VI- Expression du génome

VI- Expression du génome

VI-1.- EXPRESSION DU GÉNOME- PRINCIPES GÉNÉRAUX

DOGME CENTRAL Les gènes et l information génétique sont conservés sous forme d acides nucléiques La perpétuation à l identique de l information génétique est assurée par la réplication Les gènes exercent leurs fonctions sous la forme de protéines. Le message qu ils contiennent doit donc être traduit en protéines : expression des gènes

EXPRESSION DE L INFORMATION GÉNÉTIQUE Processus en deux phases : 1. La transcription è ARN simple brin de séquence identique à l un des brins d ADN. Plusieurs types d ARN ARN messager ou ARNm ARN de transfert ou ARNt ARN ribosomal ou ARNr

EXPRESSION DE L INFORMATION (2) Processus en deux phases : La transcription Seul un des brins d ADN est transcrit en ARNm Brin matrice ou brin anti-sens : dirige la synthèse de l ARN par appariement de bases complémentaires Brin sens ou brin codant : même séquence que l ARNm (U remplace la T)

EXPRESSION DE L INFORMATION (3) Processus en deux phases : 2. La traduction è conversion séquence nucléotidique de l ARN en une chaîne d acides aminés qui constituent un peptide puis une protéine fonctionnelle L ARNm est traduit ARNt et ARNr font partie de la machinerie de synthèse protéique

EXPRESSION DE L INFORMATION (4) C est la région codante de l ARNm qui est traduite ; dans cette région chaque triplet de nucléotides (codon) correspond à un acide aminé.

EXPRESSION DE L INFORMATION (5) Chez les eucaryotes, le produit de la transcription (transcrit primaire) n est pas directement traduit il subit une série de modifications appelée maturation qui est constituée d une série d ajouts et d excisions. Puis migre dans le cytoplasme où il est traduit

EXPRESSION DE L INFORMATION (6) Nécessité d une correspondance entre séquence nucléotidique et séquence d acides aminés (entre l ADN et la protéine) : code génétique Procaryotes : transcription et traduction ont lieu dans le même compartiment et sont synchrones; Eucaryotes : transcription dans le noyau, traduction dans le cytoplasme

EXPRESSION DE L INFORMATION (7) L expression de l information est unidirectionnelle dans la quasitotalité des cas ADN ARN Protéines Irréversible

EXPRESSION DE L INFORMATION (8) L expression de l information est unidirectionnelle : exception chez les rétrovirus ADN Transcription inverse ARN génomique simple brin ARNm Protéines

VI-2.- EXPRESSION DU GÉNOME TRANSCRIPTION CHEZ LES PROCARYOTES (E. COLI)

VI-2.- EXPRESSION DU GÉNOME TRANSCRIPTION CHEZ LES PROCARYOTES (E. COLI) A- LES PRINCIPAUX ACTEURS

A) L ARN POLYMÉRASE Plusieurs milliers de copies par cellule L enzyme complète ou holoenzyme est constituée de plusieurs sous-unités : α 2 ββ σ sous-unités β et β : centre catalytique de l enzyme, sont impliquées dans toutes les étapes de la transcription

A) L ARN POLYMÉRASE (2) sous-unité α : assemblage du noyau de l enzyme, aucun rôle connu dans le mécanisme de la transcription rôle dans la reconnaissance du promoteur et dans l interaction de l ARN polymérase et de certains facteurs de régulation.

A) L ARN POLYMÉRASE (3) sous-unité σ : impliquée spécifiquement dans la reconnaissance des promoteurs,

A) L ARN POLYMÉRASE (4) noyau de l'enzyme : oligomère α 2 ββ capable de synthétiser de l ARN à partir d une matrice ADN mais ne peut initier la transcription au niveau des sites corrects, Peut se fixer à n importe quel ADN quelque soit sa séquence (attraction électrostatique)

A) L ARN POLYMÉRASE (5) le facteur σ : qui se lie spécifiquement au promoteur.

B) L ADN MATRICE Brin antisens Gène non morcelé On y distingue différentes séquences : séquences codantes et non codantes, point de départ, séquences de terminaison de la transcription

C) LES RÉGIONS PROMOTRICES OU PROMOTEUR Séquences d ADN nécessaires à la fixation de l ARN polymérase sur la matrice et à l exécution de la réaction d initiation

C) LES RÉGIONS PROMOTRICES OU PROMOTEUR (2) La séquence du promoteur est très importante Des études de comparaison de séquences de différents promoteurs ont été réalisées afin d identifier leurs caractéristiques nécessaires à leur reconnaissance par l ARN polymérase

C) LES RÉGIONS PROMOTRICES OU PROMOTEUR (3) Ces études ont retrouvé des séquences : variant peu d un promoteur à l autre présentes dans pratiquement tous les promoteurs Ces séquences sont dites conservées (faibles variations) A partir de ces études, des séquences consensus (séquences types) ont été retenues

C) LES RÉGIONS PROMOTRICES OU PROMOTEUR (4) Séquence consensus (appelées aussi boîte) : succession de bases pour laquelle l homologie est maximale pour différents promoteurs (pour chaque position, c est la base la plus fréquemment retrouvée qui a été retenue)

C) LES RÉGIONS PROMOTRICES OU PROMOTEUR (5) Il y a quatre séquences conservées chez E. coli : Le point de départ La séquence située en -10 La séquence 35 La distance entre les séquences 10 et -35

C) LES RÉGIONS PROMOTRICES OU PROMOTEUR (5) Le point de départ En général une purine On lui attribue la valeur +1 Avant le point de départ : séquences dites en amont (positionnement représenté par un nombre négatif) Après le point de départ : séquences en aval (nombre positif)

C) LES RÉGIONS PROMOTRICES OU PROMOTEUR (6) La séquence 10 : la séquence consensus ou boîte TATAAT ou TATAAT box Juste en amont du point de départ (environ 10 pb en amont) Région de 6 pb Présente dans la plupart des promoteurs

C) LES RÉGIONS PROMOTRICES OU PROMOTEUR (7) La séquence 35 : 35 pb en amont du point de départ Région de 6 pb Séquence consensus : TTGACA

C) LES RÉGIONS PROMOTRICES OU PROMOTEUR (8) La distance entre les sites 35 et -10 Varie de 16 à 19 pb Sa séquence n a aucun rôle mais sa longueur est primordiale

C) LES RÉGIONS PROMOTRICES OU PROMOTEUR (9) La distance entre les sites 35 et -10 Longueur permet de maintenir une distance appropriée entre région 10 et région 35 pour se conformer à la géométrie de l ARN polymérase

PROMOTEUR TYPE DES PROCARYOTES Point de départ - 35 Boîte TTGACA - 10 16 à 19 pb Boîte 5 à 9 pb TATAAT +1

VI-2.- EXPRESSION DU GÉNOME TRANSCRIPTION CHEZ LES PROCARYOTES (E. COLI) B- LES PRINCIPALES ÉTAPES

PRINCIPE DE LA TRANSCRIPTION La première paire de bases transcrite en ARN est le point de départ de la transcription. A partir de ce point, l ARN polymérase se déplace le long de la matrice en synthétisant l ARN jusqu à ce qu elle atteigne une séquence de terminaison (un terminateur).

PRINCIPE DE LA TRANSCRIPTION (2) Cette activité définit une unité de transcription (ADN) qui s étend du promoteur au terminateur. Une unité de transcription peut contenir plusieurs gènes.

PRINCIPE DE LA TRANSCRIPTION (3) Les séquences sont conventionnellement écrites de sorte que la transcription se déroule de gauche à droite. Ceci revient à écrire l ARNm dans le sens habituel 5 3.

LES DIFFÉRENTES ÉTAPES 1. La reconnaissance de la matrice et la formation de la bulle de transcription 2. L initiation 3. L élongation 4. La terminaison

A) LA RECONNAISSANCE DE LA MATRICE Débute par la liaison de l ARN polymérase sur un promoteur de l ADN double brin Puis séparation provisoire des brins d ADN è appariement du brin matrice avec les ribonucléotides

A) LA RECONNAISSANCE DE LA MATRICE (2) Création de la bulle de transcription par un déroulement local qui commence au niveau du site de liaison de l ARN polymérase sur le promoteur

B) L INITIATION L initiation représente la formation des premières liaisons nucléotidiques dans l ARN. L enzyme reste fixée au promoteur pendant la synthèse des 9 premières liaisons nucléotidiques environ.

B) L INITIATION (2) La phase d initiation s arrête lorsque l enzyme arrive à synthétiser une chaîne de plus de 9 bases et se détache du promoteur..

C) L ÉLONGATION L enzyme se déplace le long de l ADN et allonge la chaîne d ARN en croissance. En se déplaçant, l enzyme déroule l hélice d ADN pour exposer une nouvelle partie de la matrice dans un état simple-brin.

C) L ÉLONGATION (2) Les nucléotides sont ajoutés par des liaisons covalentes à l extrémité 3 de la chaîne naissante, formant un hybride ADN-ARN dans la région déroulée.

C) L ÉLONGATION (3) A l arrière de cette région déroulée, le brin matrice d ADN se ré-apparie avec son partenaire d origine pour reformer la double hélice

C) L ÉLONGATION (4) L ARN sort de l enzyme sous forme simple brin. Lors de l élongation, la bulle de transcription se déplace grâce à une perturbation de la structure d ADN, dans laquelle le brin matrice de la région transitoirement déroulée est appariée avec l ARN naissant au niveau du point d élongation.

D) LA TERMINAISON La terminaison est la reconnaissance de la région à partir de laquelle aucune base supplémentaire ne doit être ajoutée à la chaîne d ARN. Pour que la transcription se termine, la formation de liaisons phosphodiesters doit cesser et le complexe de transcription doit se détacher.

D) LA TERMINAISON (2) Lorsque la dernière base est ajoutée à la chaîne d ARN, la bulle de transcription se décroche en même temps que l ADN-ARN se sépare, le duplex d ADN se reforme puis l enzyme et l ARN sont tous deux libérés.

D) LA TERMINAISON (3) Les séquences d ADN nécessaires au déclenchement de ces réactions constituent des terminateurs.

D) LA TERMINAISON (4) La terminaison dépend de séquences d ADN donc également de celles de l ARN synthétisé. Elle est soumise à un contrôle spécifique.

VI-2.- EXPRESSION DU GÉNOME TRANSCRIPTION CHEZ LES PROCARYOTES (E. COLI) C- LES TERMINATEURS

2 types de terminateurs : Terminateurs intrinsèques : ces séquences sont suffisantes par elle mêmes pour mettre un terme à la transcription Terminateurs extrinsèques ont besoin d un facteur auxiliaire pour achever la transcription

A) TERMINATEURS INTRINSÈQUES ne nécessitent aucun facteur auxiliaire. ces séquences terminatrices se traduisent au niveau de l extrémité de l ARN par la présence d une structure en épingle à cheveux suivie d une succession de 6 résidus U : l épingle à cheveux et la séquence poly-u sont généralement séparés de 7 à 9 b.

TERMINATEURS INTRINSÈQUES (2) La structure en épingle à cheveux de l ARN est formée par l appariement de séquences répétées inversées (qui forment la tige) séparées par une courte séquence (qui forme la boucle). Longueur variable de la boucle. L épingle à cheveux ralentit la polymérase voire entraîne son arrêt. De plus, la formation des liaisons intra-chaines à l origine de l épingle à cheveux entre en compétition avec la formation de liaisons hydrogène entre l ADN et l ARN et donc déstabilise l hybride ADN-ARN

TERMINATEURS INTRINSÈQUES (3) La séquence poly-u entraîne la dissociation de l enzyme de la matrice pendant qu elle est arrêtée par l épingle à cheveux. La séquence poly-u de l ARN correspond à des séquences riches en A-T dans l ADN.

Séquences de 2 terminateurs intrinsèques

B) TERMINATEURS EXTRINSÈQUES Des terminateurs rho-dépendants qui nécessitent la présence du facteur rho. Rho est une protéine complexe Pas de séquences consensus clairement définies : grande diversité mais caractéristiques communes

B) TERMINATEURS EXTRINSÈQUES composés de deux éléments distincts répartis dans une séquence ADN de 150 à 200 pb environ (Lau et al., 1983; Richardson, 1990; Zalatan et al., 1993) Une séquence essentielle nommée rut (pour "Rho utilization") et située en amont du site de terminaison. Le site de terminaison proprement dit, où intervient le relargage du transcrit, aussi appelé tsp (pour "transcription stop point").

B) TERMINATEURS EXTRINSÈQUES La séquence rut La séquence rut de l ADN code pour le site d'entrée de Rho sur l'arn. Rho possède une forte affinité pour certains transcrits ARN Elle a 50 à 90 pb de long et, dans l ARN, est riche en résidus C (41%) et pauvre en G (14%). Les séquences terminatrices sont moins bien définies que les séquences rut.

TERMINATEURS EXTRINSÈQUES (2) Rho se fixe à l ARN et se déplace le long de l ARN «aux trousses» de l enzyme. Quand l ARN polymérase ralentit au niveau du site de terminaison, rho la rattrape Rho déroule l hybride ADN ARN dans la bulle de transcription è terminaison : ARN polymérase, rho et ARN sont libérés.

VI-2.- EXPRESSION DU GÉNOME TRANSCRIPTION CHEZ LES PROCARYOTES (E. COLI) D- LE CONTENU DE L ARNM

LE CONTENU DE L ARNM 2 types d ARNm Les ARN monocistroniques : = ARNm représentant un seul gène ARN polycistroniques La plupart des ARNs portent des séquences qui codent pour plusieurs protéines. Dans ce cas un seul ARNm est transcrit à partir d un groupe de gènes adjacents (impliqués souvent dans la même voie métabolique).

LE CONTENU DE L ARNM (2) Tous les ARNm contiennent deux types de régions Régions codantes Régions non codantes

LE CONTENU DE L ARNM (3) ARN monocistronique : une région codante constituée d une succession de codons représentant la séquence d acides aminés de la protéine qui débute en général par AUG et s achève par un codon de terminaison. Des régions supplémentaires non codantes. A l extrémité 5 se situe la tête qui précède le début de la région codante. La queue suit le codon de terminaison

LE CONTENU DE L ARNM (4) ARN polycistronique : Des régions intercistroniques entre les régions codantes ont des tailles très variables (1 ou 2 nt à 30 nt entre codon de terminaison de l un et codon initiateur de l autre). Possibilité de chevauchement de gènes : dernière base d une région codante = première base de la région codante suivante. nt = nucléotide

ARN monocistronique 5 3 Tête Région codante Queue ARN polycistronique 5 3 Tête Région codante 1 RIC Région codante 2 RIC Région codante 3 Queue RIC : Région intercistronique

VI-2.- EXPRESSION DU GÉNOME TRANSCRIPTION CHEZ LES PROCARYOTES (E. COLI) E- LE CYCLE DE L ARNM

LE CYCLE DE L ARNM Chez les procaryotes, les ribosomes se fixent à l ARNm avant la fin de la transcription. L ARNm bactérien est instable et n est traduit en protéines que pendant une courte durée de quelques minutes. Il est dégradée dans le sens 5-3 donc au fur à mesure qu il est traduit en protéine.

VI-2.- EXPRESSION DU GÉNOME TRANSCRIPTION CHEZ LES PROCARYOTES (E. COLI) F- LA RÉGULATION DE LA TRANSCRIPTION

La régulation de l initiation de la transcription est le niveau principal de régulation de l expression des gènes

JACOB ET MONOD (1961) La transcription est régulée par : des séquences agissant en cis : N importe quelle séquence d ADN qui agit en tant que séquence (n utilise pas d intermédiaire protéique) Qui ne touche que l ADN auquel elle est physiquement liée (ne peut réguler que les séquences qui lui sont contiguës) Exemple : le promoteur

JACOB ET MONOD (1961) La transcription est aussi régulée par : des facteurs agissant en trans : molécules synthétisées par un gène qui diffusent hors de leur lieu de synthèse pour aller agir sur un gène cible. Ces facteurs (protéine le plus souvent, parfois ARN) agissant en trans sont le produit d un gène régulateur.

GÈNE DE STRUCTURE Gène qui code pour : Des protéines structurales Des protéines à activité catalytique

GÈNE RÉGULATEUR Gène qui code pour une protéine impliquée dans la régulation d autres gènes Les protéines régulatrices de la transcription la contrôlent en se fixant à un ou plusieurs sites spécifiques de l ADN, en général situé juste en amont du gène cible

Les gènes bactériens qui codent pour des protéines apparentées (ex : enzymes participant aux différentes réactions d une même voie catabolique) sont transcrits en un ARNm polycistronique à partir d un seul promoteur. Le contrôle de ce promoteur régule l expression de la voie métabolique entière.

L unité de régulation qui contient les gènes structuraux et les éléments agissant en cis est appelée opéron.

L initiation de la transcription est régulée par des interactions qui se produisent au voisinage du promoteur. L initiation de la transcription par l ARN polymérase au niveau du promoteur est rendue possible ou impossible par d autres protéines.

Des gènes qui sont actifs sauf si des facteurs empêchent leur expression sont dits sous contrôle négatif. Des gènes qui ne sont transcrits que s ils sont spécifiquement activés sont dits sous contrôle positif (prédominant chez les eucaryotes).

Une protéine répresseur empêche à l ARN polymérase de se fixer au promoteur ou d activer la transcription.

Le répresseur se fixe sur une séquence cible, l opérateur, qui se trouve en général autour ou en amont du point de départ. La fixation d un répresseur sur son opérateur est régulée par une petite molécule : l inducteur empêche au répresseur de se fixer, le co-répresseur l active et lui permet cette fixation.

Certains promoteurs ne peuvent être reconnus par l ARN polymérase que si une protéine activatrice est présente. Les protéines activatrices peuvent également être régulées par de petites molécules.

EXEMPLE DE RÉGULATION CHEZ LES PROCARYOTES : L OPÉRON LACTOSE 3 gènes structuraux : lacz, lacy, laca Codent pour des protéines permettant de capter et de métaboliser des β-galactosides comme le lactose

EXEMPLE DE RÉGULATION CHEZ LES PROCARYOTES : L OPÉRON LACTOSE (2) lacz è β-galactosidase : coupe un β-galactoside et libère les sucres qui la composent lacy è β-galactoside perméase : transporte les β-galactosides dans la cellule laca è β-galactoside transacétylase : transfert d un résidu acétyl sur les β-galactosides

EXEMPLE DE RÉGULATION CHEZ LES PROCARYOTES : L OPÉRON LACTOSE (3) laczya : transcription contrôlée par une protéine régulatrice synthétisée à partir du gène laci laci peut se trouver à proximité des gènes de structure mais constitue une unité de transcription indépendante (transrégulateur)

EXEMPLE DE RÉGULATION CHEZ LES PROCARYOTES : L OPÉRON LACTOSE (3) laczya : régulation négative (transcrits sauf si protéine régulatrice) Produit de laci =répresseur lac Agit en se fixant sur opérateur Olac situé au début du groupe laczya

EXEMPLE DE RÉGULATION CHEZ LES PROCARYOTES : L OPÉRON LACTOSE (4) Opérateur Olac situé entre le promoteur (P lac ) et les gènes structuraux Fixation du répresseur sur Olac è blocage initiation de la transcription

EXEMPLE DE RÉGULATION CHEZ LES PROCARYOTES : L OPÉRON LACTOSE (5) Les bactéries évitent de synthétiser les enzymes d une voie métabolique en l absence des substrats adéquats Elles doivent être prêtes à tout moment à produire les enzymes si le substrat réapparaît

EXEMPLE DE RÉGULATION CHEZ LES PROCARYOTES : L OPÉRON LACTOSE (6) La voie du lactose fonctionne par induction Inducteur : β-galactoside Empêche au répresseur de se fixer sur Olac (l inactive) è production de la β-galactosidase (lacz) è métabolisme des β-galactosides Bactéries dans milieu sans β-galactoside: répresseur actif sur opérateur

EXEMPLE DE RÉGULATION CHEZ LES PROCARYOTES : L OPÉRON LACTOSE (7) Sur le répresseur 1 site de fixation à l ADN 1 site de fixation à l inducteur

VI-3.- EXPRESSION DU GÉNOME TRANSCRIPTION CHEZ LES EUCARYOTES

VI-3.- EXPRESSION DU GÉNOME TRANSCRIPTION CHEZ LES EUCARYOTES A- LES PRINCIPAUX ACTEURS

A) LES ARN POLYMÉRASES Trois ARN polymérases différentes : - ARN polymérase I qui transcrit l ARNr dont l activité est prédominante - ARN polymérase II qui transcrit l ARNm : elle transcrit les gènes structuraux et synthétise des produits très divers. - - ARN polymérase III qui transcrit l ARNt et d autres petits ARNs

A) LES ARN POLYMÉRASES (2) Les trois enzymes ont des structures similaires avec deux grandes sous-unités et de nombreuses petites sous-unités (8 à 14 sous-unités); elles ont quelques sous-unités communes.

A) LES ARN POLYMÉRASES (3) Aucune d elles ne reconnaît directement le promoteur comme c est le cas chez les procaryotes.

A) LES ARN POLYMÉRASES (4) Ce sont les facteurs de transcription qui reconnaissent les séquences caractéristiques d un promoteur particulier. De plus, ils servent à leur tour à fixer l ARN polymérase et à la positionner correctement au niveau du point de départ.

B) LES PROMOTEURS Les ARN polymérase I et III reconnaissent chacune un groupe de promoteurs relativement restreints et sont assistées par un petit nombre de facteurs auxiliaires..

B ) LE PROMOTEUR DE L ARN POLYMÉRASE II Pour l ARN polymérase II, les éléments de séquence reconnus par les facteurs de transcription sont situés en amont du point de départ. Ces sites agissent en cis et sont généralement dispersés dans une région qui comporte 200 pb. Ce sont la séquence et la distance entre ces différents éléments qui sont importantes..

LES SÉQUENCES PROMOTRICES DE L ARN POLYMÉRASES II Initiateur ou Inr : Py 2 CApy 5 entre les positions 3 et +6 (la première base de l ARNm est toujours un A)

LES SÉQUENCES PROMOTRICES DE L ARN POLYMÉRASES II TATA box : -25 en amont. Chez tous les eucaryotes. : séquence de 8 pb formée exclusivement de paires de bases A-T. Entourée des régions riches en paires G-C. Elle est proche de la séquence 10 des promoteurs bactériens.

LES SÉQUENCES PROMOTRICES DE L ARN POLYMÉRASES II (2) TATA box : -25 en amont. sur ce site, se fixe la protéine TBP (protéine de liaison à la TATA box = TATA binding protein). Le TBP est nécessaire à l initiation par les trois ARN polymérases. Tous les promoteurs n ont pas une TATA box.

LES SÉQUENCES PROMOTRICES DE L ARN POLYMÉRASES II (2) Inr et TATA box sont responsables de la sélection du point de départ exact des promoteurs de l ARN polymérase II.

LES SÉQUENCES PROMOTRICES DE L ARN POLYMÉRASES II (3) L efficacité et la spécificité avec lesquelles un promoteur est reconnu dépendent de courtes séquences situées plus en amont (environ 100 pb en amont du point de départ): la CAAT box en 75 è efficacité du promoteur la GC box en 90 contient la séquence GGGCGG

LES SÉQUENCES PROMOTRICES DE L ARN POLYMÉRASES II (4) Ces différentes boîtes diffèrent dans chaque promoteur par leur positionnement, leur nombre, leur orientation.

C) LES FACTEURS DE TRANSCRIPTION Ce sont des protéines Certains de ces facteurs sont courants, d autres sont spécifiques. On les regroupe en 3 catégories

C) LES FACTEURS DE TRANSCRIPTION (2) Facteurs généraux (TFIIX) nécessaires à l initiation de la synthèse d ARN au niveau de tous les promoteurs è appareil de transcription élémentaire

C) LES FACTEURS DE TRANSCRIPTION (3) Facteurs en amont : protéines dont l expression n est pas régulée. Augmentent l efficacité de l initiation è niveau convenable de fonctionnement du promoteur.

C) LES FACTEURS DE TRANSCRIPTION (4) Facteurs inductibles ont un rôle régulateur. Sont synthétisés ou activés à des moments spécifiques ou dans des tissus particuliers. Se fixent sur des éléments de réponse ou RE.

C) LES FACTEURS DE TRANSCRIPTION (5) Contrairement aux procaryotes, l initiation de la transcription chez les eucaryotes nécessite la fixation d un grand nombre de facteurs qui se fixent à différentes séquences agissant en cis.

Le promoteur est défini comme la région contenant tous ces sites de liaison et capable d assurer à la transcription son efficacité normale et un contrôle adéquat.

L ARN polymérase ne se lie pas à ces sites, elle se fixe à proximité du point de départ. En général, mode de régulation positif.

Une unité de transcription eucaryote contient généralement un gène et la terminaison a lieu après la fin de la région codante. Le mode de terminaison de l ARN polymérase II n est pas clair. Les ARN polymérases I et III terminent la transcription au niveau de séquences précises par des réactions bien définies

D) AUTRES SÉQUENCES AGISSANT EN CIS Les promoteurs peuvent être stimulés par des enhancers (séquences activatrices) qui sont des séquences qui sont définies par le fait qu elles :

AUTRES SÉQUENCES AGISSANT EN CIS augmentent considérablement le taux de transcription du gène auquel elles sont associées ; leur effet est indépendant de leur orientation dans le gène, de leur position ou de leur distance : elles peuvent être localisées en 5, en 3, dans un intron ou dans une région non traduite du génome ou du gène ;

D) AUTRES SÉQUENCES AGISSANT EN CIS (3) Elles gardent leur caractère activateur lorsqu on les déplace, leur effet étant maximal à un point donné En général, S étendent sur 200 pb Sous une forme de chromatine active (sensibilité à l ADNaseI) Entourée de régions d ADN typiques Leur mécanisme d action est en cours d élucidation Forment une boucle qui les rapproche du promoteur Seraient transcrites en un ARN qui ne serait pas traduit en protéine (earn) Stabilisation de l interaction enhancer/promoteur par cet earn (Kolovos et al, 2012)

D) AUTRES SÉQUENCES AGISSANT EN CIS (4). Des séquences identiques mais à effet opposé ont été mises en évidence : elles sont appelées silencers ou séquences extinctrices.

VI-3.- EXPRESSION DU GÉNOME TRANSCRIPTION CHEZ LES EUCARYOTES B- L ARN MESSAGER DES EUCARYOTES

Chez les eucaryotes supérieurs et parfois chez les eucaryotes inférieurs, les gènes sont morcelés. Le transcrit primaire a la même organisation que le gène, il est parfois appelé préarnm. Il va subir une maturation.

A) LE TRANSCRIT REÇOIT UNE COIFFE À L EXTRÉMITÉ 5 Le premier nucléotide (le plus souvent A) du transcrit a son groupement 5 triphosphate 5 pppapnpnpn. La guanylyl transférase è addition de G à l extrémité 5 selon une orientation inverse / autres nucléotides La coiffe est méthylée

A) LE TRANSCRIT REÇOIT UNE COIFFE À L EXTRÉMITÉ 5 (2) 5 Gppp + 5 pppapnpnp 5 _5 GpppApNpNp + pp + p Coiffe (cap)

Structure de la coiffe d'un ARN. Ce nucléotide à guanine est relié à la chaîne nucléotidique par une liaison inhabituelle : au lieu d'être reliés par une liaison ester-phosphorique entre le groupement OH porté par le carbone 3' du ribose du nucléotide à guanine et l'acide phosphorique alpha du premier nucléotide de l'arn natif, les deux nucléotides sont reliés par une liaison entre les acides phosphoriques des deux nucléotides. Par la suite, le cycle imidazole de la guanine terminale est méthylé sur son azote 7. Par ailleurs, le ribose du premier nucléotide de l'arn natif est méthylé sur l'oxygène porté par le carbone 2'. Ce peut également être le cas du nucléotide suivant. Document de Françoise Ibarrondo, Gilles Camus

B) POLYADÉNYLATION À L EXTRÉMITÉ 3 La plupart des ARNm des eucaryotes Le préarnm subit un clivage à son extrémité 3 avant la polyadénylation Ce clivage se fait au niveau d un site précis : le dinucléotide CA qui est entouré de deux autres séquences : AAUAAA très conservée située 10 à 30 nucléotides en amont du site de clivage (à ne pas retenir), La séquence DES riche en U ou en GU situé une trentaine de nucléotides en aval du site de clivage (à ne pas retenir),

B) POLYADÉNYLATION À L EXTRÉMITÉ 3 Le clivage est assuré par un complexe de clivage composé de plusieurs protéines Après clivage, la poly (A) polymérase ajoute environ 200 nucléotides (= queue poly(a)) Les ARNm qui portent une queue polya sont dits ARNm poly(a) +

B) POLYADÉNYLATION À L EXTRÉMITÉ 3 (2) Fixation de la protéine de liaison aux poly(a) (PABP) Rôle des poly(a) Stabilisation ARNm? Favoriserait la traduction?

C) L ÉPISSAGE DU TRANSCRIT PRIMAIRE Le processus par lequel les introns du préarnm sont enlevés et les exons resoudés est appelé épissage A lieu dans le noyau

C) L ÉPISSAGE DU TRANSCRIT PRIMAIRE (2) Les sites d épissage (les 2 frontières exonintron) Site gauche ou donneur Site droit (3 ) (5 ) Exon AG GUAAGU 12PyNCAG N Exon Intron : règle GU AG

C) L ÉPISSAGE DU TRANSCRIT PRIMAIRE (3) 1- coupure au niveau du site 5 2- structure en lasso de la molécule intron-exon de droite : extrémité 5 produite est reliée à une base dans l intron : base A appartenant à une séquence de branchement

C) L ÉPISSAGE DU TRANSCRIT PRIMAIRE (4) 3- coupure au niveau du site 3 è libération de l intron sous la forme d un lasso et ligature des 2 exons 4- débranchement du lasso è intron linéaire excisé

C) L ÉPISSAGE DU TRANSCRIT PRIMAIRE (5) Epissage réalisé par un gros complexe : particule d épissage (ou spliceosome) composé de petits ARNs et de nucléoprotéines

L ARN est ensuite transporté à travers les pores nucléaires vers le cytoplasme où il est reconnu par les ribosomes et traduit. Les demi-vies des ARNms des cellules animales varient entre 4 et 24 heures.

Les ARNm des eucaryotes existent sous une forme associée à des protéines : les ribonucléoprotéines. (RNPsm).

VI-4.- EXPRESSION DU GÉNOME LES ARN DE TRANSFERT

ARN DE TRANSFERT OU ARNT Chez les procaryotes, le transcrit primaire peut être clivé pour donner des produits matures : les ARNr et les ARNt. Chez les eucaryotes, ces ARNt sont transcrits à partir de gènes spécifiques et à l aide de l ARN polymérase III.

ARN DE TRANSFERT OU ARNT (2) L ARNt est l adaptateur entre l ARNm et les acides aminés lors de la traduction. C est une petite molécule de 75 à 85 bases de long.

ARN DE TRANSFERT OU ARNT (3) Il a deux propriétés essentielles : il représente un seul acide aminé auquel il se lie par covalence il contient une séquence de trois nucléotides, l anticodon, qui est complémentaire du codon représentant son acide aminé. L anticodon permet à l ARNt de reconnaître le codon grâce à l appariement des bases complémentaires.

ARN DE TRANSFERT OU ARNT (4) La structure secondaire de l ARNt peut être représentée sous la forme d une feuille de trèfle dans laquelle l appariement de bases complémentaires conduit à la formation de tiges ayant à leur extrémité des boucles simple brin.

ARN DE TRANSFERT OU ARNT (5) Ces structures constituent les bras ou boucles de l ARNt : de 3 vers 5 bras accepteur (site de fixation de l acide aminé), bras TψC (ψ = pseudouridine), bras supplémentaire ou bras variable. bras de l anticodon bras D (contient de la dihydrouridine),

www.snv.jussieu.fr/.../ac.nucleiques/acnucl.html

ARN DE TRANSFERT OU ARNT (6) Les acides aminés sont fixés sur l ARNt correspondant par l aminoacyl-arnt synthétase (20 différentes). L ARNt chargé de son acide aminé est appelé aminoacyl-arnt.

VI-5.- EXPRESSION DU GÉNOME LES ARNS RIBOSOMAUX

A) ARNR CHEZ LES PROCARYOTES Il y a 7 opérons non contigus codant l ARNr de E. coli : opérons rrna-g. ayant la même organisation : ils contiennent tous trois molécules d ARNr dans l ordre : 16S-23S-5S dans une zone intermédiaire une séquence codant pour un ARNt spécifique

A) ARNR CHEZ LES PROCARYOTES (2) Ces opérons sont transcrits à partir du même ARN précurseur, sédimentant à 30S, Clivage précurseur è : les différentes molécules d ARNr un ARNt enzyme impliquée : ARNase III. Maturation des produits de clivage par l ARNase III

B) ARNR CHEZ LES EUCARYOTES Mieux connus chez les mammifères. Le transcrit primaire chez les mammifères est un ARN 45S fortement méthylé, contenant les séquences des ARNrs 18S et 28S et du petit ARN 5,8S.

B) ARNR CHEZ LES EUCARYOTES (2) La méthylation servirait à distinguer les régions du transcrit primaire destinées à subir la maturation en ARNr. Le transcrit subit sa maturation alors qu il est associé à des ribonucléoprotéines.

VI-6.- EXPRESSION DU GÉNOME LA TRADUCTION

VI-6.- EXPRESSION DU GÉNOME LA TRADUCTION A- LE CODE GÉNÉTIQUE

LE CODE GÉNÉTIQUE Le code génétique est déchiffré par un système complexe situé entre acides nucléiques et protéines Au niveau de l ADN, il est lu par groupe de trois nucléotides ou codon. A un codon correspond un acide aminé

LE CODE GÉNÉTIQUE (2) Chaque gène = suite de codons lus séquentiellement d un point de départ situé à une extrémité du gène jusqu à un point de terminaison situé à l autre extrémité Crick et coll., 1961 : le code génétique est lu sous la forme de triplets non chevauchants

LE CODE GÉNÉTIQUE (3) Triplets non chevauchants = trois façons de traduire une même séquence nucléotidique en protéine selon le point de départ : les cadres de lecture

LE CODE GÉNÉTIQUE (4) CADRES DE LECTURES Une séquence : A C G A C G A C G A C G A C G A C G Trois cadres de lecture possibles ACG ACG ACG ACG ACG CGA CGA CGA CGA CGA GAC GAC GAC GAC GAC

LE CODE GÉNÉTIQUE (5) CADRES DE LECTURES Les mutations qui insèrent ou enlèvent une base è changement du cadre de lecture en aval de la mutation è décalage du cadre de lecture Conséquence de ces mutations : séquence différente d acides aminés = protéine différente è perte probable de la fonction de la protéine

LE CODE GÉNÉTIQUE (6) 64 codons possibles (4 3 ) 61 codons correspondent à des acides aminés 3 entraînent l arrêt de la synthèse protéique L ARNt est l intermédiaire qui traduit chaque triplet de nucléotides en un acide aminé

LE CODE GÉNÉTIQUE (7) 64 codons et 20 acides aminés : chaque acide aminé est représenté par plusieurs codons sauf la méthionine et le tryptophane Les codons représentant le même acide aminé diffèrent en général par la troisième base : le code génétique est dégénéré

LE CODE GÉNÉTIQUE (8) Le code génétique est universel : Pas de changement dans les génomes nucléaires Mais changement au cours de l évolution dans le génome mitochondrial

VI-6.- EXPRESSION DU GÉNOME LA TRADUCTION B- LES ACTEURS DE LA TRADUCTION

LES ACTEURS DE LA TRADUCTION L ARNm : codons Les aminoacyl-arnts avec les anticodons Les différentes enzymes Les ribosomes Les facteurs auxiliaires qui assistent le ribosome à chaque étape GTP : son hydrolyse fournit l énergie

LES RIBOSOMES Particules ribonucléoprotéiques : Protéines ARNr La plupart de ces protéines et ARNr ont un rôle structural strict et ne sont pas impliqués dans la synthèse des protéines

LES RIBOSOMES (2) Protéines ribosomales : protéines r Les ribosomes sont bien caractérisés chez les procaryotes Tous les ribosomes d une même bactérie sont identiques

LES RIBOSOMES (3) CHEZ E. COLI Ribosome complet (66% d ARNs) : densité de 70S Petite sous-unité de 30 S 1 ARNr de 16S 21 protéines Grande sous-unité de 50S 1 ARNr de 23S un petit ARN 5S 31 protéines

LES RIBOSOMES (4) CHEZ LES EUCARYOTES SUPÉRIEURS Ribosome complet (60% d ARNs) : densité de 80S Petite sous-unité de 40 S 1 ARNr de 18S 33 protéines Grande sous-unité de 60S 1 ARNr de 28S un petit ARN 5S Un petit ARN de 5,8 S 49 protéines

LES RIBOSOMES (5) Se comportent comme un facteur mobile qui se déplace le long d une matrice Fournit l environnement qui permet de contrôler l interaction ARNm / Aminoacyl- ARNt

LES RIBOSOMES (6) Différents sites actifs : Site P ou site donneur (site polypeptidique) à cheval sur les 2 sous-unités Site A : site accepteur (de l aminoacyl-arnt) à cheval sur les 2 sous-unités Site E : site par lequel l ARNt déchargé de son acide aminé quitte le ribosome

LES RIBOSOMES (6) Différents sites actifs : Site peptidyl transférase Un domaine de sortie du peptide Site de liaison de l ARNm

VI-6.- EXPRESSION DU GÉNOME LA TRADUCTION C- LES ÉTAPES DE LA TRADUCTION

L ARNm est associé à la petite sous-unité sur environ 30 bases à tout moment A tout moment, 2 molécules d ARNt sont actives dans la synthèse protéique Ces 2 molécules d ARNt s insèrent au niveau de sites internes du ribosome

Un aminoacyl-arnt entrant se fixe sur le site A Avant l entrée de l aminoacyl-arnt, le site expose le codon correspondant au prochain acide aminé qui devra être ajouté à la chaîne polypeptidique

Le codon représentant l acide aminé qui vient juste d être fixé à la chaîne polypeptidique se trouve dans le site P. Ce site est occupé par un peptidyl-arnt : un ARNt qui porte la chaîne polypeptidique naissante

LES DIFFÉRENTS ÉTAPES L initiation L élongation La terminaison

L INITIATION Met en jeu les réactions qui précèdent la formation de la liaison peptidique entre les deux premiers acides aminés de la chaine peptidique Nécessite la fixation du ribosome à l ARNm è complexe d initiation qui contient le premier aminoacyl-arnt Etape lente

L INITIATION (2) L initiation se produit au niveau d une séquence particulière de l ARNm : site de liaison des ribosomes

L INITIATION (3) Ces sites de liaison de 30 bases environ ont 2 caractéristiques : Le codon initiateur AUG (plus rarement GUG ou UUG chez les bactéries) est toujours à l intérieur du site de liaison A moins de 10 bases en amont de l AUG, une séquence qui correspond totalement ou en partie à l hexamère 5..A G G A G G..3 : séquence de Shine-Dalgarno (complémentaire de l extrémité 3 de l ARNr 16S)

L INITIATION (4) La reconnaissance de l ARNm : fixation d une petite sous-unité sur l ARNm è complexe d initiation : nécessité de facteurs d initiation (IFs) Libération des IFs è Puis une grande sous-unité rejoint le complexe è ribosome complet Bactéries : IF-1, 2 et 3.

L INITIATION (5) La synthèse de toutes les protéines débute par la méthionine Signal d initiation = codon d initiation : AUG, (GUG, UUG plus rarement chez les bactéries) Deux types d ARNt peuvent porter la méthionine selon qu elle soit initiatrice ou localisée à l intérieur de la chaine peptidique

L INITIATION (6) Chez les bactéries et dans les organites eucaryotes, l ARNt initiateur porte un résidu méthionine formylé sur son groupement amine è molécule de N-formyl-méthionyl- ARNt (ARNt Met f ou fmet-arnt) Chez les eucaryotes, l aminoacylarnt initiateur n est pas formylé, il contient d autres modifications qui permettent de le distinguer des met-arnt intrachaine Il peut être intégré directement au site P

L INITIATION (7) Chez les eucaryotes, la petite sous-unité reconnaît un ARNm grâce à sa coiffe en 5, migre jusqu à l AUG où elle sera rejointe par la grande sous-unité

L INITIATION (8) Lorsque la grande sous-unité rejoint le complexe, l aminoacyl-arnt initiateur se trouve dans le site P Le site A est disponible pour l entrée de l aminoacyl-arnt complémentaire du deuxième codon du gène

L ÉLONGATION Comprend toutes les réactions entre la synthèse de la première liaison peptidique et l addition du dernier acide aminé Les acides aminés sont ajoutés un à un à la chaîne polypeptidique Ajout d un acide aminé : étape très rapide

L ÉLONGATION (2) Le ribosome est complet au niveau du site d initiation Démarrage d un cycle : 1 aminoacyl-arnt entre dans le site A grâce à un facteur d élongation (EF- Tu chez les bactéries, eef-1α chez les eucaryotes) en présence de GTP GTP permet la liaison au site A N importe quel aminoacyl-arnt peut entrer dans le site A

L ÉLONGATION (3) Démarrage d un cycle : Le site P est occupé soit Soit par l aminoacyl-arnt initiateur Soit par un peptidyl-arnt

L ÉLONGATION (4) Transfert du polypeptide ou de de la méthionine formylée attaché à l ARNt du site P sur l aminoacyl-arnt présent dans le site A Synthèse de la liaison peptidique par l activité peptidyl transférase de la grande sous-unité ribosomale

L ÉLONGATION (5) Puis survient la translocation du ribosome qui se déplace de trois nucléotides sur l ARNm è expulsion du site P de l ARNt non chargé è entrée d un nouveau peptidyl-arnt è site A vide è positionnement de l aminoacyl-arnt correspondant au codon suivant Nécessité du GTP Facteur d élongation EF-G (eef-2 chez les eucaryotes)

LA TERMINAISON Englobe les réactions nécessaires pour libérer la chaîne polypeptidique complète; Dans le même temps le ribosome se dissocie de l ARNm

LA TERMINAISON (2) 3 codons de terminaison ou codons stop: UAG, UAA, UGA Pas d ARNt correspondant Ces codons sont reconnus directement par des facteurs protéiques : les facteurs de libération (RF) RF-1 et 2 chez E. coli

LA TERMINAISON (3) Provoque la libération du polypeptide achevé L expulsion du dernier ARNt du ribosome La dissociation de l ARNm du ribosome

RAPPEL : LE CODE GÉNÉTIQUE CADRES DE LECTURES Une séquence : A C G A C G A C G A C G A C G A C G Trois cadres de lecture possibles ACG ACG ACG ACG ACG CGA CGA CGA CGA CGA GAC GAC GAC GAC GAC

CADRE DE LECTURE OUVERT Cadre de lecture qui commence par le codon AUG et se poursuit en triplets représentant des acides aminés jusqu au codon de terminaisonè correspond à une séquence traduite en protéine ORF en anglais

CADRE DE LECTURE OUVERT (2) En général les deux autres cadres de lecture sont bloqués par de fréquents codons stop è ne synthétisent pas de protéines

MODIFICATIONS POST TRADUCTIONNELLES DES PROTÉINES Peuvent être multiples qualitativement et/ou quantitativement dans une même molécule : Glycosylations Phosphorylation Acétylation

VI-7.- EXPRESSION DU GÉNOME LA RÉGULATION DE L EXPRESSION DES GÈNES CHEZ LES EUCARYOTES (ARN POLYMÉRASE II)

Cinq points de contrôle potentiels Activation de la structure d un gène Initiation de la transcription Maturation du transcrit Transport vers le cytoplasme Traduction de l ARNm

VI-7.- EXPRESSION DU GÉNOME LA RÉGULATION DE L EXPRESSION DES GÈNES CHEZ LES EUCARYOTES (ARN POLYMÉRASE II) A- ACTIVATION DE LA STRUCTURE DU GÈNE

ACTIVATION DE LA STRUCTURE DU GÈNE Les gènes peuvent exister dans deux états structuraux : actif inactif Les gènes sont à l état actif dans les cellules qui les expriment Le changement de structure indique que le gène est susceptible d être transcrit L acquisition de la structure active est la première étape incontournable de l expression des gènes

ACTIVATION DE LA STRUCTURE DU GÈNE (2) Activation du gène par : Exclusion des nucléosomes Niveau de méthylation

ACTIVATION DE LA STRUCTURE DU GÈNE : EXCLUSION DES NUCLÉOSOMES Il y aurait une compétition entre les histones (octamères d histones ou nucléosomes) et les facteurs de transcription pour se fixer sur l ADN Sites sensibles à l ADNase I: Régions où nucléosomes exclus par la présence d autres protéines se liant à l ADN (ADN ou ARN polymérases, facteurs transcriptionnels, ) Régions hypersensibles : en général se situent dans les régions 5 non transcrites des gènes : promoteurs des gènes actifs

ACTIVATION DE LA STRUCTURE DU GÈNE : LA MÉTHYLATION DE L ADN CHEZ LES EUCARYOTES Chez les eucaryotes, la méthylation de l ADN est principalement liée au contrôle de la transcription 2 à 7% des cytosines de l ADN des cellules animales sont méthylées La plupart des groupements méthyle sont associés à des dinucléotides CG (ilots CpG) 5 m CpG 3 3 GpC m 5 Le gène méthylé est inactif Le gène non méthylé ou sous-méthylé est actif

ACTIVATION DE LA STRUCTURE DU GÈNE : LA MÉTHYLATION DE L ADN CHEZ LES EUCARYOTES (2) L ADN subit des épisodes de déméthylation globale aux stades précoces du développement Surviendraient essentiellement au cours de 2 étapes clés du développement : dans les cellules germinales et chez l embryon avant l implantation Rôle : maintien de la totipotence des gènes = tous les gènes fonctionnent Ces déméthylations sont suivies d une méthylation de novo par des ADN méthyltranférases Ensuite, dans les différents tissus, seuls les gènes tissu-spécifiques subissent des déméthylations et vont s exprimer Tan et Shi, 2012; (R Chatterjee, and C Vinson, 2012;, Jeffrey R. Shearstone et al, 2011;

VI-7.- EXPRESSION DU GÉNOME LA RÉGULATION DE L EXPRESSION DES GÈNES CHEZ LES EUCARYOTES (ARN POLYMÉRASE II) B- RÉGULATION DE L INITIATION DE LA TRANSCRIPTION

LA RÉGULATION EN CIS Assurée par des séquences influençant l initiation et le taux de la transcription Eléments à localisation fixe : les promoteurs Eléments à localisation variables : les séquences stimulatrices (enhancers) et les séquences extinctrices (silencers)

LA RÉGULATION EN CIS (2) Ces séquences sont reconnues par des protéines spécifiques Régulation positive : protéine présente uniquement si le gène doit être exprimé

LA RÉGULATION EN CIS (3) Promoteurs ou enhancers Certaines séquences confèrent une spécificité tissulaire d expression (= gènes exprimés spécifiquement dans certains tissus) D autres sont la cible de facteurs transcriptionnels sous le contrôle de stimuli extra ou intracellulaires (hormones, ions, choc thermique,..) Ce sont les Eléments de réponse (Response element ou RE)

LA RÉGULATION EN CIS (4) Exemples de RE GRE : élément de réponse aux glucocorticoïdes IRE : élément de réponse au fer

LA RÉGULATION EN TRANS : LES FACTEURS TRANSCRIPTIONNELS Très nombreux Contiennent : Un domaine de fixation à l ADN : différents types Un domaine d activation de la transcription = domaine de liaison à d autres protéines (ARN polymérase,..)

LA RÉGULATION EN TRANS : LES FACTEURS TRANSCRIPTIONNELS (2) Rôle ++++ de la disposition relative dans l espace des différentes protéines (plus importante que leur distance relative par rapport au promoteur) Rôle de la structure dans l espace et des interactions protéines-protéines dans la régulation

VI-7.- EXPRESSION DU GÉNOME LA RÉGULATION DE L EXPRESSION DES GÈNES CHEZ LES EUCARYOTES (ARN POLYMÉRASE II) C- RÉGULATION POSTTRANSCRIPTIONNELLE

EPISSAGE ALTERNATIF Gène Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Transcription Transcrit Prim Exon 1 Exon 2 Exon 3 ARNm A Protéine A Exon 1 Exon 2 Exon 4 ARNm B Protéine B

EPISSAGE ALTERNATIF (2) En fonction des conditions ou des besoins, la protéine A ou la protéine B sera synthétisée: Certains cas, fonction du sexe D autres cas, fonction des tissus

STABILISATION DE L ARNM : EXEMPLE DE LA TRANSFERRINE Transferrine : molécule qui transporte le fer L ARNm de la transferrine contient une séquence appelée IRE IRE : région 3 non codante de l ARNm Fixation d une protéine avec une affinité contrôlée par la concentration en fer Présence de fer è stabilisation de l ARNm