Supplément : Exercice de biologie du développement En cette fin de semestre, un tuteur de biologie fou de tristesse décide de se lancer dans l'étude d'une protéine impliquée dans le développement du Xénope (quelle surprise!). Il décide de donner un nom de code à sa protéine afin de garder ses recherches secrètes (parce qu'en plus il est parano). Il commence donc son étude de la protéine désormais dénommée BIFLE (Biology Is Fun & Largely Entertaining) avec une expérience d'hybridation in situ. Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 1. Figure 1 : hybridation in situ dirigée contre BIFLE. (A) au stade 8 cellules ; (B) au stade 9 (blastula agée) ; (C) au stade 10 (jeune gastrula). Les embryons des figures (B) et (C) ont été coupé en deux selon le plan contenant les axes dorso-ventral et animal-végétatif avant l'observation. Question 1 d'après la figure 1, on peut dire que (cochez la ou les proposition(s) exacte(s)) : A) l'arnm BIFLE est exprimé au niveau animal de l'embryon. B) la flèche sur la figure 1C correspond à l'encoche blastoporale. C) l'arnm BIFLE est moins présent en périphérie qu'au centre de la région animale, comme le montre la figure 1B. D) l'arnm BIFLE s'exprime avant et après la transition blastuléenne. 1
L'expérience suivante choisie par notre chercheur fou est une étude par Western Blot de la protéine BIFLE à différents endroits de l'embryon. Les résultats obtenus sont présentés dans la figure 2. Figure 2 : Western Blot à partir des extraits protéiques totaux de la partie animale (An), végétale (Vg) ou de la zone marginale (MZ) d'embryons au stade blastula. Les anticorps utilisés pour la révélation sont indiqués à droite : BIFLE (BIFLE) et actine (Actin). Question 2 concernant les résultats de la figure 2 et à l'aide de vos connaissances de cours, indiquez la ou les poposition(s) exacte(s) : A) une molécule peut avoir un effet différent selon sa concentration dans différentes zones de l'embryon. B) ces résultats confirment les résultats obtenus dans la figure 1. C) BIFLE agit avec un effet dose. D) BIFLE ayant une expression maternelle, la rotation de symétrisation explique son absence au niveau végétal. Intrigué par cette mise en appétit, notre chercheur s'intéresse maintenant aux effets de BIFLE pendant le développement. Il conduit donc une expérience de RT-PCR dirigée contre différents 2
marqueurs. Sox2 est ici un marqueur ectodermique, et EF1α est un témoin de charge. Les résultats obtenus sont présentés figure 3. Figure 3 : RT-PCR dirigée contre certains ARN indiqués à droite. Les extraits d'arn totaux ont été obtenus au stade jeune gastrula. Control VMZ : zone marginale contrôle. VMZ + BIFLE : zone marginale dans un embryon injecté par des ARNm BIFLE au stade 8 cellules. Embryo : embryon entier non injectée. Question 3 à l'aide de la figure 3 et de vos connaissances, indiquez la ou les proposition(s) exacte(s) : A) il est normal d'observer Xbra dans les conditions Control VMZ. B) il est anormal de ne pas observer Sox2 dans les conditions Control VMZ. C) BIFLE semble empêcher l'induction du mésoderme. D) BIFLE semble être un inducteur de l'ectoderme. Dans l'expérience suivante, notre tuteur fou décide d'étudier les effets d'un oligomorpholino dirigé contre BIFLE. Il étudie d'une part (figure 4A) l'expression de certains marqueurs mesodermiques (Mix.2, Eomes) ou ectodermique (Sox2) par RT-PCR. D'autre part, il étudie l'expression de VegT zygotique, qui est un marqueur mésodermique, par hybridation in situ (figure 4B). 3
Figure 4 : (A) RT-PCR dirigée contre Mix.2 (Mix.2), Eomes (Eomes) ou Sox2 (Sox2) ; ODC est un témoin. Les ARNm ont été obtenus selon le protocole suivant : des calottes animales ont été prélevées et traitées ou non (control AC) par un OM anti BIFLE (BIFLE-MO 60ng), un OM contrôle (control-mo), puis cultivées jusqu'au stade blastula âgée. Les ARNm ont alors été analysés par RT- PCR. Embryo correspond à un embryon entier. (B) Hybridation in situ de VegT zygotique au stade gastrula. Les embryons ont été traités par un OM contrôle (control-mo), un OM anti BIFLE (BIFLE- MO), un OM anti BIFLE et un ARNm de BIFLE (BIFLE-MO + BIFLE mrna), ou un OM contrôle et un ARNm de BIFLE (control-mo + BIFLE mrna). Les résultats obtenus pour un embryon non traité sont identiques à ceux obtenus dans la condition control-mo. Question 4 concernant les résultats de la figure 4A et à l'aide de vos connaissances de cours, A) les résultats observés ne sont pas interprétables car l'om contrôle empêche l'expression de Mix.2 et Eomes. B) l'ajout de 60ng de BIFLE dans une calotte animale change son devenir : elle s'oriente plutôt vers du mésoderme que vers de l'ectoderme. C) un embryon complet contient une même quantité de mésoderme que d'ectoderme. D) il est impossible que BIFLE soit d'origine maternelle puisqu'elle exerce son action au stade blastula agée. 4
Question 5 concernant les résultats de la figure 4B et à l'aide de vos connaissances de cours, A) l'absence de BIFLE a pour conséquence une extension de la zone endodermique. B) l'une des conditions testées a pour but d'étudier la spécificité de l'om utilisé contre BIFLE. C) la surexpression de BIFLE réduit l'étendue du mésoderme vers le pôle animal. D) VegT semble induire une expression de BIFLE au niveau du mésoderme. Au vu des résultats précédents, notre tuteur, fou mais pas si con, décide logiquement de conduire une nouvelle expérience de RT-PCR (pas con mais ennuyant!) contre Xbra pour étudier l'effet de traitements conjoints de BIFLE avec l'activine et le FGF. Les résultats obtenus sont présentés figure 5. Figure 5 : Analyse de l'arnm Xbra dans des calottes animales injectées ou non (control AC) par différentes molécules : Activine (Activin), Activine et BIFLE en quantité variable (Activin + BIFLE), FGF (FGF), FGF et BIFLE (FGF + BIFLE). Le prélèvement des ARN pour analyse a été effectué au stade jeune gastrula. Embryo correspond à un embryon entier au stade jeune gastrula. Question 6 concernant les résultats de la figure 5 et à l'aide de vos connaissances de cours, A) le FGF et l'activine sont deux molécules qui utilisent la dimérisation d'un récépteur tyrosine kinase pour la transduction du signal. B) BIFLE inhibe l'action mésodermisante de l'activine de manière dose-dépendante au niveau de la zone marginale. C) le FGF a une action mésodermisante qui résiste à l'action de BIFLE. 5
D) ces résultats confirment que BIFLE joue un rôle sur la formation de l'endoderme puisqu'elle n'a aucun effet sur l'action de FGF. Notre tuteur ne sachant apparemment pratiquer qu'un seul type d'expérience (comment ça comme tous les chercheurs?!), il conduit une autre RT-PCR pour étudier cette fois l'expression d'un marqueur neural (NCAM) et d'un marqueur épidermique (Ker). Les résultats sont présentés figure 6. Figure 6 : RT-PCR de calottes animales traitées ou non (control AC) par BIFLE (BIFLE) à différents concentrations et analysées au stade gastrula agée. Les ARNm étudiés sont indiqués à droite. Embryo correspond à un embryon entier au stade jeune gastrula. Question 7 à l'aide des résultats de la figure 6 et de vos connaissances (durement) acquises, A) laissée en culture sans aucun traitement, le devenir d'une calotte animale est de l'épiderme. B) laissée en culture sans aucun traitement, le devenir d'une calotte animale est du tissu neural. C) le traitement par BIFLE change le devenir des calottes animales. D) à faible concentration, BIFLE semble induire la formation d'un embryon normal entier. La machine a PCR étant momentanément hors d'usage à cause d'une utilisation excessive, notre chercheur en est réduit à utiliser son cerveau et a pour idée de réaliser une expérience de coimmunoprécipitation. Il utilise donc une protéine de fusion HA-BIFLE et différentes protéines de fusion entre Flag et des protéines de la famille des SMAD (Flag-SmX). Les résultats sont présentés figure 7. 6
Figure 7 : co-immunoprécipitation entre HA-BIFLE (HA-BIFLE) et différentes protéines Flag-SMAD (Flag-Smads). Les SMAD sont notées SmX avec X = 1, 2, 3 ou 4. Les anticorps utilisés pour la révélation sont notés à droite. L'immunoprécipitation a été effectuée avec un anticorps anti HA. Question 8 concernant les résultats de la figure 7 et à l'aide de vos connaissances de cours, A) les SMAD sont impliquées dans la transduction des signaux induits par Xnr. B) il semblerait que BIFLE interagisse avec SMAD4 (et on peut donc en déduire que SMAD4 aime la bifle, faisant de cette protéine la préfére de la gente masculine!). C) on ne peut conclure quant à la nature directe ou indirecte de l'interaction entre BIFLE et SMAD3 : il faudrait que les conditions du blot soient précisées. D) on peut supposer que les résultats obtenus pour SMAD5 seraient similaires à ceux obtenus pour SMAD2. Exalté par la puissance de cette technique, notre tuteur décide de faire une autre expérience de co-immunoprécipitation. Il injecte des embryons au stade 2 cellules avec différentes combinaisons d'oligomoprholinos et d'arnm, et récupère les protéines au stade gastrula pour analyse. Les résultats obtenus sont présentés figure 8. 7
Figure 8 : co-immunoprécipitation dans différentes conditions entre HA-ubiquitin et Flag-Smad4. L'anticorps utilisé pour l'immunoprécipitation est dirigé contre Flag, et celui utilisé pour la révélation contre HA. Les différentes molécules injectées ou non sont indiquées à gauche : un ARNm codant pour la protéine de fusion Flag-SMAD4 (Flag-Smad4), ou HA-Ubiquitine (HA-Ubiquitin); un OM contrôle (control-mo), ou un OM dirigé contre BIFLE (BIFLE-MO). Question 9 - concernant les résultats de la figure 8 et à l'aide de vos connaissances de cours, A) la protéine SMAD4 existe probablement sous différentes isoformes. B) BIFLE semble protéger SMAD4 de la dégradation par le protéasome. C) BIFLE semble être une ubiquitine ligase ayant pour cible SMAD4. D) l'ubiquitine entraine une interaction entre l'arn de BIFLE et la protéine SMAD4. Question 10 Au vu de l'ensemble des résultats obtenus et de vos connaissances de cours, indiquez la ou les réponses exactes : A) BIFLE n'est autre que la follistatin! B) BIFLE n'est autre que la fibronectine! C) BIFLE n'est autre que l'ectodermine! D) mon petit doigt me dit qu'en faisant les expériences adéquates, j'observerais une influence de BIFLE sur la phosphorylation de SMAD4. 8
Un GRAND MERCI à Baptiste Lafont pour la réalisation de cette exercice supplémentaire. La team bio vous AIME <3 9