56 Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 1997, 136, 56-76 ITÉRÊT DE LA SPECTROPHOTOMÉTRIE DÉRIVÉE POUR L'IDETIFICATIO D'UE SUBSTACE (*) J. JOSEPH-CHARLES (1), M. BERTUCAT (1), P. LEVILLAI (2) L'utilisation de la spectrophotométrie dérivée peut fournir une information qualitative à l'analyste sur l'identification d'une substance. La spectrophotométrie - en dérivée première et en dérivée seconde - apporte une nette amélioration par rapport à la spectrophotométrie d'absorption classique dans la caractérisation d'un composé. Ceci est montré à travers l'étude de onze molécules à structure tricyclique. ITRODUCTIO La spectrophotométrie dans l'ultraviolet et le visible est souvent utilisée pour doser les principes actifs médicamenteux, grâce à la grande sensibilité des (*) (1) (2) Manuscrit reçu le 29 Septembre 1997 Laboratoire de Chimie Analytique Appliquée, U.F.R. des Sciences Pharmaceutiques, 3 ter, Place de la Victoire, 33076 Bordeaux Cedex Laboratoire de Chimie Analytique, U.F.R. des Sciences Pharmaceutiques, 2bis Boulevard Tonnelé, 37042 Tours Cedex
57 mesures. Malheureusement, son emploi pour la caractérisation des substances médicamenteuses est beaucoup plus réduit: au niveau de la Pharmacopée Française, seules quelques monographies utilisent cette technique. En effet, les spectres classiques donnent souvent une indication insuffisante pour l'identification d'une substance. Le spectre ultraviolet est beaucoup moins précis que son équivalent dans l'infrarouge : d'une part, seules les positions de maxima ou de minima très nets peuvent être définies avec une précision suffisante (+ ou - 1 nm par exemple) pour être caractéristiques, alors que les positions de nombreux épaulements ou de maxima peu marqués, quoique visibles sur le spectre, ne peuvent se voir attribuer une longueur d'onde précise. D'autre part, il n'existe souvent que peu de points définissables (un seul dans la plupart des cas). Or, de nombreuses substances peuvent avoir un maximum à la même longueur d'onde, ce qui peut entraîner des confusions. Ces raisons limitent donc l'intérêt de la méthode. C'est pourquoi nous avons voulu examiner la possibilité d'utiliser la dérivation pour améliorer la précision des spectres. En effet, la plupart des applications de cette technique trouvées dans la littérature à propos des médicaments, concernent l'analyse quantitative [ 1-11 ]. En revanche, peu de publications concernent l'analyse qualitative [ 12,13 ]. La spectrophotométrie dérivée peut pourtant être très intéressante pour résoudre le problème d'identification [ 14 ] ou permettre de savoir si un produit est pur ou en mélange. C'est une technique analytique utilisée pour améliorer la résolution de bandes d'absorption très voisines ou se recouvrant dans un spectre d'ordre zéro [ 15 ]. Cette méthode met très clairement en évidence les changements de pente des spectres et permet ainsi de noter les points d'inflexion avec précision. De plus, dans un spectre dérivé d'ordre n, une bande du spectre d'origine se traduit par l'existence de n+1 bandes alternativement positives et négatives, ce qui entraîne la formation de n points d'annulation faciles à déterminer avec une très grande précision (Figure 1). En conséquence, cette technique doit permettre de définir beaucoup plus clairement les caractéristiques du spectre ultraviolet d'une substance. L'objet de cet article est de montrer l'importance de la spectrophotométrie dérivée pour l'identification d'une substance et de vérifier la validité de notre hypothèse à travers l'étude de onze molécules tricycliques à structure azépinique ou apparentée (Tableau I).
58 Fig. 1 : Spectres en dérivée première ( 1 ) et seconde ( 2 ) d une bande d absorption gaussienne (A).
59 Ces composés peuvent être classés d'après leurs structures : Pyridobenzodiazépines : propizépine (PRO), pirenzépine (PIR) ; Dibenzodiazépines : dibenzépine (DIB), clobenzépam (CLOB), clozapine (CLOZ) ; Dibenzoxazépines : amoxapine (AMO), loxapine (LOX), nitroxazépine (IT) ; Dibenzothiazépine : clotiapine (CLOT); Dibenzazépine: fluperlapine (FLU) ; Dibenzothiépine : zotépine (ZOT ). Tableau I : Structures des principes actifs étudiés CH 3 H 3 C H 3 C H O. HCl O H. 2 HCl O CH 3 Propizépine Pirenzépine H 3 C CH 3 O H 3 C CH 3 O CH 3. HCl Cl H. HCl Dibenzépine Clobenzépam
60 Tableau I : Structure des principes actifs étudiés (suite) CH 3 H Cl Cl H Clozapine O Amoxapine CH 3 Cl H 3 C H 3 C O O 2 O O. HCl Loxapine itroxazépine CH 3 Cl F CH 3 S Clotiapine Fluperlapine H 3 C H 3 C O Cl S Zotépine
61 MATÉRIEL ET MÉTHODE Les spectres ont été tracés à l'aide d'un spectrophotomètre Gilford 2600 (Ciba Corning, Le Vésinet, France) équipé de cuves de quartz de 1 cm et relié à une table traçante Hewlett-Packard 8775 B (Hewlett-Packard, Évry, France). Les spectres ont été enregistrés contre un blanc solvant avec les paramètres suivants : Zone de longueur d'onde : 210-350 nm Pas de mesure : 0,5 nm Largeur de fente : 0,1 mm Échelle d'expansion des ordonnées : - mode dy / dx: ± 0,05 - mode d 2 y / dx 2 : ± 0,005 Tous les produits chimiques ont été utilisés sans autre purification. Le méthanol, qualité pour analyses, RPE-ACS provient de Carlo Erba (Farmitalia Carlo Erba, Milan, Italie). Les principes actifs étudiés nous ont été aimablement fournis par les laboratoires suivants: PRO (UPSA, Agen, France), PIR (Boeringer Ingelheim, Reims, France), DIB et CLOT (Sandoz, Rueil- Malmaison, France), CLOB (Wander, Bâle, Suisse), AMO et LOX (Lederle, Oullins, France), IT (Ciba-Geigy, Bâle, Suisse), ZOT (Fujisawa Pharmaceutical Co, Osaka, Japon), CLOZ et FLU (Sandoz, Bâle, Suisse). Les solutions ont été préparées par dissolution dans le méthanol avec des concentrations finales permettant d'obtenir une absorbance comprise entre 0,5 et 1,0 U.A. au niveau des principaux maxima : 10 mg/l, sauf pour PIR et FLU à 20 mg/l et pour CLOB à 5 mg/l. * * *
62 RÉSULTATS Étude des spectres directs La facilité d'identification d'une substance par son spectre ultraviolet ou visible, dépend à la fois du nombre de bandes présentes dans le spectre, mais aussi de la largeur de ces bandes (une bande étroite présente généralement un maximum plus net) ou encore de la possibilité pour une bande, d'apparaître comme un épaulement sur une bande plus intense. Les onze molécules étudiées présentent ces différentes possibilités. Deux d'entre elles peuvent être définies avec précision (Tableau II et Figure 2). Par exemple, le spectre de FLU présente trois maxima à 230, 251 et 305 nm, trois minima à 227, 245 et 281 nm. De même, le spectre de ZOT montre deux maxima à 214 et 265 nm et un minimum à 246 nm. Tableau II : Longueurs d onde caractéristiques des spectres classiques ( 0 ) Composés Max Ep Min FLU 230 251 305 227 245 281 ZOT 214 265 (298) 246 284 DIB 225 (245) 216 CLOB 229 (243) 214 PIR 283 (245) 263 PRO 218 (238)
63 Fig. 2 : Spectres classiques ( 0 ), en dérivée première ( 1 ), et seconde ( 2 ), de la fluperlapine (FLU) et de la zotapine (ZOT)
64 Tableau II (suite) : Longueurs d onde caractéristiques des spectres classiques ( 0 ) Composés Max Ep Min IT (228) 268 AMO LOX CLOZ 252 (299) (322) 252 (299) (325) (228) (260) (297) CLOT (263) (298) 247 (233) (232) (277) (308) 242 (276) (308) (223) (252) (284) (240) (250) (292) Max : maximum ; Min : minimum ; Ep : épaulement Gras : point très net ; italique : point net ; (parenthèses) : point peu précis. Tableau III : Longueurs d onde caractéristiques des spectres en dérivée première ( 1 ) Composés P.A. Max Min FLU 227 230 245 251 281 305 228 248 293 236 259 322
65 Fig. 3 : Spectres classiques ( 0 ), en dérivée première ( 1 ), et seconde ( 2 ), de l amoxapine (AMO) et de la dibenzépine (DIB)
66 Tableau III (suite) : Longueurs d onde caractéristiques des spectres en dérivée première ( 1 ) Composés P.A. Max Min ZOT 214 246 265 287 299 260 292 219 232 273 312 DIB 216 225 220 245 (281) 233 251 CLOB 214 229 221 (238) 248 PIR 263 283 219 274 222 (299) PRO 218 236 226 241 IT 250 264 226 256 240 283 AMO 279 299 308 321 230 248 295 (314) 235 261 303 LOX 243 250 278 299 308 321 247 (286) (295) 234 262 304
67 Fig. 4 : Spectres classiques ( 0 ), en dérivée première ( 1 ), et seconde ( 2 ), de la clozapine (CLOZ) et de la clotiapine (CLOT)
68 Tableau III (suite) : Longueurs d onde caractéristiques des spectres en dérivée première ( 1 ) Composés P.A. Max Min CLOZ 225 254 258 287 295 225 256 291 218 238 267 307 CLOT 252 261 293 302 237 256 296 220 244 274 312 Max : maximum ; Min : minimum ; P.A. : point d annulation Gras : point très net ; italique : point net ; (parenthèses) : point peu précis. Tableau IV: Longueurs d onde caractéristiques des spectres en dérivée seconde ( 2 ) Composés P.A. Max Min FLU 228 236 248 259 293 324 222 241 264 281 335 232 253 274 306 (318)
69 Tableau IV (suite) : Longueurs d onde caractéristiques des spectres en dérivée seconde ( 2 ) Composés P.A. Max Min ZOT 232 260 273 292 312 221 243 256 279 316 227 252 266 303 DIB 220 233 245 251 282 292 237 255 265 305 226 248 259 286 CLOB 221 248 296 309 239 253 265 229 245 260 (300) PIR 219 222 241 245 274 298 229 255 263 305 219 288 PRO 226 236 241 (260) (263) (287) 230 246 274 294 305 238
70 Tableau IV (suite) : Longueurs d onde caractéristiques des spectres en dérivée seconde ( 2 ) Composés P.A. Max Min IT 226 239 256 283 245 275 286 294 (304) 230 269 299 AMO 230 235 249 261 283 288 295 304 314 222 242 268 291 307 233 255 286 299 323 LOX 247 262 287 291 304 314 222 240 272 307 233 254 299 324 CLOZ 218 225 237 256 268 291 307 222 244 273 283 315 231 262 301
71 Tableau IV (suite) : Longueurs d onde caractéristiques des spectres en dérivée seconde ( 2 ) Composés P.A. Max Min CLOT 221 238 244 257 275 298 314 327 225 232 249 282 229 241 269 306 Max : maximum ; Min : minimum ; P.A. : point d annulation Gras : point très net ; italique : point net ; (parenthèses) : point peu précis. Un groupe de substances (DIB, PIR, PRO, CLOB) possède un seul maximum assez facile à déterminer (Tableau II). Le spectre de DIB est représenté figure 3. En revanche, la bande principale du spectre de IT est plus large et son maximum plus délicat à préciser. otons par ailleurs la grande similitude des spectres de DIB et CLOB, liée à la faible différence de structure moléculaire. Trois molécules de structure très voisine (AMO, CLOZ, LOX) (figures 3 et 4) sont difficiles à caractériser car leurs spectres ne présentent que des bandes larges ou des épaulements. Seule LOX présente un maximum appréciable avec suffisamment de précision vers 252 nm (Tableau II). Là encore, les spectres de AMO et LOX sont pratiquement semblables. Enfin, les bandes du spectre de CLOT apparaissent essentiellement sous forme d'épaulements, si bien que malgré l'existence de trois bandes bien visibles (Tableau II, figure 4), l'identification de la molécule est très délicate. Globalement, l'apport de ces spectres directs pour l'identification des molécules est donc faible.
72 Étude des spectres en dérivée première Même pour les spectres bien définis à l'origine, la dérivation augmente la précision (Tableau III, figure 2). On sait, en effet, que chaque maximum ou minimum de la courbe d'origine (où la pente de la tangente est nulle) se traduit par un point d'annulation en dérivée première. Or, il est beaucoup plus facile de déterminer un point d'annulation que le maximum d'une bande assez large (Figures 2, 3 et 4). En choisissant une échelle dilatée, la position du point d'annulation peut être connue à moins de 0,1 nm près contre au moins 2 nm pour le maximum. De plus, chaque point d'inflexion du spectre d'origine va se traduire à son tour dans la courbe dérivée par l'existence d'un maximum ou d'un minimum. C'est ainsi que FLU, par exemple, présente six points d'annulation à 227, 230, 245, 251, 281 et 305 nm correspondant aux minima et aux maxima du spectre d'ordre zéro, et en plus trois maxima et deux minima nets. Pour ZOT, il apparaît également de nouveaux points caractéristiques avec cinq points d'annulation à 214, 246, 265, 287 et 299 nm. Le groupe des substances ne présentant qu'un maximum dans le spectre direct, voit en général également sa définition augmenter (Tableau II, figure 3). C'est tout particulièrement vrai pour AMO et LOX où les épaulements et bandes faibles sont nettement mis en évidence par l'existence des points d'annulation. Ces deux substances ont quatre points d'annulation identiques mais deux points supplémentaires à 243 et 250 nm pour LOX, permettent la différenciation. De plus, AMO présente un maximum net à 230 nm non donné par LOX. Pour DIB et CLOB, les points d'annulation sont, à 216 et 225 nm pour DIB, 214 et 229 nm pour CLOB. En outre, le spectre de DIB montre un maximum net à 245 nm non donné par CLOB (Tableau III). Par rapport au spectre direct, la dérivée première apporte une amélioration certaine pour l'identification de ces quatre substances: elle permet de différencier AMO de LOX, et DIB de CLOB. Enfin, pour les spectres mal définis, la dérivation apporte un gain important de précision (Tableau III, figure 4). Par exemple, pour CLOZ, on obtient cinq points d'annulation à 225, 254, 258, 287 et 295 nm, ce qui permet de connaître la position des maxima et des minima peu nets du spectre d'ordre zéro. CLOT
73 présente, de même, quatre points d'annulation à 252, 261, 293 et 302 nm. A ces valeurs s'ajoutent des maxima et des minima qui correspondent aux points d'inflexion du spectre direct. Étude des spectres en dérivée seconde La dérivée seconde accroît considérablement le nombre de points caractéristiques des spectres. En effet, à chaque bande du spectre d'origine correspondent trois bandes dans le spectre dérivé, soit deux maxima, un minimum et deux points d'annulation. Des bandes peu nettes en dérivée première sont mieux définies. On note ainsi que, pour FLU, on peut identifier aisément quinze points en dérivée seconde (contre six dans le spectre direct), pour ZOT onze points (contre quatre dans le spectre direct) (Tableau IV, figure 2). Le résultat est très intéressant pour les spectres n'ayant qu'un maximum (Tableau IV, figure 3). Dans le spectre en dérivée seconde, la localisation des épaulements du spectre direct devient particulièrement appréciable. Ainsi, l'épaulement vers 245 nm dans le spectre direct de DIB donne un minimum. Il en est de même pour les épaulements vers 233, 299 et 322 nm dans le spectre direct de AMO. LOX présente les mêmes minima que AMO, mais on peut différencier les deux substances : la courbe dérivée seconde de AMO montre quatorze longueurs d'onde caractéristiques contre dix pour LOX; on dénombre neuf points d'annulation pour AMO, six pour LOX et enfin, AMO présente un maximum net à 291 nm non donné par LOX. Quant à DIB et CLOB, leur différenciation est aussi possible. Leurs spectres sont mieux définis avec treize longueurs d'onde caractéristiques pour DIB, huit pour CLOB (contre deux dans le spectre direct ). DIB peut être caractérisé par son spectre en dérivée seconde avec six points d'annulation, celui de CLOB en comportant quatre, un maximum à 305 nm et un minimum net à 286 nm non présentés par CLOB (Tableau IV). Enfin, pour les spectres peu précis comme ceux de CLOZ et CLOT, la résolution améliorée des épaulements produit des minima supplémentaires. L'accroissement du nombre de maxima, de minima et de points d'annulation améliore très nettement la définition du spectre (Tableau IV, figure 4).
74 COCLUSIO L'augmentation du nombre de bandes obtenues par dérivation entraîne un accroissement corrélatif des points caractéristiques (maxima, minima et points d'annulation) de la courbe dérivée et ainsi, améliore la définition des spectres dans l'ultraviolet et le visible. La spectrophotométrie dérivée permet de prendre en compte la totalité du spectre et pas seulement le maximum donné par le spectre d'absorption. On peut, de cette façon, caractériser beaucoup plus précisément une substance que par les spectres classiques et apporter une solution à la séparation des produits dont les spectres sont proches. De plus, un seul appareil suffit pour l'identification et le dosage de la substance sans avoir recours à d'autres méthodes spectrophotométriques comme l'infrarouge. Cette méthode peut ainsi rendre de grands services pour l'établissement de dossiers d'autorisation de Mise sur le Marché. Elle pourrait servir pour effectuer des tests de pureté. Une étude plus approfondie pour en préciser les avantages comme éventuellement les écueils, fera l'objet d'une publication ultérieure. REMERCIEMETS ous remercions vivement les laboratoires qui nous ont permis de réaliser ce travail grâce à leur don généreux des principes actifs étudiés. RÉFÉRECES 1- O'Haver (T. C.) - Potential clinical applications of derivative and wavelength-modulation spectrometry.- Clin. Chem., 1979, 25, 1548-1553. 2- Traveset (J.), Such (V.), Gonzalo (R.), Gelpi (E.) - Derivative and graphical procedures for correction of irrelevant UV spectrophotometric absorption in changeable matrixes.- J. Pharm. Sci., 1980, 69, 629-633.
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