8. Amplification et séquençage des acides nucléiques ADN chromosomique, plasmides (ADN bactérienne), ARN messager Rupture cellulaire Isolation et purification des acides nucléiques Concentration et amplification de l ADN ou de l ARN isolé 290 8.1 Extraction et isolation de l ADN Échantillon de cellules ou de tissus Traitement avec une solution hypotonique ou avec des détergents (Triton X-100 et SDS) Rupture cellulaire et dissociation des complexes ADN-protéine Incubation séquentiel avec un enzyme protéolytique (protéinase K) et la ribonucléase Élimination de protéines et d ARN Extraction de l ADN dans de l éthanol Seules les longues chaînes d ADN précipitent dans l EtOH; les nucléotides simples et les produits de la digestion de l ARN restent dans la phase aqueuse. 291
Centrifugation par gradient de densité: Une méthode alternative pour l isolation de l ADN est la séparation de protéines, ARN et ADN selon des différences dans leurs densités flottantes ou poussées. Une telle séparation est effectuée en centrifugeant à haute vitesse l échantillon brut dans une éprouvette contenant un gradient de densité formé (ex. 1.6 à 1.8 mg/ml) par une solution de CsCl. Lors de la centrifugation, les macromolécules (protéines, ADN, ARN) présentent dans la solution de CsCl forment des bandes distinctes selon leurs densités flottantes. (D après D. Holme et H. Peck, Analytical Biochemistry, 3è éd., 1998) 292 L ADN chromosomique peut être séparé des plasmides par centrifugation par gradient de densité en présence du bromure d éthidium (EtBr). (D après D. Holme et H. Peck, Analytical Biochemistry, 3è éd., 1998) L EtBr est un fluorophore qui se lie entre deux brins d ADN. En se liant à l ADN, l EtBr diminue la densité flottante de celle-ci, dû à un déroulement partiel de la double hélice. Il y a plus d EtBr qui se lie à l ADN chromosomique (ADN linéaire) qu aux plasmides (ADN circulaire). La densité de l ADN chromosomique est diminuée par 0.125 g/ml, tandis que que celle des plasmides est diminuée par 0.085 g/ml. 293
8.2 Isolation de l ARN L isolation de l ARN n est pas aussi simple que celle de l ADN: Les échantillons sont facilement contaminés par de la ribonucléase (omniprésente) qui cause la fragmentation de l ARN. Des d inhibiteurs sont ajoutés pour empêcher l activité endogène de la ribonucléase et l activité exogène est minimisée par l utilisation de verrerie stérile et de produits chimiques de haute pureté. L ARN est fortement associé à des protéines (polysomes). Des traitements durs sont nécessaires pour libérer l ARN. Deux méthodes communément employées pour l isolation de l ARN sont la méthode de la protéinase K (enzyme protéolytique qui cause la dissociation des complexes ARNprotéine et la digestion des protéines) et le traitement avec du thiocyanate de guanidine. 294 Méthode de la protéinase K Échantillon de cellules Traitement avec une solution hypotonique Rupture cellulaire; le nucléus demeure intacte Centrifugation Élimination du débris et nucléus cellulaire; l ARN cytoplasmique demeure dans le surnageant Traitement du surnageant avec la protéinase K Dissociation des complexes ARNprotéine et la digestion des protéines Extraction avec du phénol/chloroforme Extraction avec de l éthanol Élimination des produits de la digestion enzymatique Précipitation de l ARN dans 295 la phase aqueuse avec de l EtOH
Traitement avec du thiocyanate de guanidine Échantillon de cellules Traitement avec du thiocyanate de guanidine et du 2-mercaptoéthanol Rupture cellulaire et dénaturation de la ribonucléase Centrifugation du surnageant sur du CsCl (5.7 mol/l) à 100 000 g pendant 18 h Isolation de l ARN au fond du tube La pelote d ARN est dissout dans du tampon L ARN est concentré par précipitation dans de l éthanol froide. Séparation et purification de l ARNm par chromatographie par affinité (oligo-dt-cellulose ou poly(u)-sépharose) 296 8.3 L amplification des acides nucléiques par réaction de polymérisation en chaîne La quantité d ADN dans un échantillon est souvent insuffisant pour le séquençage et l analyse. L amplification en chaîne par polymérase (ACP) est un procédé d'amplification enzymatique in vitro d'une séquence définie d'adn (Kary Mullis, Prix Nobel 1993). Une seule molécule d ADN suffit pour l ACP. Avec l ACP, plusieurs tâches qui avant étaient impossible sont maintenant devenues de routine (ex. identification d un coupable avec un seul cheveu ou spermatozoïde et l identification rapide de maladies infectieuses). Principes de l ACP ACP en temps réel (mesure semi-quantitative des produits de l ACP durant la réaction) Transcription inverse de l ARN en ADN complémentaire 297
8.3.1 Principes de l ACP La réaction d amplification est effectuée dans un seule éprouvette qui est placé dans un thermocycleur. L éprouvette contient: (1) l échantillon d ADN à amplifier (2) un excès de 2 amorces, i.e. des oligonucléotides, constitués de 10 à 30 bases, ayant des séquences complémentaires aux bouts de l ADN cible (3) un excès des 4 acides désoxyribonucléiques (datp, dctp, dgtp et dttp) (4) l ADN polymérase, une enzyme qui synthétise, à partir des amorces, le brin complémentaire de celui ayant servi de matrice (5) un tampon qui maintient le ph et fournit les ions Mg 2+ qui sont nécessaires à la réaction. 298 La réaction d amplification est constitué de 3 étapes principales: Étape 1- dénaturation de l'adn (séparation des deux brins de la double hélice) à température élevée (94-95 C). Étape 2- positionnement des amorces en face de leurs séquences complémentaires, sur les brins d'adn, et fixation sur ces cibles (hybridation). 5 Étape 3- phase d'extension dans laquelle l'adn polymérase synthétise, à partir des amorces, le brin complémentaire de celui ayant servi de matrice. (D après A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004) 299
Les 3 étapes, dénaturation de l ADN, hybridation des amorces et extension des amorces, constituent un cycle. L ACP comporte généralement 20 à 35 cycles successifs d'amplification. Le chauffage et refroidissement répétitif du mélange réactionnel est communément appelé cycle thermique. Chaque étape dure 30 à 120 s. Seule la 1 ère étape de dénaturation dure 5 min. Une ACP de 30 cycles peut être donc complétée dans 1 à 2 hres. (D après A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004) 300 En théorie, le nombre de copies d ADN est doublé dans chaque cycle. Le nombre théorique de molécules d ADN (double brins), N m, à la fin de la réaction dépend du nombre initial de molécules d ADN (double brins), N o, dans le mélange réactionnel et du nombre de cycles, n: N = 2 m N o n Ce nombre théorique n est jamais atteint dus à des facteurs limitants tels que l épuisement des réactifs et l amplification de chaînes plus longues durant les premiers cycles. En pratique, le nombre de molécules d ADN peut être estimé selon l équation: n N m = No ( 1+ x) où x est l efficacité de la réaction (valeur de 0 à 1). 301
Par exemple, pour une réaction d amplification de 20 cycles (n=20) avec une seule molécule d ADN à double brins (N o =1), le nombre théorique de copies à la fin de la réaction est > 10 6 (=2 20 ). Si on suppose une efficacité de la réaction de 0.7 (x), la réaction est estimée à produire une amplification d environ 40 000 (=1.7 20 ). L efficacité et le rendement ne sont pas les seuls indicateurs de la réaction d amplification. La spécificité (génération de la séquence cible uniquement) et fidélité (un nombre négligeable d erreurs dans la séquence des chaînes synthétisées) de la réaction sont aussi des caractéristiques importantes. 302 8.3.2 Vitesse d amplification séquence cible (à amplifier) (D après A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004) 303
La réaction d amplification atteint éventuellement un plateau, le nombre de copies n augmente plus. Ceci est dû à l épuisement de réactifs (amorces et nucléotides), à l inhibition enzymatique par des phosphates libérées durant la réaction, à la détérioration thermique de l ADN polymérase et à l hybridation des brins plus long d ADN à des températures élevées au dépit de l hybridation de l ADN à simple brin avec des amorces. (D après A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004) 304