Modélisation du développement microbien dans un aliment et application à l'appréciation quantitative des risques Objectifs de la microbiologie prévisionnelle micro-organisme pathogène ou d altération produit alimentaire conditions de vie du produit croissance microbienne? décroissance microbienne? niveau microbien final? ML Delignette-Muller, ENVL Historique Niveaux de modélisation Années 9 modèles simples d inactivation thermique Années 98 nombreux modèles de croissance et de décroissance (naissance de la Microbiologie Prévisionnelle ) Années 99 utilisation de ces modèles en appréciation des risques Niveau primaire Evolution du nombre de micro-organismes en fonction du temps x = f (t, θ) + ε t Niveau secondaire Effet des facteurs environnementaux sur les paramètres des modèles primaires θ = g(t,ph, ) + ε Exemple Ln(x) Exemple µ max µ max temps T ML Delignette-Muller, ENVL 3 ML Delignette-Muller, ENVL Exemple de cinétique ln(x). Modélisation primaire de la croissance x = f (t, θ) + ε t x : concentration en cellules t : temps θ : paramètres de croissance ln(x ) latence croissance exponentielle saturation de la croissance temps obtenue par dénombrement sur boîte de Petri ML Delignette-Muller, ENVL 6
Paramètres de croissance Hypothèses de la croissance exponentielle ln(x) cellule tg x cellules µ max taux spécifique de croissance maximum tg n * tg ln(x ) λ temps de latence temps n cellules x * n cellules ML Delignette-Muller, ENVL 7 ML Delignette-Muller, ENVL 8 Le modèle de croissance exponentielle Hypothèses biologiques de la latence après n * tg : x = x * n = x * ( (t-t) / tg) ) = x * exp( ln() * (t-t ) / tg ) le modèle : x = x exp[ µ max (t - t ) ] avec µ max = ln()/tg Baranyi 99 Equivalences McKellar 997 mathématiques formulation différentielle: dx xdt = µ max biomasse chromosome Hills 99 Baranyi 998 ML Delignette-Muller, ENVL 9 ML Delignette-Muller, ENVL Formulation unifiée de divers modèles dx = µ max α( t) f ( x) avec x ( t = ) = x xdt Modèle de Baranyi 99 ( McKellar) α( t)= q( t) dq avec = µ +q ( t) max q et q( t = ) = q = dt exp( µ max λ) Modèle de Hills ( Baranyi 998) α( t)= µmax e µmaxλ avec dm ( ) m x x Modèle Lag-exponentiel α ( t) = ( t λ) ( t > λ) dt =µmaxm et m ( t = ) = x ln Modèles empiriques Ex.: modèle de Gompertz modifié (Gibson 988) Très couramment utilisé Basé sur aucune hypothèse biologique Ajustant correctement les données MAIS surestimant µ max Et non directement utilisable en conditions dynamiques µ ( ) ( ) maxe x = ln x + ( ) + ln xmax ln x exp exp λ t ln xmax ln x ML Delignette-Muller, ENVL ML Delignette-Muller, ENVL
log (x[ufc/ml]) Samonellae 9 8 Gibson 988 7 6 5 Ajustement de 3 modèles Gompertz (µ max =.69, λ=3.8) modèle empirique classique Baranyi 99 (µ max =.56, λ=.6) avec freinage logistique Lag-exponentiel (µ max =.55, λ=3.) avec freinage logistique Conclusions Divers modèles primaires de croissance empiriques ou basés sur des hypothèses biologiques diverses ajustant correctement les données permettant d estimer µ max et λ si les données sont suffisantes mais avec des différences entre modèles Perspectives Nouvelles méthodes de suivi de la croissance Que se passe-t-il au niveau de la cellule? 3 5 5 5 3 35 5 5 t (h) ML Delignette-Muller, ENVL. Modélisation secondaire de la croissance θ = g(t,ph, ) + ε θ : paramètres de croissance µ max et λ. Modélisation de µ max. Modélisation de λ Deux types d approches Modélisation par ajustement de surfaces de réponse prise en compte simultanée des facteurs environnementaux d intérêt plan d expériences ajustement d un modèle polynomial Approche progressive ou modulaire prise en compte des facteurs un à un puis construction d un modèle global Exemple d approche progressive ML Delignette-Muller, ENVL 6 Modèle «racine carrée» Modèle «racine carrée» valable à basses températures Ratkowsky et al., 98 augmentation linéaire de µ max avec la température µ max, h -.5.5 Escherichia coli (Barber, 98) µ max = b * (T T min ) T min : température minimale de croissance 5 5 5 3.5 T, C ML Delignette-Muller, ENVL 7 3
Tendance sur une gamme de température plus étendue Modèle CTMI (Rosso et al., 993).5 µ max, h - µ opt Escherichia coli (Barber, 98) pour T min < T <T max, µ max (T) = µ opt γ (T) (T-T max )(T-T min ) γ (T) = (T opt -T min ) [(T opt -T min )(T-T opt ) - (T opt -T max )(T opt +T min -T)].5.5 T min T opt T max bon ajustement aux données pour différentes espèces 3 5 6 T, C seulement paramètres, chacun ayant une signification biologique corrélation biologique entre les températures cardinales T max =. T opt + 3 + ε (r = 97%) et T min = T opt - 33 + ε (r = 89%) ML Delignette-Muller, ENVL.5 Ajustement du modèle CTMI Escherichia coli (Barber, 98) Effet du ph µ max, h - µ max h -.9.8.7 µ opt Listeria monocytogenes (Petran & Zottola, 989).5.6.5 ph min ph opt ph max..3.5 5 5 5 3 35 5 5 T, C.. 5 6 7 8 9 ph Modèle CTPM (Rosso et al., 995) Visualisation du modèle global Modèle ph pour ph min < ph < ph max µ max (ph) = µ opt γ(ph) avec γ(ph) = (ph-ph min )(ph-ph max ) (ph-ph min )(ph-ph max )-(ph-ph opt ) µ max, h -.8.6. Modèle global utilisant le gamma concept (Zwietering et al., 99) µ max (T,pH) = µ opt γ(t) γ(ph) bon ajustement aux données avec un modèle à 7 paramètres. 8 ph 6 3 T, C 5 ML Delignette-Muller, ENVL 3
Prise en compte d autres facteurs? Modèle a w µ max (a w ) = µ opt γ(a w ) avec γ(a w ) = (a w -a wmin )/(-a wmin ) Modèle global µ max (T,pH,a w ) = µ opt γ(t) γ(ph) γ(a w ) mais prise en compte d interactions entre facteurs parfois nécessaire Augustin et Carlier, ; Le Marc et al.,. Modélisation secondaire de la croissance θ = g(t,ph, ) + ε θ : paramètres de croissance µ max et λ. Modélisation de µ max. Modélisation de λ ML Delignette-Muller, ENVL 5 Modélisation du temps de latence Paramètre difficile à modéliser effet sur λ du passé des cellules bactériennes (notamment de la température de préincubation dans les expériences de laboratoire) approches classiques Modélisation indépendante de µ max et λ malheureusement souvent en partant de conditions de préculture suboptimales pour modéliser λ conditions irréalistes pouvant conduire à surestimer λ Modélisation de λ en fonction de µ max en supposant µ max λ constant pour un état physiologique initial donné µ max λ : «work to be done» pendant la latence ML Delignette-Muller, ENVL 7 ML Delignette-Muller, ENVL 8 µ max λ est-il constant? Uniquement en ère approximation dans les travaux publiés Travaux publiés biaisés conditions de préculture constantes et souvent suboptimales Comparaison des approches de modélisation de λ aucune des approches ne convient mieux à tous les jeux de données nécessité de développer une approche intermédiaire Exemple d effet d un changement de température sur µ max λ Listeria monocytogenes (Delignette-Muller et al., ) µ maxλ..5..5..5 inoculum en phase stationnaire inoculum en phase exponentielle Tpréculture= C Tpréculture=8 C Tpréculture=5 C Tpréculture=8 C Tpréculture=37 C 3 3 Tculture Tpréculture ( C) ML Delignette-Muller, ENVL 9 5
Conclusions Modèles disponibles et validés en prévision sur l aliment pour µ max Prévision de λ beaucoup plus difficile peu de données réalistes modèles inadaptés encore de nombreux travaux à réaliser! 3. Applications des modèles les outils prêts à l emploi, logiciel de simulation, systèmes experts,, sont parfois appelés modèles de niveau tertiaire ML Delignette-Muller, ENVL 3 Une aide pour estimer les DLC ou DLUO développer de nouveaux produits microbiologiquement stables évaluer les implications d un incident survenu au cours du procédé mettre en place une démarche HACCP évaluer l exposition dans le cadre de l évaluation des risques Exemple inspiré de «Application of predictive microbiology to estimate the number of Bacillus cereus in pasteurised milk at the point of consumption» Zwietering et al., 996 ML Delignette-Muller, ENVL 33 ML Delignette-Muller, ENVL 3 Choix des modèles et paramètres Une simulation Modèle secondaire: racine carrée = b (T T min ) données de la littérature : T min = C (psychrophiles) Phase T C temps (jours) (h - ) log x cinétique à 3 C dans du lait pasteurisé : 3 =.3 h - b = 3 / 3 =.35 usine.. Modèle primaire: exponentiel (λ=, pire cas) log x = log x + /ln() * t distributeur 7.6.7 Contamination initiale: UFC/ml (pire cas) consommateur 8 5.8 5.8 ML Delignette-Muller, ENVL 35 ML Delignette-Muller, ENVL 36 6
simulations à différentes T de conservation Effet de la température de conservation 6 log niveau critique (x[ufc/ml]) 3 5 6 7 8 9 t (jours) T ( C) 8 6 3 5 6 7 8 9 t (jours) temps (jours) donnant un niveau 5 UFC/ml 8 7 6 5 3 6 C 7 C 8 C 9 C C C C Température de conservation chez le consommateur ML Delignette-Muller, ENVL 38 Indicateurs temps température (ITT) Indicateurs physiques ou chimiques Ex.: basé sur une réaction enzymatique modélisable (modèle t-t proche de la croissance microbienne) et induisant une coloration quantifiable Indicateurs électroniques Indicateurs biologiques Exemple : application des ITT extraits de «Field evaluation of the application of time temperature integrators for monitoring fish quality in the chill chain» Giannakourou et al., 5 (Int. J. Food Microbiol.) «Application of shelf life decision system (SLDS) to marine cultured fish quality» Koutsoumanis et al., (Int. J. Food Microbiol.) ML Delignette-Muller, ENVL 39 ML Delignette-Muller, ENVL Application à la distribution de poissons pêchés en mer Validation des prédictions de croissance de la flore d altération à partir du relevé des TTI au cours de la chaîne du froid 7
Utilisation des prédictions de croissance pour séparer les lots vers marchés: A distant, B local Effet de cette stratégie (SLDS) sur la durée de vie résiduelle du produit au moment de la consommation dans les marchés: comparaison à la méthode FIFO (First In, First Out) Extrait de Koutsoumanis et al., 5 (Int. J. Food Microbiol.) Logiciels de simulation le Pathogen Modeling Program (US) http://www.arserrc.gov/mfs/pathogen.htm Growth Predictor (UK) http://www.ifr.ac.uk/safety/growthpredictor Seafood Spoilage and Safety Predictor (Danemark) http://www.dfu.min.dk/micro/sssp/home/home. aspx Autres outils Base de données Combase http://wyndmoor.arserrc.gov/combase/ Outil intégrant une base de données, un système expert et un logiciel de simulation Sym previus (France) http://www.symprevius.org/ ML Delignette-Muller, ENVL 5 ML Delignette-Muller, ENVL 6 Outils dérivés Logiciels de simulation Systèmes experts Indicateurs temps température. Utilisation des modèles dans l appréciation quantitative des risques Outils à utiliser prudemment! Averti notamment de l incertitude des prévisions Monte Carlo ML Delignette-Muller, ENVL 7 8
L appréciation quantitative des risques Quelques définitions Identification des dangers Caractérisation des dangers (loi dose-réponse) Appréciation de l exposition Caractérisation des risques Communication des risques Gestion des risques microbiologie prévisionnelle Danger (hazard) : «agent biologique, chimique ou physique présent dans un aliment, ou état de cet aliment pouvant avoir un effet nocif.» Risque (risk) : «estimation de la probabilité que se produise un effet néfaste, pondéré en fonction de sa gravité, qui pourrait résulter de la présence d un danger dans un aliment.» ML Delignette-Muller, ENVL 9 ML Delignette-Muller, ENVL 5 Etude d un cas simplifié Bacillus cereus dans du lait pasteurisé inspiré de «A risk assessment study of Bacillus cereus present in pasteurized milk «Notermans et al., 997 (Food Microbiol.) Identification des dangers Bacillus cereus : pathogène reconnu cause diagnostiquée de nombreuses infections d origine alimentaire Contaminant potentiel du lait capacité rapide de sporulation survie dans l environnement contamination par les fèces et le sol Développement possible au cours des procédés résistance des spores à la pasteurisation développement de certaines souches à basses températures ML Delignette-Muller, ENVL 5 ML Delignette-Muller, ENVL 5 Caractérisation des dangers Appréciation de l exposition Données épidémiologiques recueillies (concentrations en Bacillus cereus dans l aliment responsable de l infection) syndrome diarrhéique : 3 à 8 ufc ml - (médiane à 7 ) syndrome émétique : à ufc ml - (médiane à 7 ) Expériences réalisées sur des volontaires sains : non concluantes Seuil d acceptabilité en Europe : - 5 ufc ml - Evaluation vraiment très grossière de la loi doseréponse Niveaux de contamination observés dans des briques de lait un jour après la pasteurisation (enquête hollandaise, Notermans et al., 997) moyenne en log ufc ml - : -. écart type en log ufc ml - :. 57 avec un effet saisonnier ML Delignette-Muller, ENVL 53 ML Delignette-Muller, ENVL 5 9
Températures de conservation du produit observées dans des réfrigérateurs domestiques (enquête hollandaise, de Lezenne et al., 99) Durées de conservation du produit avant consommation observées (enquête hollandaise, Notermans et al., 997) Modélisation de la croissance microbienne Développement de la population microbienne depuis la pasteurisation jusqu à la consommation modèle de Zwietering et al., 996 (cf. exemple précédent) log N = log N + /ln() * t avec = b (T T min ) =.35 *T (h - ) =.3*T (jr - ) Caractérisation des risques Résumé des paramètres à prendre en compte : loi dose - réponse Niveau de B. cereus pathogène: N p (en ufc ml - ) exposition Niveau de B. cereus après pasteurisation: N (en ufc ml - ) Température de conservation: T (en C) Durée de conservation: d (en jours) ML Delignette-Muller, ENVL 57 ML Delignette-Muller, ENVL 58 Méthode de calcul? Estimation du risque final = probabilité de développer un syndrome émétique ou diarrhéique lors d une consommation de lait pasteurisé Estimation dans le pire des cas en fixant les paramètres aux valeurs maximisant le risque Estimation dans le cas le plus probable en fixant les paramètres aux valeurs les plus probables Calcul dans le pire des cas Niveau de B. cereus pathogène: N p = 3 ufc ml - Niveau de B. cereus après pasteurisation: N = ufc ml - Température de conservation: T = 3 C Calcul de la durée de conservation nécessaire pour atteindre N p : d p = log (N/N )*ln() / µ =.36 jrs risque de 98% d après la distribution des durées de stockage observées (TRES SURESTIME!!) ML Delignette-Muller, ENVL 59 ML Delignette-Muller, ENVL 6
Calcul dans le cas le plus probable Niveau de B. cereus pathogène: N p = 7 ufc ml - Niveau de B. cereus après pasteurisation: N =. ufc ml - Température de conservation: T = 6 C Calcul de la durée de conservation nécessaire pour atteindre N p : d p = log (N/N )*ln() / µ = 7. jrs risque nul (TRES CERTAINEMENT SOUS-ESTIME!) Cas le plus probable amélioré avec prise en compte des différentes températures de réfrigération observées dans la population: T ( C) 6 8 fréquence associée.96.6.56.6.6 d p (jrs) 38. 7. 9.6 6..3 risque associé.88.3.65 risque global =.56*.88 +.6*.3 +.6*.65 = 3.8% MAIS non prise en compte des variabilités sur N et N p ML Delignette-Muller, ENVL 6 ML Delignette-Muller, ENVL 6 Critique de l approche il est difficile de prendre en compte toutes les sources d incertitude et de variabilité une estimation unique du risque est donnée sans indication de son imprécision interprétation délicate du résultat numérique il est difficile de mettre en évidence les facteurs les plus influants Utilisation du Monte Carlo Méthode de simulation par échantillonnage permettant la prise en compte de toutes les sources de variabilité et d incertitude l évaluation de l incertitude sur le risque estimé la génération d une analyse de sensibilité du risque final à chaque paramètre ML Delignette-Muller, ENVL 63 ML Delignette-Muller, ENVL 6 distributions en fréquences des paramètres Schéma d un Monte Carlo D distribution en fréquences du risque de maladie Définition de la distribution pour un paramètre lorsque l on dispose de données observées Utilisation directe de la courbe des fréquences cumulées observées ou Ajustement d une loi théorique adaptée aux données observées N tirages aléatoires pour chaque paramètre (avec par ex. N = ) ln (proba(maladie) )
Définition de la distribution pour un paramètre lorsque l on ne dispose que d une opinion d expert lois simples mais de forme peu naturelle lois plus complexes mais de forme plus naturelle Application à notre exemple simplifié Prise en compte des sources de variabilité choix d un modèle classique pour la loi dose réponse : modèle log-normal prenant en compte une variabilité sur N p (log (N p ) ~ (µ=7; σ=.5)) (valeurs fictives) choix des distributions sur les paramètres de l exposition: utilisation des distributions observées pour T et d et d une loi lognormale décrite à partir des données observées pour N (N ~ (µ=-; σ=.6)) ML Delignette-Muller, ENVL 68 Application à notre exemple simplifié Graphe de la loi dose-réponse Prise en compte de l incertitude liée à l utilisation d un modèle de croissance microbienne risque p de maladie utilisation du modèle de Zwietering et al. (996) avec prise en compte de l incertitude sur la prédiction : µ = µ prédit (+ε) avec ε ~ (µ=-.;σ=.5) d après données observées de validation des modèles en prédiction (Delignette-Muller et al., 995) niveau de B.cereus dans le produit consommé log (N [ufcml]) ML Delignette-Muller, ENVL 69 Histogrammes des valeurs des paramètres échantillonnées (pour tirages) effectifs Distribution en fréquences du risque d effet pathogène (p) effectifs Distribution du risque p s étalant de - à avec un mode à -6 - -5 log (N ) T Marge d incertitude sur le risque non calculable : incertitude et variabilité mêlées d ε - -8-6 - - log (p)
Analyse de sensibilité du risque p aux différents paramètres: Tornado Chart Paramètres d T log (N ) ε...6.8 coefficients de corrélation de rang Critique du cas étudié Loi dose-réponse sans réel fondement biologique Scénario thermique très simpliste, sans prise en compte des variations thermiques (ex. : ruptures de la chaîne du froid) Modèle de croissance microbienne simplifié Distributions grossièrement définies Eventuelles corrélations entre paramètres non prises en compte Analyse très grossière à affiner ML Delignette-Muller, ENVL 7 Résultats sur un cas plus réaliste extraits de «Quantitative risk assessment for Escherichia coli O57:H7 in ground beef hamburgers» Cassin et al., 998 (Int. J. Food Microbiol.) ML Delignette-Muller, ENVL 75 Identification des dangers E.coli O57:H7 : pathogène reconnu cause diagnostiquée d une maladie (diarrhées hémorragiques) pouvant être sévère (atteinte rénale) voire mortelle chez les enfants et les personnes âgées Contaminant potentiel des hamburgers communément trouvé dans les intestins des bovins contamination possible des carcasses de bœuf épidémies liées à des hamburgers mal cuits aux US Appréciation de la loi dose-réponse Choix du modèle Beta-Poisson (Haas, 983) modèle exponentiel : p(n) = - exp(- r N) action indépendante des bactéries bactérie unique peut infecter l hôte, mais la probabilité de cet événement est très faible (r) modèle Beta-Poisson : p(n) = - ( + N/β) - α complexification du modèle précédent, incorporant de la variabilité sur la relation hôte-bactérie (loi Beta sur r) ML Delignette-Muller, ENVL 77 ML Delignette-Muller, ENVL 78 3
Loi dose-réponse Appréciation de l exposition de l abattoir jusqu au consommateur production élevage de l animal process and grinding fabrication de la viande hâchée storage conservation cooking cuisson consumption consommation ML Delignette-Muller, ENVL 8 Caractérisation des risques Estimation du risque au total 3 paramètres décrits par des distributions (incertitude et variabilité) divers modèles (croissance, destruction thermique, dose-réponse, ) Simulations par Monte Carlo estimation de la probabilité de maladie analyse de sensibilité du modèle global aux différents paramètres ML Delignette-Muller, ENVL 8 Analyse de sensibilité Etude de quelques scénarios de prévention Stratégies de prévention réalistes Réduction attendue du risque
Perspectives méthodologiques Critique du Monte carlo D Incertitude et Variabilité traitées sur le même plan dans les simulations Difficulté d appréciation de l incertitude sur le résultat final Solution: Modélisation à niveaux (/ variabilité, / incertitude sur variabilité) Simulations par Monte Carlo à dimensions (D) Variabilité sur le paramètre θ Incertitude sur la variabilité du paramètre θ Principe du Monte Carlo D Modélisation Loi de θ ex.: loi normale paramétrée par µ et σ Loi de µ Loi de σ Simulation θ ij Deuxième niveau de tirage aléatoire pour chaque µ i et σ i µ i, σ i Premier niveau de tirage aléatoire pour i= à ni et j= à nv ML Delignette-Muller, ENVL 85 Caractérisation de l incertitude Résultats des simulations Méthodes utilisées Approche fréquentiste bootstrap (méthode de rééchantillonnage sur les données) Approche bayésienne prise en compte simultanée d une information de type connaissance d experts et de données expérimentales ni distributions en fréquences du risque (ou niveau d exposition ) Pour consulter un exemple concrêt: Rapport AFSSA : «Evaluation scientifique des risques associés à Cryptosporidium sp.» ML Delignette-Muller, ENVL 87 ML Delignette-Muller, ENVL 88 Avantages et inconvénients du Monte Carlo D Conclusions Méthode plus lourde à mettre en œuvre Incertitude et variabilité parfois difficiles à séparer Résultats plus difficile à lire Démarche plus complète Réelle appréciation de l incertitude sur le risque final L appréciation quantitative du risque en microbiologie alimentaire : discipline jeune utilisation de simulations de type Monte Carlo avec problématiques méthodologiques en développement quelques difficultés spécifiques liées à la nature microbiologique du danger devrait constituer un outil pertinent pour mieux comprendre l origine du risque microbiologique ML Delignette-Muller, ENVL 89 ML Delignette-Muller, ENVL 9 5
Quelques références McMeekin, T.A., Olley, J.N., Ratkowsky, D.A., Ross, T.,. Predictive microbiology: towards the interface and beyond. Int. J. Food Microbiol. 73, 395-7. Roberts, T.A., 995. Microbial growth and survival: developments in predictive modelling. Int. Biodeter. Biodegr., 97-39. Rosso, L., Lobry, J.R., Flandrois, J.P., 993. An unexpected correlation between cardinal temperatures of microbial growth highlighted by a new model. J. Theor. Biol. 6, 7-63. Swinnen, I.A., Bernaerts, K., Dens, E.J., Geeraerd, A.H., Van Impe, J.F.,. Predictive modelling of the microbial lag phase: a review. Int J Food Microbiol. 9, 37-59. van Gerwen, S.J.C., Zwietering, M.H., 998. Growth and inactivation models to be used in quantitative risk assessments. J. Food Protect. 998, 5-59. Whiting, R.C., 995. Microbial modeling in Foods. Critical. Reviews. Food. Sci. Nutrition. 35, 67-9. Wijtzes, T., van't Riet, K., Huis in't Veld, J.H.J., Zwietering, M.H., 998. A decision support system for the prediction of microbial food safety and food quality. Int. J. Food Microbiol., 79-9. ML Delignette-Muller, ENVL 9 6