taille des bandes obtenues. La migration se fait à 100volt pendant 30min, juste après, le produit d amplification est visualisé sous rayons ultra-violets.
Fiche TD n 1 : La chromatographie d exclusion moléculaire Elle est appelée chromatographie d exclusion, diffusion, tamissage moléculaire, gel de filtration. La phase stationnaire est un solide poreux Les grosses molécules sont exclues de la phase fixe Les petites molécules incluses diffusent dans les pores du gel EXERCICE N : 1 On détermine les temps de rétention de (tr) au cours d une chromatographie sur séphadex, les protéines suivantes dont on connait la masse moléculaire (MM), le débit de la colonne est de 5ml/min. Protéines MM Tr(min) Aldolase 145000 10.4 Lactate déshydrogénase 135000 11.4 Phosphatase alcaline 80000 18.4 Ovalbumine 45000 26.2 lactoglobuline 37100 28.6 1-Expliquer le principe de cette technique 2-Calculer les volumes d élution (Ve) correspondants. Porter le log de MM en fonction de Ve ; que remarquez-vous? 3-Pour la glucokinase. Tr=21. Déterminer sa masse moléculaire à l aide du graphique précédent. EXERCICE N 2 On veut déterminer la masse moléculaire (MM) d une protéine P par chromatographie d exclusion. La limite d exclusion du gel se situe entre 40000 et 400000 de MM.
L étalonnage du gel se fait par diverses substances, dont les MM ( exprimées en daltons ) et les volumes d élution ( Ve, exprimé en ml) sont indiqués dans le tableau suivant : Protéines MM Ve (ml) Dextran 2000000 45 Fibrinogène 340000 60 Catalase 230000 75 Lactoglobuline 19000 132 1- Porter le log de MM en fonction de Ve. Que remarquez-vous? 2- La protéine P montre un volume d élution Ve=113ml. Déterminer sa MM. EXERCICE N 3 On veut séparer un mélange de protéines suivant : Thyroglobuline (669KDa) Ferritine (440KDa), Catalase (232KDa), lactase déshydrogénase (140KDa) et l albumine (66KDa) par une chromatographie d exclusion moléculaire sur gel de séphadex. Le profil d élution est tracé après mesure d absorbance à 280nm des fractions éluées. Le volume d élution Ve de chaque protéine de référence a été déterminé. Le bleu Dextran (2.10 6 Da) permet de déterminer le volume mort Vo du gel. 1- Tracer la droite de calibration : Ve/Vo=f (log PM). Que remarquez-vous? 2- Calculer PM d une protéine. Si son Ve=33ml
Fiche TD n 2 : Chromatographie échangeuse d ions 1- Résine échangeuse de cations : la CM-cellulose (carboxymethyle cellulose) est une résine chargée négativement (R-), les différentes protéines doivent être chargées positivement(+) pour être accrochées à la résine. Le ph du travail doit être <inferieur à l ensemble des phi des protéines (phi c est le ph isoélectrique) 2- Résine échangeuse d anions : DEAE cellulose (diéthyl amino éthyle cellulose), c est une résine chargée positivement (R+), les différentes protéines doivent être chargées négativement pour être accrochées à la résine. Le ph doit être >supérieur à l ensemble des phi des protéines. phi < du travail phi = du travail phi > du travail Protéine chargée e - (négativement) Protéine chargée e 0 (neutre) Protéine chargée e + (positivement) CM-cellulose R - DEAE cellulose R + 1:00000 2:-------- 3:+++++ 1:00000 2:++++++ 3:--------- L ordre d élution : 1 : 0 0 0 0 0 2 : - - - - - 3 : + + + + + L ordre d élution : 1 : 0 0 0 0 0 2 : + + + + + 3 : - - - - -
Exercice n 1 : La carboxyméthyl cellulose (CM-cellulose) est un support échangeur de cations. Parmi les protéines suivantes : Ovalbumine (phi=4.6), Cytochrome (phi=10.65) et lysozyme (phi=11). 1- Quelles sont celles qui sont retenues par la CM-cellulose à ph 7? 2- Avec quel ph doit-on travailler croissant ou décroissant? 3- Si on avait travaillé avec un ph croissant qu elle serait l ordre d élution? Exercice n 2 : on veut séparer 3 acides aminés : l acide L-glutamique, la l-leucine et la L-lysine par chromatographie échangeuse de cations (CM-cellulose), les ph isoélectriques de l acide L-glutamique, de la L-leucine et de la L-lysine sont respectivement : 3,22-5,98-9,74 à 25C, on dépose les trois acides aminés sur la colonne, à ph2, puis on élue progressivement le ph à 7. 1- Expliquez le principe de cette technique. 2- Quels acides aminés sont élus et dans quel ordre? 3- Donnez l ordre d élution à ph4, ph6, ph10 Exercice n 3 : la diéthylaminoéthylcellulose (DEAE-cellulose) est un support échangeur d anions. Parmi les protéines suivantes : Sérumalbumine (phi=4,9), uréase (phi=5), chymotripsinogène (phi=9,5). 1- Expliquez le principe de cette technique. 2- Quelles sont celles, qi à ph 7, sont retenues par la DEAE-cellulose? 3- Avec quel ph doit-on travailler? 4- Donnez l ordre d élution. Exercice n 4 : on a un mélange de protéines suivantes sérumalbumine (phi=4,9), uréase (phi=5), chymotripsinogène (phi=9,5), ovalbumine (phi=4,6), Cytocromec (phi=10,65) et lysozyme (phi=11) L opération a été effectuée à ph neutre 1- Quelle est la méthode qi me permettra une bonne séparation? 2- Si on avait un support échangeur de cations à quel ph doit on travailler? 3- Si on avait un support échangeur d anions à quel ph doit on travailler? Exercice n 5 : on veut séparer et purifier par chromatographie échangeuse d ions, sr gel quaternaire Amino éthyl cellulose (QAE- cellulose)= (DEAE-cellulose) ou bien sur gel sulfopropyle cellulose (SP- cellulose)= (CM- cellulose) ; le mélange suivant : sérumalbumine (phi=4,9), uréase (phi=5) Chymotripsinogène (phi=9,5), lysozyme (phi=11), ribonucléase (phi=9,5) et d-pepsine (phi=1). 1- Donnez le principe de ces deux techniques 2- Comment appelle-t-on cette chromatographie? 3- A quel ph doit-on travailler? donnez l ordre de l élution. 4- Si on avait travaillé à ph neutre, quel serais l ordre d élution? 5- Comparez les résultats pour les deux types de chromatographie précédente à ph=8 que remarquez-vous??
Fiche TD n 3 : Electrophorèse Exercice n 1 : 1200 Après migration de différents fragments d ADN Sur gel d agarose, le résultat obtenu est le suivant : 1- Donnez le principe de cette électrophorèse 2- Déterminer la taille des différents fragments d ADN Si d1=10,50mm, 22,5mm et 32mm 3- Porter log (taille) =f(d). que remarquez-vous? Exercice n 2 : Un mélange de protéine est traité par le SDS et le B-mercaptoéthanol ; après ce traitement, ce mélange est soumis à une électrophorèse Sur gel de polyacrylamide en présence de SDS, à ph=7 1- On mesure la distance de migration, d, de ces protéines dont on connait le PM : Ovalbumine Trypsine Myoglobine Cytochrome PM 43000 23000 17200 13500 d (mm) 37,6 59,9 70 79 -Donnez le principe de cette électrophorèse, le rôle du SDS et B-mercaptoéthanol. -porter log PM en fonction de «d». Que remarquez-vous? 2- pour d autres protéines traitées par le SDS et B-mercaptoéthanol, on a trouvé : Sérumalbumine Lysozyme Anhydrase Pepsine d (mm) 21,5 77,5 52 45 -déterminer le poids moléculaire de ces protéines 3- le poids moléculaire de l hémoglobine est de 64000. On a trouvé après une électrophorèse Sur gel de polyacrylamide en présence de SDS, une seule bande dont la distance de migration et de 73 mm. Quelle est la structure de cette protéine?
Fiche TD n 4 : ISOELECTROFOCALLISATION EXERCICE N 1 : on veut séparer et purifier par la technique d isoelectrofocalisation un mélange de 07 protéines : sérumalbumine (4,9), uréase (5), ribonucléase (9,5), d pepsines (1), lysozyme (11), Cytocromec (10,65) et ovalbumine (4,6). 1- Expliquez le principe de cette technique. 2- Combien de bandes révélera-t-on? donnez l ordre de migration dans le cas ou choisit un gradient de ph croissant? par un schéma. 3- Cette technique est elle la meilleur pour séparer ce mélange? EXERCICE N 2 : Après une isélectrophorèse, le mélange séparé est représenté dans a figure suivante : 3,5 4,74 6 7,25 8,5 1- Compléter le schéma de l électrophorèse, en précisant le sens de migration. 2- Tracer la droite de ph=f (distance par apport à l anode ou à la cathode), que remarquer vous? 3- Déterminer les pi (points isoélectriques) pour chaque molécules : X, Y, Z, W, O Si d1=20mm (par apport à l anode) et d2= 40mm Si d3=4àmm (par apport à la cathode) et d4=50mm, d5=10mm 4- Comment appelle-t-on ces molécules? et dans qu elle zone de ph se trouvent-elles?