PLEX-ID, une nouvelle approche pour une identification microbienne rapide Pr Jacques Izopet Laboratoire de Virologie CHU de Toulouse & INSERM U1043 41 ème Colloque National des 41 ème Colloque National des Biologistes des Hôpitaux, Toulouse, 25/09/2012
Avancées technologiques en Infectiologie Evolution des stratégies diagnostiques Approche syndromique Personnalisation Résultats attendus dans le temps du soin plateaux techniques + logistique tests unitaires délocalisés Concepts de base Concepts de base Miniaturisation Automatisation Parallélisation multiplexage
Pôle de biologie CHU de Toulouse Purpan Rangueil Langlade g
Objectifs Simplifier les organisations Accréditation Mutualiser les équipements Réduire les coûts de production Favoriser l innovation, la recherche et les activités pédagogiques
Structuration en 5 plateaux techniques Purpan Rangueil Langlade PT Automatisé PT Spécialisé PT Infectiologie PT Automatisé PT Oncologie CPTP I2MC CRCT Centres de recherche INSERM/CNRS/INRA
Le plateau technique d infectiologie Regroupement de 3 services Bactériologie-Hygiène Virologie Parasitologie-Mycologie 3 plateformes Sérologie Biologie moléculaire Morphologie & culture
IFB - CHU de Toulouse
Innovations en infectiologie Test de tropisme HIV : TTT 2007 Séquençage haut débit Spectrométrie de masse 2010 2011
Spectrométrie de masse Détermination du poids des molécules Détecteur Echantillon ionisé Temps de vol Champ électrique Analyse des données
Spectrométrie de masse en microbiologie MALDI-TOF MS PCR + ESI TOF MS Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Electro Spray Ionization Protéines Acides nucléiques Acides nucléiques Produits de clivages ARN obtenus après PCR et transcription Amplicons ADN Identification de bactéries et champignons après isolement en culture Identification par MLST Multi Locus Sequence Typing Détection directe dans les échantillons biologiques et identification de bactéries, champignons et virus
11 Processus PLEX-ID
PCR ESI TOF MS Etape 1 Amplification par PCR Amorces large spectre
Amorces influenza PB1 Human and swine H1N1, H1N1 H2N2, H3N2 Canine, equine H3N8 Human, avian i H5N1 6 nucleotide deletion Influenza B and C Other avian, swine
PCR ESI TOF MS Etape 2 Etape 3 Etape 4 Mass detection Signal processing Signal processing masses to base compositions
Workflow Echantillons : Sang, LCR, sécrétions respiratoires, urine, biopsies tissulaires,... Eau, aliments, échantillons de l environnement Echantillon Extraction acides nucléiques Décalage Analyse de la masse des amplicons 1. Conversion de la masse en composition de base 2. Identification avec la base de données PCR 6-8 h (DNA/RNA) de l échantillon du résultat
Extraction : PLEX-ID SP Extraction automatisée fondée sur des billes magnétiques 1 heure / 96 échantillons
Pipetage : PLEX-ID FH Automatisation : échantillon et billes magnétiques plaques d extraction ARN extrait plaques PCR
Thermocycleurs : PLEX-ID TC PCR dans des plaques 96 puits
Instrument PLEX-ID Injection échantillon Collecteur de plaques & dessalage Tampons Unité dessalage Pompe Compression àvide Spectomètre de masse Plaque 96 puits (48 min) Réactifs embarqués (15plaquesen12h) en 12 300 échantillons/jour Connection Abbott Link Base de données mise à jour régulièrement
Panels adaptés à une approche syndromique et/ou épidémiologique Infections respiratoires (B, V) Infections entériques (B, V, P) Infections de l immunodéprimé (V) Infections du système nerveux central (V) Infections transmises par des vecteurs (B, V, P) Champignons Bacteria Bactéries Virus Protozoaires Génotypage Facteur de virulence Marqueurs de résistance
Système Plex-ID Flu Détection Influenza A, B & C Identification du sous-type Influenza A
Système Plex-ID Flu Détection Influenza A, B et C & génotypage Influenza A 9 paires d amorces réparties dans 8 puits couvrant tous les segments génomiques 9800 souches dans la base de données détection des souches connues & inconnues
Système Plex-ID Flu Influenza A
Système Plex-ID Flu Influenza B
Système Plex-ID Flu Influenza C
Etude comparative Echantillons respiratoires collectés au cours de la saison hivernale Enfants / Adultes PLEX-ID Flu vs RespiFinder & PCR temps réel
Respifinder & PCR temps réel Respifinder kit PathoFinder : PCR multiplex détectant et différenciant 15 virus dont Influenza A et B Influenza A/H1N1 Detection kit Roche : PCR temps réel détectant Influenza A (M2) & H1N1 pdm 2009 (HA)
Système Plex-ID Flu vs RespiFinder RESPIFINDER Flu A Flu B Négatif Total Flu A 65 0 5** 70 Flu B 0 18 2 20 PLEX-ID Négatif 10 2 188 200 Echec* 0 0 3 3 Total 75 20 198 293 * : échec > 2 points pour 1 échantillon ** : 3 H1N1 2009 / 1 H1N1 seasonal / 1 H3N2
Système Plex-ID Flu vs RespiFinder Flu A RESPIFINDER Flu B Négatif Total PLEX-ID Flu A 65 0 5 70 Flu B 0 18 2 20 Négatif Echec* 10 2 188 200 0 0 3 3 Total 75 20 198 293 Concordance = 93 8% Concordance = 93,8 % Sensibilité = 87,4 %
Plex-ID Flu vs Influenza A/H1N1 PCR temps réel A H1/pdm2009 A H1/pdm2009 55 A non H1 0 Total 55 PLEX-ID A H3 Négatif 0 1 6 2 6 3 Echec 0 0 0 Total 56 8 64
Plex-ID Flu vs Influenza A/H1N1 PCR temps réel A H1/pdm2009 A non H1 Total PLEX-ID A H1/pdm2009 A H3 55 0 55 0 6 6 Négatif 1 2 3 Echec 0 0 0 Total 56 8 64 Sensibilité = 95,3 %
Développements attendus Analyse de la résistance avec des amorces adaptées ciblant NA Enrichissement de la base de données
Infection virale cardiaque humaine et résultats cliniques Virus Infection virale Susceptibilité cardiotropes cardiaque génétique Myocardite aiguë 5-10/Million/an / Guérison clinique 10-20% Myocardite chronique 9% 12-42% Cardiomyopathie dilatée prevalence: 7 /100 000 20% Mort subite 80% Transplantation cardiaque Andreoletti et al. ACDV 2009
Causes virales de cardiomyopathies dilatées Différents virus pourraient jouer un rôle dans la pathogénèse des cardiomyopathies dilatées Kuhl et al. Circulation 2005 Andreoletti et al. ACDV 2009
Détection virale dans le tissu cardiaque PLEX-ID vs RT PCR Enterovirus PCR/ESI TOF-MS + PCR/ESI TOF-MS - PVB19 PCR/ESI TOF-MS + PCR/ESI TOF-MS - HHV6 PCR/ESI TOF-MS + PCR/ESI TOF-MS - RT-qPCR + 12 4 13 2 0 2 RT-qPCR - 4 48 8 45 0 66 To otal number of positive ca ses 8 7 6 5 4 3 2 1 0 17.6% 17.6% 20.6% 11.8% * 23.5% 2.9% EV PVB19 EV + PVB19 EV + HHV6 Real time Q-PCR assay PCR/ESI TOF-MS EV, PVB19 and EV+PVB19 semblent être les principales infections virales impliquées dans le développement de cardiomyopathies dilatées chez l adulte Andreoletti ECCMID 12
Charges virales dans le tissu cardiaque PLEX-ID vs RT PCR Gen nome copies/µg of total RNA 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 Positive EV Samples P=0.26 PCR/ESI TOF-MSRT-qPCR ome copies/µg of total RNA Gen 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 Positive PVB19 Samples P=0.56 PCR/ESI TOF-MSRT-qPCR EV positive samples by PCR/ESI-TOF MS and RT-qPCR PVB19 positive samples by PCR/ESI-TOF MS and RT-qPCR Andreoletti ECCMID 12
Viral IC : Virus de l'immunodéprimé Adenovirus Human Adenovirus* (2-54, A-F) Enterovirus* Human Coxsackievirus Human Echovirus Human Enterovirus Human Rhinovirus Herpesvirus Human Erythrovirus V9 Parvovirus Human Erythrovirus VX Cytomegalovirus (CMV, HHV-5*) Human Parvovirus B19* Epstein-Barr-Virus (EBV, HHV-4*) Herpes-Simplex-Virus-1 1(HSV1 (HSV-1, HHV-1*) Herpes-Simplex-Virus-2 (HSV-2, HHV-2*) Varicella-Zoster-Virus (VZV, HHV-3*) Kaposi-Sarcoma-Associated-Herpesvirus i i (KSHV, HHV-8*) HHV-6 A et B Polyomavirus BK-Virus* JC-Virus*
HEV : alimentation & environnement Pig liver sausage sample Market* HEV RNA HEV RNA concentration (copies/g) 1 2 3 4 5 6 7 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 Negative Negative Negative Positive Positive Positive Negative - - - 4,100 175 240 - Mansuy EID 2011
Identification bactérienne par amplification d une région génomique variable Les amorces de PCR ciblent des régions conservées des génomes bactériens. Région Hautement Variable Région informative spécifique de chaque bactérie La signature moléculaire du produit PCR permet l identification bactérienne
Panel Bactéries / Candida
Panel Bactéries responsables d intoxications i ti alimentaires i
Identification des STEC 0157:H7 & non 0157
Synthèse Le système PLEX-ID offre une nouvelle approche de diagnostic moléculaire multiplex : virus, bactéries & champignons Analyse directe sur échantillons sans culture ou séquençage Identification possible de nouvelles souches ou espèces émergentes Amélioration de l instrumentation attendue dans les 2 prochaines années
Remerciements Laboratoire de Virologie Institut Fédératif de Biologie CHU de Toulouse I. Dasilva C. Mengelle JM. Mansuy Abbott D. Favy M. Picard-Maureau JB. Smith P. Leroux M. de Graff