Guide d Interprétation Petrifilm Test pour la numération des E. coli et Coliformes Ce document est destiné à vous apporter une aide pour l interprétation des résultats obtenus à partir du test M Petrifilm pour la numération des E. coli et Coliformes (EC). Pour plus d information, contacter votre représentant officiel M Microbiologie le plus proche. Les tests Petrifilm EC contiennent un milieu sélectif (de type VRBL) composé de sels biliaires, de cristal violet et de rouge neutre, ainsi qu un agent gélifiant soluble dans l eau froide, un indicateur d activité de ß-glucuronidase et un indicateur au tetrazolium facilitant la lecture. Le film supérieur retient le gaz produit par les colonies fermentant le lactose. Les conditions d incubation ainsi que l interprétation des tests Petrifilm EC varient selon les méthodes suivies. Ceci pourra éventuellement influer dans une faible mesure sur la numération. Les conditions d incubation des méthodes les plus répandues sont mentionnées dans la Notice d Utilisation, des exemples figurent dans les deux pages suivantes. Ne pas compter les colonies sur le pourtour en mousse, car la sélectivité du milieu y est modifiée. Suivre les temps et les températures d incubation habituellement pratiquées par le laboratoire. En règle générale, les températures suivantes sont utilisées (E. coli et Coliformes) : 5, 7, 42 ou 44 C pendant 24 à 48h. 4 E. coli : En général, les E. coli sont capables de se développer sur un milieu sélectif de type VRBL. La plupart des E. coli (environ 2 97%) produit de la ß-glucuronidase qui réagit avec l indicateur BCIG inclus dans le test Petrifilm EC colorant ainsi la colonie en bleu à rouge-bleu. Environ 95% des E. coli produisent du gaz à partir du lactose, les colonies sont alors étroitement associées (à une distance approximativement équivalente au diamètre d une colonie) à une ou des bulles de gaz. Voir Cercle. Les E. coli apparaissent donc bleu à rouge-bleu, sont gazogènes et il convient de confirmer les colonies bleu à rouge-bleu non gazogènes. Voir Cercle 2. Sous certaines conditions de validation, cette interprétation a été adaptée : entre autres, les organismes suivants, AOAC, NMKL, EMMAS ont validé ou évalué l emploi du Test Petrifilm EC dans des conditions spécifiques. Se reporter aux pages 2 et du présent Guide d Interprétation. Remarque : Les E. coli O57:H7 sont la plupart du temps atypiques : ces bactéries ne se développent pas à des températures 44,5 C, sont glucuronidase négative et, par conséquent, ne produisent pas un précipité bleu. Elles apparaissent donc sous la forme de Coliformes non E. coli (rouges associées à des bulles de gaz). Coliformes: Le test Petrifilm EC peut également convenir pour la numération des Coliformes. L ISO définit les Coliformes par leur capacité à se développer sur un milieu spécifique. La méthode ISO 482, détermination du nombre de Coliformes par comptage des colonies, définit les Coliformes par la taille de la colonie et la production d acide sur milieu VRBL (Violet Red Bile Lactose). Sur les tests Petrifilm EC, les colonies caractéristiques sont rouges avec ou sans bulles de gaz autour de la colonie (à une distance approximativement équivalente au diamètre d une colonie). Voir Cercle. La méthode ISO 48 décrit une numération des Coliformes par la technique du Nombre le Plus Probable (NPP) et définit les Coliformes par leur capacité à se développer et à produire du gaz par fermentation du lactose dans un bouillon sélectif. Sur le test Petrifilm EC, les colonies caractéristiques sont alors rouges avec une ou plusieurs bulles de gaz autour de la colonie (à une distance approximativement équivalente au diamètre d une colonie). Voir Cercle 4. L AOAC International et la FDA (Food and Drug Administration) / BAM définissent les Coliformes comme des bâtonnets Gram négatif produisant de l acide et du gaz par fermentation métabolique du lactose. Les colonies de Coliformes se développant sur le test Petrifilm EC produisent de l acide qui assombrit la couleur du gel. La présence d une ou plusieurs bulles de gaz autour d une colonie (à une distance approximativement équivalente au diamètre d une colonie) indique la présence de Coliformes confirmés. Voir Cercle 4.
Interprétation des tests M Petrifilm E. coli et Coliformes (EC) Méthode recommandée en France Incubation : 24h +/- 2h à 42 C +/- C Interprétation : E. coli : Compter toutes les colonies bleues gazogènes et non gazogènes. 5 E. coli. A Lecture selon la méthode AOAC International, tous produits (méthode 99.4) Incubation : Coliformes tous produits : incuber 24 h +/- 2 h à 5 C +/- C E. coli 48h +/- 2h à 5 C +/- C : E. coli dans tous produits sauf ceux cités ci-dessous. Lecture selon la méthode AOAC International, viande, volaille et fruits de mer (méthode 998.08) Incubation: Enumération de E. coli dans les viandes, volailles et fruits de mer, et de Coliformes dans tous produits : incuber 24 h +/- 2 h à 5 C +/- C B Interprétation (Méthodes 99.4 et 998.08) E. coli : colonies bleues gazogènes. Coliformes confirmés : toutes colonies gazogènes (bleues et rouges). 47 E. coli, méthode officielle AOAC. 87 Coliformes confirmés, méthode officielle AOAC.
Lecture selon la méthode NMKL (méthode 47.99) Incubation : 48h +/- 2h à 7 C +/- C Interprétation : E. coli : compter toutes les colonies bleues gazogènes et non gazogènes après 48h +/- 2h d'incubation. Coliformes : compter les colonies rouges gazogènes et toutes les colonies bleues gazogènes ou non après 24h +/- 2h d'incubation. C 5 E. coli, méthode NMKL. 95 Coliformes totaux, méthode NMKL. Lecture selon les conditions décrites lors de l'évaluation EMMAS Incubation : 48h +/- 2h à 7 C +/- C Interprétation : E. coli : compter toutes les colonies bleues gazogènes et non gazogènes. Il est recommandé de confirmer les colonies bleues non gazogènes, particulièrement quand elles sont présentes en forte proportion. D 5 E. coli, méthode évaluée par EMMAS.
Test M Petrifilm pour la numération des E. coli et Coliformes A noter le changement de couleur du gel entre les photos 2 à 8. Plus le nombre d E. coli augmente, plus la couleur du gel devient foncée (du rouge clair au rouge foncé violacé). Nombre de E. coli = 0 Les petites bulles de gaz visibles sont caractéristiques du gel et ne sont pas le résultat d un développement bactérien (E. coli ou Coliformes). Ces bulles sont de la taille d une tête d épingle, de forme régulière et ne sont pas associées à des colonies. Voir Carré. 2 Nombre de E. coli = Nombre de Coliformes gazogènes = 28 Tout comme sur la boîte de Petri, la plage de dénombrement optimale (toutes colonies) est de 5 à 50 colonies. Ne pas compter les colonies sur le pourtour en mousse, car la sélectivité du milieu y est modifiée. Voir Cercle. Sans éclairage indirect Avec éclairage indirect 2 Nombre de E. coli = Toute colonie bleu à rouge-bleu indique la présence d un E. coli. L utilisation d un éclairage indirect peut améliorer la détection d un léger précipité bleu associé à une colonie. Le Cercle montre une colonie rouge-bleu sans éclairage indirect. Le Cercle 2 montre la même colonie avec éclairage indirect. Le précipité bleu est ici plus évident. 4 Nombre d E. coli : 20 Nombre total de colonies (estimé) : 50 La zone de croissance circulaire du test Petrifilm EC est de 20 cm 2 environ. Des estimations sont possibles sur des tests Petrifilm EC contenant plus de 50 colonies en comptant le nombre de colonies dans un ou plusieurs carrés représentatifs et en déterminant le nombre moyen par carré. Multipliez ce nombre moyen par 20 pour déterminer le nombre estimé par test Petrifilm EC. 5
Test Petrifilm EC incomptables Pour obtenir un dénombrement précis, procéder à d autres dilutions. 6 7 Niveau de contamination : 0 6 Les tests Petrifilm EC incomptables présentent une ou plusieurs de ces caractéristiques : nombreuses petites colonies, nombreuses bulles de gaz, gel de couleur rouge plus foncé à violacé. Niveau de contamination : 0 8 Une très forte contamination en E. coli provoquera une coloration bleu-violacé du gel. Niveau de contamination : 0 8 Une très forte contamination en Coliformes (non E. coli) provoquera une coloration rouge foncé du gel. D autres dilutions sont nécessaires pour déterminer si des E. coli sont présents. 8 Niveau de contamination : 0 8 Lorsqu un nombre élevé de micro-organismes non Coliformes sont présents, comme Pseudomonas par exemple, la couleur du gel du test Petrifilm EC peut virer au jaune. 9
Bulles de gaz 2 Les débris d aliments sont souvent de forme irrégulière et ne sont pas associés à des bulles de gaz. Voir Cercle. 0 La Figure montre comment la forme des bulles peut varier. Parfois, la quantité de gaz produite par la colonie fait éclater celle-ci. Voir Cercles et 2. L air présent dans l échantillon ou une inoculation inadéquate du test Petrifilm EC peut induire la présence de bulles artefact dans le gel. Ces bulles sont de taille irrégulière et non associées à une colonie. Voir Cercle. Ne pas compter les colonies sur le pourtour en mousse, car la sélectivité du milieu y est modifiée. 2 4 5 6 7 8 9 Les exemples ci-dessus montrent des colonies associées à des bulles de gaz de formes variées. Toutes doivent être prises en compte. 2
Test M Petrifilm pour la numération des E. coli et Coliformes Pour des informations détaillées concernant les Mises en garde, Garantie limitée, Recours limités, Stockage et Destruction, Mode d emploi se reporter à la Notice d utilisation. Fiche d utilisation Stockage Petrifilm Petrifilm Petrifilm Mettre au réfrigérateur les poches fermées à une température 8 C ( 46 F). Utiliser les tests Petrifilm EC avant la date d expiration indiquée sur la poche. 2 Pour refermer les poches, replier l extrémité et fermer à l aide d un ruban adhésif ou d une pince. Garder les poches entamées à une température 25 C ( 77 F) et une Humidité Relative 50%. Ne pas les placer au réfrigérateur. Utiliser les tests Petrifilm EC dans le mois qui suit l ouverture de la poche. Préparation 4 Peser ou pipeter le produit dans un récipient stérile (sac stomacher, bouteille, sac Whirl-Pack ou autre). 5 Ajouter les quantités nécessaires de l un des diluants suivants stérilisé : tampon phosphate Butterfield (tampon phosphate IDF, KH 2 PO 4 à 0,0425g/l, ajuster le ph à 7,2), eau peptonée à 0,%, peptone-sel (méthode ISO 6887), solution saline (0,85-0,90%) ou eau distillée. 6 Broyer ou homogénéiser l échantillon en utilisant la procédure habituelle. Ensemencement Ne pas utiliser de tampons contenant du citrate, du bisulfite ou du thiosulfate. Ajuster le ph de l échantillon entre 6,6 et 7,2 : pour les produits acides, utiliser NaOH N, pour les produits alcalins, utiliser HCl N. 7 Placer le test Petrifilm EC sur une surface plane. Soulever le film supérieur. 8 Avec une pipette tenue perpendiculairement au test Petrifilm EC, déposer ml de l échantillon dilué au centre du film inférieur. 9 Recouvrir délicatement avec le film supérieur de manière à éviter l introduction de bulles d air. Ne pas laisser le film supérieur retomber brutalement.
0 Placer le diffuseur, face lisse vers le bas, au centre du film supérieur, au niveau de l inoculum. Etaler l échantillon en exerçant une légère pression sur le diffuseur. Ne pas tourner ou faire glisser le diffuseur. 2 Retirer le diffuseur. Attendre au minimum minute pour permettre au gel de se solidifier. Incubation Interprétation <70 F Incuber les tests Petrifilm EC à l horizontale, le film supérieur vers le haut, sans empiler plus de 20 unités. La température d incubation varie selon les méthodes*. Méthodes approuvées les plus courantes : Méthode officielle AOAC 99.4 : Pour les Coliformes, incuber 24h ± 2h à 5 C ± C ; pour E. coli, incuber 48h ± 2h à 5 C ± C. Méthode officielle AOAC 998.08 : pour E. coli dans la viande, la volaille et les fruits de mer, et pour les Coliformes dans tous produits, incuber 24h +/- 2h à 5 C +/- C Méthode NMKL 47.99 : Pour les Coliformes, incuber 24h ± 2h à 7 C ± C ; pour E. coli, incuber 48h ± 2h à 7 C ± C. * Voir Notice d utilisation. 4 Lire les tests Petrifilm EC à l oeil nu ou à l aide d un système permettant une amplification visuelle ou lumineuse et d un stylo compteur de colonies type Québec au autre. Se référer au Guide d Interprétation pour la lecture des résultats. 5 Pour isoler une colonie en vue d une identification plus poussée, soulever le film supérieur et prélever la colonie à l aide d une anse stérile. Date Version Mars 2002.0 Remarques Ne pas oublier d inoculer et d étaler l échantillon sur le test Petrifilm EC avant de passer au test Petrifilm EC suivant. Les conditions d incubation ainsi que l interprétation des tests Petrifilm EC varient selon les méthodes, se référer à la Notice d utilisation. Référence du document Département Microbiologie Laboratoires M Santé Boulevard de l Oise 95029 Cergy-Pontoise Cedex Tél. : 0 0 85 77 M et Petrifilm sont des marques déposées de la Société M. Whirl-Pak est une marque déposée de Nasco. FP 000 - Mars 2002