Chromatographie. 1 Généralités. Cours TB 2008-2009. 2008-2009 Chromatographie 1

1 Généralités Cours TB 2008-2009 2008-2009 Chromatographie 1

Introduction - ensemble de méthodes de séparation des constituants d un mélange - très employées (LA méthode de séparation actuelle) parce que : - séparation possible de n importe quel constituant - mise en œuvre possible à l échelle analytique, préparative et industrielle - seront envisagés * des généralités : définitions de la chromatographie et classification des méthodes chromatographiques * le principe des méthodes * les méthodologies et applications 2008-2009 Chromatographie 2

1 Généralités 1 1 Définition de la chromatographie : principes généraux 1 1 1 - Définition 1 1 2 - Caractères généraux 1 2 - Différents types de chromatographies 1 2 1 - Classification selon l état des phases 1 2 2 - Classification selon le principe des interactions entre soluté et phase stationnaire 1 2 3 - Classification selon le mode d immobilisation de la phase stationnaire 1 2 4 - Classification selon les modalités de migration de la phase mobile Chromatographie (1/2) 1 3 - Étude théorique et modélisation 1 3 1 - Modélisation intuitive 1 3 2 - Volumes de rétention 1 3 3 - Efficacité de la colonne et résolution 1 4 Divers temps d une chromatographie sur colonne 1 5 Divers temps d une chromatographie sur colonne 2 Principe et utilisation des méthodes de chromatographie 2 1 Chromatographie d adsorption 2 2 Chromatographie de partage 2 3 Chromatographie par échange d ions 2 4 Chromatographie par gel filtration 2 5 Chromatographie par interactions biospécifiques 2 6 Chromatographie par interactions hydrophobes 2 7 Chromatographie par chélation (IMAC = Immobilised metal affinity chromatography») 2008-2009 Chromatographie 3

(2/2) 3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne A - Chromatographie en phase liquide B - Chromatographie en phase gazeuse 3 1 2 Chromatographie de surface A Méthodologie générale B Différence 3 2 Applications 3 2 1 Séparation des acides aminés 3 2 2 Séparation de médicaments par HPLC 3 2 3 Séparation des protéines par FPLC 3 2 4 Autres applications 2008-2009 Chromatographie 4

1 1 Définition de la chromatographie : principes généraux 1 1 1 - Définition Chromatographie 1 Généralités Chromatographie : ensemble de méthodes qui assurent la séparation des constituants d un mélange en utilisant deux phases non miscibles : les divers constituants sont entraînés d'une manière différentielle par une phase mobile le long d'une phase stationnaire. Commentaires : «phase» : toute partie homogène d un système. trois états physiques d une phase : liquide, gazeux et solide. 2008-2009 Chromatographie 5

1 Généralités 1 1 Définition de la chromatographie : principes généraux 1 1 2 - Caractères généraux - la séparation de solutés se réalise entre deux phases : * une phase stationnaire, par définition immobile ; choisie pour sa grande affinité pour les divers solutés ; affinité quels mécanismes? cependant, affinité pas trop importante : les solutés doivent pouvoir être détachés * une phase mobile qui entraîne les divers solutés - en fait, les solutés se partagent entre la phase stationnaire et la phase mobile ; chromatographie = phénomène de partage généralisé 2008-2009 Chromatographie 6

Phase stationnaire Phase mobile Phase stationnaire Phase mobile Cmo Cst Cst Cmo K = ------- > 1 Schématisation 2008-2009 Chromatographie 7

1 Généralités 1 1 Définition de la chromatographie : principes généraux 1 1 2 - Caractères généraux - la séparation est liée à la vitesse propre d entraînement du soluté par la phase mobile : * les substances qui migrent le plus sont celles qui ont le plus d affinité pour la phase mobile, * les substances qui migrent le moins, celles qui ont le moins d affinité. - les solutés restent ou non dans la phase stationnaire * initialement, du point de vue historique, les solutés restaient dans la phase stationnaire ; ils étaient colorés et pouvaient être visualisés * vers la seconde guerre mondiale (Tiselius), on a pu commencer à pouvoir mettre en évidence des solutés incolores par colorimétrie (utilisation de la ninhydrine) : il était possible de laisser sortir les solutés de la colonne (chromatographie d élution). 2008-2009 Chromatographie 8

1 Généralités 1 1 Définition de la chromatographie : principes généraux 1 1 2 - Caractères généraux - la mise en oeuvre est possible : à l échelle laboratoire à l échelle préparative * à l échelle industrielle. 2008-2009 Chromatographie 9

1 Généralités 1 2 - Différents types de chromatographies 1 2 1 - Classification selon l état des phases 1 2 2 - Classification selon le principe des interactions entre soluté et phase stationnaire 1 2 3 - Classification selon le mode d immobilisation de la phase stationnaire 1 2 4 - Classification selon les modalités de migration de la phase mobile 2008-2009 Chromatographie 10

1 Généralités 1 2 - Différents types de chromatographies 1 2 1 - Classification selon l état des phases Phase mobile Phase station. chromatographie liquide - liquide chromatographie liquide - solide CPL chr. phase liquide chromatographie gaz - liquide. Chromatographiegazsolide CPG chr. phase 2008-2009 Chromatographie 11 gazeusedgazeuse

1 Généralités 1 2 - Différents types de chromatographies 1 2 2 - Classification selon le principe des interactions entre soluté et phase stationnaire - ADS0RPTION : liaisons de faible énergie (liaisons polaires,...) assurant la fixation des solutés à la phase stationnaire - PARTAGE : solubilisation des solutés dans une phase stationnaire liquide ; ils sont amenés à se partager entre la phase stationnaire et la phase mobile dans laquelle ils sont moins solubles; - ECHANGE D'IONS : liaisons ioniques entre charges électriques portées par les solutés et par la phase stationnaire (opposées) - GEL FILTRATION : pas de liaisons : diffusion / exclusion de solutés dans la phase stationnaire poreuse (chromatographie d'exclusion DIFFUSION) - INTERACTIONS BIOSPECIFIQUES : interactions biospécifiques (enzyme - substrat, antigène anticorps,...) entre les solutés et la phase stationnaire porteuse d un ligand (appliquées aux protéines). - INTERACTIONS HYDROPHOBES : liaisons hydrophobes entre la phase stationnaire et les solutés (nécessite de la présence de parties hydrophobes dans la structure du soluté) (s'applique aux protéines) - CHELATION : liaisons datives entre un métal divalent fixé sur un support (phase stationnaire) et les solutés porteurs de doublets libres (cas classique : His des protéines). 2008-2009 Chromatographie 12

1 Généralités 1 2 - Différents types de chromatographies 1 2 3 - Classification selon le mode d immobilisation de la phase stationnaire La phase stationnaire immobilisée de 2 manières différentes : - soit étendue sur une surface plane : chromatographie de surface * la chromatographie sur papier * la chromatographie sur couche mince - soit à l'intérieur d'une colonne : chromatographie sur colonne. phase stationnaire en suspension dans un solvant (tampon) maintenue dans une colonne introduction en tête de colonne de l'échantillon à analyser (au moyen d'un injecteur) détection des solutés (grâce à un détecteur) collection de fractions (collecteur de fractions). 2008-2009 Chromatographie 13

1 2 - Différents types de chromatographies 1 2 4 - Classification selon les modalités de migration de la phase mobile Chromatographie 1 Généralités A - Chromatographie par élution Sortie des solutés de la phase stationnaire : c'est le cas de la chromatographie sur colonne. ELUANTS : solvants (tampons ) (le plus souvent mélange) qui réalisent la rupture différentielle des interactions entre phase stationnaire et solutés élution en faisant varier la composition du solvant (tampon) utilisé : force ionique, polarité par exemple soit d'une manière brusque (gradient discontinu) soit d'une manière continue (gradient continu). caractérisation des solutés dans l'éluat. B - Chromatographie par déplacement Maintien des solutés dans la phase stationnaire : ils se déplacent dans la phase stationnaire c'est le cas des chromatographies de surface (papier et couche mince) où on révèle les solutés encore présents dans la phase stationnaire. 2008-2009 Chromatographie 14

1 Généralités 1 3 - Étude théorique et modélisation 1 3 1 Modélisations 1 3 2 Le pic de chromatographie idéal 1 3 3 - Efficacité de la colonne et résolution 2008-2009 Chromatographie 15

1 Généralités 1 3 - Étude théorique et modélisation 1 3 1 Modélisations A Modélisation intuitive - série de barques sans moteur sur une rivière. - courant est supposé constant, c est à dire qu il est identique que l on soit au bord de la rive ou au milieu. - les barques transportent des passagers d une ligne marquée «départ» à une ligne marquée «arrivée». - les barques, au gré des passagers, sont susceptibles de s arrêter sur la berge durant des temps variables. 2008-2009 Chromatographie 16

Au temps 0,.. Elles Chromatographie 1 Généralités 1 3 - Étude théorique et modélisation 1 3 1 Modélisations A Modélisation intuitive Au temps zéro 1 Modèle de barques sur une rivière : les barques attachées sur la ligne de départ Départ libérées en même temps, au temps zéro Arrivée Courant 2008-2009 Chromatographie 17

1 Généralités 1 3 - Étude théorique et modélisation 1 3 1 Modélisations A Modélisation intuitive Départ Arrivée - avancée, dans le courant, à la même vitesse - différence de durée du trajet entre les lignes de départ et celle d arrivée, liée aux arrêts plus ou moins longs. Départ Arrivée 2008-2009 Chromatographie 18

1 Généralités 1 3 - Étude théorique et modélisation 1 3 1 Modélisations A Modélisation intuitive Départ Arrivée - temps passé à naviguer t O identique pour toutes les barques - temps départ - arrivée t R différents du fait de la durée des arrêts effectués t R.. t R = t O + t' R t R : temps mis par les barques pour atteindre l'arrivée t O : temps passé à naviguer t R : temps des arrêts sur la rive. 2008-2009 Chromatographie 19

1 Généralités 1 3 - Étude théorique et modélisation 1 3 1 Modélisations A Modélisation intuitive 2 Retour à la chromatographie barques = les différents solutés ; berge = la phase stationnaire ; la rivière = la phase mobile. t R = t o + t R (1) t R : temps correspondant à la sortie du soluté de la colonne : temps de rétention dans la colonne t o : temps passé dans la phase mobile = temps mort t R : temps passé dans la phase stationnaire. De même aucun soluté ne peut sortir avant le temps t o, temps qui correspond au transport dans la phase mobile. t R est le temps de rétention réduit du temps mort, c est à dire t R - t o 2008-2009 Chromatographie 20

1 Généralités 1 3 - Étude théorique et modélisation 1 3 1 Modélisations B Analogie chromatographie / distillation Chromatographie de partage : Martin et Synge 1941 Liquide appauvri en soluté volatil Vapeur enrichie en soluté volatil À chaque niveau, partage du soluté - entre la phase liquide et la phase gazeuse (distillation) - entre la phase stationnaire et la phase mobile 2008-2009 Chromatographie 21 Colonne à plateau Colonne de chromatographie

1 Généralités 1 3 - Étude théorique et modélisation Liquide appauvri en soluté volatil 1 3 1 Modélisations B Analogie chromatographie / distillation Chromatographie de partage : Martin et Synge 1941 Vapeur enrichie en soluté volatil Plateaux théoriques Plus une colonne comporte de plateaux (théoriques), meilleure sera la séparation Ou encore, plus la hauteur d un plateau sera faible, meilleure sera la séparation Colonne à plateau 2008-2009 Chromatographie 22

2008-2009 Chromatographie 23

1 Généralités 1 3 - Étude théorique et modélisation 1 3 1 Modélisations B Analogie chromatographie / distillation Remarque : représentation schématique d une chromatographie C 0 t R 2008-2009 Chromatographie 24 t R

1 Généralités 1 3 - Étude théorique et modélisation 1 3 2 Le pic de chromatographie idéal 2008-2009 Chromatographie 25

1 Généralités 1 3 - Étude théorique et modélisation 1 3 3 - Efficacité de la colonne et résolution séparation caractérisée par le nombre effectif de plateaux théoriques N eff. Plus ce nombre est élevé, meilleure est la séparation. On démontre que : L ou A Efficacité de la colonne t R 2 N eff = ------- = --------- σ 2 H H = L / N avec L, longueur de la colonne (en cm) H, hauteur équivalente d un plateau théorique (en cm) (HEPT) σ t2, variance du pic (en unités de temps) 2008-2009 Chromatographie 26 1 1,2 1 0,6 0,5 t R ϖ 1/2 ϖ Pic gaussien σ σ σ = ϖ1/2 / (8 Ln 2 ) 1/2 t R

1 Généralités 1 3 - Étude théorique et modélisation 1 3 3 - Efficacité de la colonne et résolution A Efficacité de la colonne N eff peut également être calculé à partir de t R et de ω, ce dernier paramètre étant déterminé depuis l intersection des tangentes au point d inflexion avec la ligne de base. N eff = 16 t R2 / ω 2 Ainsi, pour une valeur de H de 12,5 µm et une longueur de 25 cm, on arrive à 15000-20000 plateaux théoriques effectifs. Souvent il est plus facile de mesurer la largeur du pic à mi hauteur ω 1/2 : Comme σ = ω 1/2 / (8 ln 2) 1/2 L t 2 R N eff = --------- = 5,54. ------------ H ω 2 1/2 2008-2009 Chromatographie 27 1 1,2 1 0,6 0,5 t R ϖ 1/2 ϖ Pic gaussien σ σ σ = ϖ1/2 / (8 Ln 2) 1/2 t R

1 Généralités 1 3 - Étude théorique et modélisation 1 3 4 - Efficacité de la colonne et résolution A Efficacité de la colonne Calculer de H à partir de l équation de Van Deemter (CPG initialement). H = A + B / u + C. U 8. k. e 2 H = 2. d P. λ + 2. τ. D M / u + ---------------------------. u 2. (1 + k ) 2. D S Η : hauteur d un plateau théorique λ : régularité du remplissage d p : diamètre des particules τ : facteur de tortuosité D M : : diffusivité de l échantillon dans la phase mobile D S : : diffusivité de l échantillon dans la phase stationnaire k : facteur de capacité e : épaisseur de la phase stationnaire (grains) u : vitesse linéaire de déplacement de la phase mobile 2008-2009 Chromatographie 28

1 Généralités 1 3 - Étude théorique et modélisation 1 3 4 - Efficacité de la colonne et résolution Calculer de H à partir de l équation de Van Deemter (CPG initialement). H = A + B / u + C. u 8. k. e 2 H = 2. d P. λ + 2. τ. D M / u + ---------------------------. u Hauteur d un plateau théorique A Efficacité de la colonne 2. (1 + k ) 2. D S Α : diffusion de Eddy : facteur correspondant aux chicanes, aux chemins différents entre les molécules : diffusion turbulente B : facteur correspondant à la diffusion normale du liquide pendant l analyse : diffusion longitudinale C : facteur correspondant à la diffusion dans la phase stationnaire : résistance au transfert de masse 2008-2009 Chromatographie 29

1 Généralités 1 3 - Étude théorique et modélisation 1 3 4 - Efficacité de la colonne et résolution Calculer de H à partir de l équation de Van Deemter (CPG initialement). H = A + B / u + C. u Α : facteur correspondant aux chicanes, aux chemins différents entre les molécules : diffusion turbulente A Efficacité de la colonne B : facteur correspondant à la diffusion normale du liquide pendant l analyse : diffusion longitudinale C : facteur correspondant à la diffusion dans la phase stationnaire : résistance au transfert de masse 2008-2009 Chromatographie 30

1 Généralités 1 3 - Étude théorique et modélisation 1 3 4 - Efficacité de la colonne et résolution Calculer de H à partir de l équation de Van Deemter (CPG initialement). H = A + B / u + C. u Hauteur d un plateau théorique A Efficacité de la colonne B/u Η C.u Conclusions : - existence d un débit optimum pour obtenir une hauteur minimale d un plateau théorique (nombre maximal de plateaux théoriques) - pour éviter la diffusion (élargissement des pics), il faut grains de faible diamètre (mais pertes de charge) - importance du remplissage de la colonne. 2008-2009 Chromatographie 31 u A

1 Généralités 1 3 - Étude théorique et modélisation 1 3 4 - Efficacité de la colonne et résolution B Résolution La résolution est, pour une colonne, la capacité de séparation de deux solutés. V R1 - V R2 Rs = 2 --------------------- ω 1 + ω 2 ϖ1 V R1 ϖ2 V R2 V R 2008-2009 Chromatographie 32

1 Généralités 1 4 Divers temps d une chromatographie sur colonne - Mise en contact des solutés avec la phase stationnaire (solutés susceptibles d être fixés et solutés non susceptibles d être fixés) : charge de la colonne - passage d une phase mobile 1 : sortie de la colonne (élution) des solutés non susceptibles d être fixés et obtention de l éluat 1 (filtrat) - passage d une phase mobile 2 : éluant vrai qui rompt les liaisons entre soluté et phase stationnaire (élution vraie) et obtention de l éluat 2. V R 2008-2009 Chromatographie 33

2008-2009 Chromatographie 34

1 Généralités 1 5 Divers types de mise en œuvre d une chromatographie en phase liquide - basse pression - moyenne / haute pression ; actuellement chromatographie haute performance (CLHP ou HPLC) V R 2008-2009 Chromatographie 35

2 Principes des méthodes de chromatographie Cours TB 2008-2009 2008-2009 Chromatographie 36

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 1 Chromatographie d adsorption 2 2 Chromatographie de partage 2 3 Chromatographie par échange d ions 2 4 Chromatographie par gel filtration 2 5 Chromatographie par interactions biospécifiques 2 6 Chromatographie par interactions hydrophobes 2 7 Chromatographie par chélation 3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne A - Chromatographie en phase liquide B - Chromatographie en phase gazeuse 3 1 2 Chromatographie de surface A Méthodologie générale B Différence 3 2 Applications 3 2 1 Séparation des acides aminés 3 2 2 Séparation de médicaments par HPLC 3 2 3 Séparation des protéines par FPLC 3 2 4 Autres applications 2008-2009 Chromatographie 37

2 Principe et utilisation des méthodes de chromatographie 2 1 Chromatographie d adsorption 2 1 1 Principe : interaction 2 1 2 Phase stationnaire 2 1 3 Phase mobile 2 1 4 Conditions de fixation et d élution 2 1 5 Utilisation 2 2 Chromatographie de partage 2 3 Chromatographie par échange d ions 2 4 Chromatographie par gel filtration 2 5 Chromatographie par interactions biospécifiques 2 6 Chromatographie par interactions hydrophobes 2 7 Chromatographie par chélation (IMAC = Immobilised metal affinity chromatography») 2008-2009 Chromatographie 38

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 1 Chromatographie d adsorption 2 1 1 Principe Fixation, en général, par des liaisons liées à la polarité Ο δ δ+ Η Η δ Ο Support solide δ+ Support solide Adsorption Désorption = remplacement par une autre molécule 2008-2009 Chromatographie 39

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 1 Chromatographie d adsorption 2 1 2 Phase stationnaire, Solide insoluble, finement divisé, "actif " (capable de fixer des solutés) - polaire : gel de silice (Kieselguhr), alumine : ces supports sont à «activer». - non polaire : carbone actif - sels de calcium : phosphate tricalcique, hydroxyapatite pour les protéines 2 1 3 Phase mobile Liquide (CPL) ou gazeuse (CPG) Réalise la rupture des liaisons soluté - phase stationnaire (phénomène de désorption) 2008-2009 Chromatographie 40

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 1 Chromatographie d adsorption 2 1 4 Conditions de fixation et d élution - Cas des liaisons polaires : par ordre d'adsorption croissante, esters, cétones et aldéhydes, alcools et les amines, acides et les bases Utilisation de gradients de solvants organiques polaires - Cas des protéines : gradient croissant de tampon phosphate 2008-2009 Chromatographie 41

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 1 Chromatographie d adsorption 2 1 5 Utilisation - utilisée pour la séparation des molécules organiques de masse moléculaire inférieure à 1000 g.mol -1 dans le domaine pharmaceutique et alimentaire : * fixation des colorants des vins et jus de fruits qui pourraient gêner telle ou telle méthode analytique. (phase liquide, échelle analytique) * fixation de substances pyrogènes existant dans une solution destinée à l usageparentéral. (phaseliquide, échelle industrielle) * séparation des acides gras (méthylés) (phase gazeuse, échelle analytique). -gel d'hydroxyapatite et le phosphate tricalcique utilisés pour la séparation des protéines ; techniques concurencées par la chromatographie d interactions hydrophobes -- mise en œuvre en basse presioon, CLHP, et chromatographie de surface 2008-2009 Chromatographie 42

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 1 Chromatographie d adsorption Type d'interaction Fixation de solutés sur un support solide par ADSORPTION - Liaisons polaires (le plus souvent) - Liaisons non polaires (cas du carbone actif) Phase stationnaire Phase mobile Conditions d'élution Mise en œuvre et Applications Solide insoluble, finement divisé, "actif " capable de fixer des solutés) - polaire : gel de silice (Kieselguhr), alumine Ces supports sont à activer - non polaire : carbone actif - sels de calcium : phosphate tricalcique, hydroxyapatite pour les protéines Liquide (CPL) ou gazeuse (CPG) Réalise la rupture des liaisons soluté - phase stationnaire (phénomène de désorption) - Cas des liaisons polaires : par ordre d'adsorption croissante, on a les esters, puis les cétones et aldéhydes, puis les alcools et les amines et enfin les acides et les bases Utilisation de gradients de solvants organiques polaires - Cas des protéines : gradient croissant de tampon phosphate - Sur colonne (CPL, CPG) - Sur couche mince (CCM) - Molécules organiques (M < 1000 g.mol -1 ) comme métabolites, médicaments - Séparation d'hydrocarbures sur carbone actif - Protéines : recherche (ancien) 2008-2009 Chromatographie 43

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 2 Chromatographie de partage 2 2 1 Principe 2 2 2 Supports 2 2 3 Conditions de fixation et d élution 2 2 4 Utilisation 2008-2009 Chromatographie 44

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 2 Chromatographie de partage 2 2 1 Principe Sol Sol Support solide Phase stationnaire Phase mobile phases normales Solubilisation dans une phase liquide polaire (adsorbée sur un support solide) phases inverses Solubilisation dans une phase liquide apolaire adsorbée sur un support ou fixation sur des radicaux hydrophobes fixés sur un support solide 2008-2009 Chromatographie 45

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 2 Chromatographie de partage φ n o r m a l e s Solubilisation dans une phase liquide (adsorbée sur un support solide) Liquide polaire : eau, par exemple Solvants organiques peu polaires Gradient de polarité croissante - Sur colonne (CPL, CPG) - Sur couche mince (CCM) - Petites molécules polaires comme les acides aminés φ i n v e r s e s Solubilisation dans une phase liquide adsorbée sur un support ou radicaux hydrophobes fixés sur un support solide - Liquide apolaire plus ou moins visqueux - Chaînes hydrocarbonées en C 8, C16, C18, phényl, fixées sur de billes de silice, agarose, résine ou verre Solvants organiques plus polaires que la phase stationnaire Gradient de polarité décroissante - Sur colonne (CPL, CLHP) - Petites molécules apolaires, comme des dérivés d'acides aminés 2008-2009 Chromatographie 46

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 2 Chromatographie de partage 2 2 2 Supports - terme "support" à préciser : matériau inerte qui sert de fixateur (inerte) à la phase stationnaire liquide. Il permet à cette phase stationnaire d être en un état physique liquide. = support à bien distinguer ici de la phase stationnaire. - supports = solides finement divisés qui présentent une très grande surface, ceci afin de retenir dans un petit volume une grande quantité de phase liquide ; rétention énergique de phase stationnaire, sans interaction avec les solutés ; les propriétés d adsorption doivent être totalement masquées. 2008-2009 Chromatographie 47

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 2 Chromatographie de partage 2 2 2 Supports - utilisation possible de la plupart des phases stationnaires de la chromatographie d adsorption sous forme poreuse ou pelliculaire. gel de silice très souvent employé car peut retenir jusqu à 70 % de son poids d eau ; grande capacité et bonne rétention des solvants mais garde certaines propriétés d adsorption.. Terre de diatomées, autre support siliceux, naturel (squelette siliceux d infusoires ou Kieselguhr ou célite) ; peut retenir de grandes quantités de solvant, même polaires. 2008-2009 Chromatographie 48

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 2 Chromatographie de partage 2 2 2 Supports - billes de verres ; billes de silice ; peuvent faire l objet de greffage de groupements fonctionnels facilitant la fixation de la phase stationnaire : réalisation d une «silanation», c est à dire traitement par des dérivés permettant la fixation de groupements hydrophobes (C6, C8, C16 et C18) = utilisation en phases inverses. - sont également utilisables, la poudre de cellulose et un certain nombre de polymères synthétiques dérivés du vinylbenzène. 2008-2009 Chromatographie 49

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 2 Chromatographie de partage 2 2 3 Les phases stationnaires et mobiles A - Les phases stationnaires 1 - Chromatographie en phases normales -phase stationnaire liquide (assez) polaire : classiquement (Martin et Synge) des solutions aqueuses alcalines, acides ou tamponnées, de méthanol ou d éthanol - simplement eau, - aussi de substances visqueuses : étheroxydes rendus très polaires par la présence de groupements hydroxyles ou nitrile : éthers, glycols, polyéthylène glycols, ββ oxydipropionitrile. 2008-2009 Chromatographie 50

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 2 Chromatographie de partage 2 2 3 Les phases stationnaires et mobiles A - Les phases stationnaires 2 - Chromatographie en phases inverses - phase stationnaire peu polaire ou apolaire -chromatographie en phase gazeuse : polyesters de glycols, de polyethers de glycols, de silicones, de carbures saturés ; - chromatographie en phase liquide : chaînes alkyles en C 8 et C 18 greffées sur de la silice - d une manière générale, phases stationnaires préparées par imprégnation (par exemple, en présence de solvant volatil) ou par greffage (utilisation des dérivés halogénés du silane). 2008-2009 Chromatographie 51

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 2 Chromatographie de partage 2 2 3 Les phases stationnaires et mobiles B - Les phases mobiles - choix et conditions d emploi d une phase mobile : mêmes considérations générales que celles de la chromatographie d adsorption. : - pouvoir solvant et inertie chimique vis à vis des solutés - compatibilité avec les systèmes de détection - inertie chimique et insolubilité vis à vis dela phasestationnaire - Attention : une non miscibilité rigoureuse difficile à obtenir : saturation des phases les unes dans les autres par des contacts préalables : mélange des solvants dans une ampoule à décanter et séparation ultérieure.ou, en CLHP, passage du solvant dans une précolonne, avant le système d injection, chargée de phase stationnaire. 2008-2009 Chromatographie 52

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 2 Chromatographie de partage 2 2 3 Les phases stationnaires et mobiles B - Les phases mobiles -En chromatographie de partage phases normales, phase stationnaire = eau et phase mobile = butanol, d alcool benzylique, de chloroforme ou de toluène. En CLHP, on utilise les pentane, cyclohexane, hexane (purs ou additionnés de chloroforme), dichlorométhane, tétrahydrofurane, chloroforme, dioxanne, éther butylique, nitrométhane, hexane méthanol. - En chromatographie en phases inversées, phase mobile (plus) polaire = eau, méthanol (CH 3 -OH), acétonitrile (CH 3 -CN) ou mélange de ces solvants. 2008-2009 Chromatographie 53

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 2 Chromatographie de partage 2 2 4 Utilisation - utilisée sur colonne, sur papier, sur couche mince et en phase gazeuse. - sert à la séparation de molécules organiques de masse moléculaire inférieure à 1000 g.mol -1 - séparation d antibiotiques, des substances anticancéreuses, des métabolites, de substances prohibées (drogues, substances «dopantes»,.. ) - Phases normales (composés polaires)ou phases inverses (composés plus hydrophobes) - Remarque : une variante, la chromatographie par (de) paires d ions (voir plus loin) R 1 R 2 + + R 3 R 4 Échantillon moins Complexe hydrophobe hydrophobe 2008-2009 Chromatographie 54 R 1 R 2 + R 3 R 4

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 3 Chromatographie par échange d ions 2 3 1 Principe 2 3 2 Supports 2 3 3 Conditions de fixation et d élutions 2 3 4 Utilisation 2008-2009 Chromatographie 55

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 3 Chromatographie par échange d ions 2 3 1 Principe - solutés liés à la phase stationnaire par des liaisons ioniques phase stationnaire = macromolécules échangeuses d'ions, solide -phase mobile = tampon de ph et de force ionique définis : fait cesser les interactions entre solutés et phase stationnaire 2008-2009 Chromatographie 56

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 3 Chromatographie par échange d ions 2 3 1 Principe Mélange à séparer + + + + + + + + + + + + + + + Support (Su) Groupement charge ici positiveπορτευρ δε Λιβ ρατιον δε λα πηασε σολιδε (δ σορπτιον) Extraction - purification des enzymes 2005-2006 57

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 3 Chromatographie par échange d ions 2 3 1 Principe + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Μ λανγε σ παρερ αυ χονταχτ δε λα πηασε στατιονναιρε Φιξατιον δε λα προτ ινε ( αδσορπτιον ) αυ σενσ λαργε Extraction - purification des enzymes 2005-2006 Λιβ ρατιον δε λα πηασε σολιδε (δ σορπτιον) par augmentation du ph 58

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 3 Chromatographie par échange d ions 2 3 2 La phase stationnaire : les échangeurs d ions A - Les groupements fonctionnels : les 2 types d'échangeurs Selon le type de charge de l ion échangé, et la charge de l échangeur, on distingue : - échangeurs d anions - échangeurs de cations. 1 - les échangeurs d'anions, échangeurs sous forme cationique Su-A + Ye - + Xs - <====> Su-A + Xe - + Ys - support chargé + soluté soluté fixé Ye - = contre ion 2008-2009 Chromatographie 59

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 3 Chromatographie par échange d ions 2 3 2 La phase stationnaire : les échangeurs d ions A - Les groupements fonctionnels : les 2 types d'échangeurs 1 - les échangeurs d'anions, échangeurs sous forme cationique Exemples de groupements fonctionnels porteurs de charge positive : en général d amines I, II, III, IV groupements les plus classiques pour les protéines : groupements DEAE et TEAE. - CH 2 - CH 3 DEAE, Su O- CH 2 - CH 2 - N - CH 2 - CH 3 (échangeur faible, non ionisé à certains ph, ph acides) - CH 2 - CH 3 pk A = 9,5 - CH 2 - CH 3 Su O- CH 2 - CH 2 - N + H+ <=====> S O- CH 2 - CH 2 - N + - H - CH 2 - CH 3 - CH 2 - CH 3 - CH 2 - CH 3 TEAE, Su O- CH 2 - CH 2 - N + - CH 2 - CH 3 - CH 2 - CH 3 (échangeur fort, ionisé à tous les ph) 2008-2009 Chromatographie 60

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 3 Chromatographie par échange d ions 2 3 2 La phase stationnaire : les échangeurs d ions A - Les groupements fonctionnels : les 2 types d'échangeurs 2 - Les échangeurs de cations, sous forme anionique Su-A - Ye + + Xs + <==========> Su-A - Xe + + Ys + support chargé - soluté soluté fixé Ye + = contre ion 2008-2009 Chromatographie 61

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 3 Chromatographie par échange d ions ECH ANG E D'IO NS Fixation de solutés par des liaisons ioniques entre charges opposées (faiblement énergétique) Billes de composés organiques naturels (dextrane, cellulose, ), synthétiques (polyacrylamide, résines, ) ou minéraux (verre, silice, ) avec greffage de groupements ionisés ou ionisables échangeant des anions ou des cations - Anions : DEAE, AE, - Cations : CM, SP, Liquide : tampons (Tris, phosphate, citrate, ) de ph et de µ donnés variant lors de l'élution Gradient de ph (discontinu) et / ou de force ionique croissante (discontinu ou continu) - Sur colonne (CPL, CLHP) - Séparation d'ions (acides aminés, ) et de macroions (protéines, acides nucléiques, ) 2008-2009 Chromatographie 62

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 3 Chromatographie par échange d ions 2 3 2 La phase stationnaire : les échangeurs d ions A - Les groupements fonctionnels : les 2 types d'échangeurs 2 - les échangeurs de cations, sous forme anionique Exemples de groupements fonctionnels : -SO 3 -, - COO -, SP, CM SP : sulfopropyle Su - CH 2 - CH 2 - CH 2 -SO 3 - CM carboxyméthyle Su - CH 2 COO- Remarque : certains échangeurs avec les 2 types.(en particulier pour la désionisation de l eau) 2008-2009 Chromatographie 63

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 3 Chromatographie par échange d ions 2 3 2 La phase stationnaire : les échangeurs d ions B - Les supports 1 - Supports organiques a - Polymères synthétiques b - Polymères naturels α - Dérivés du dextrane ß - Dérivés de la cellulose γ - Dérivés de l agarose δ - Dérivés mixtes 2 - Supports minéraux Document 2008-2009 Chromatographie 64

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 3 Chromatographie par échange d ions 2 3 3 Conditions de fixation et d élutions A - Fixation - choix de la nature (forme anionique ou cationique) de l échangeur utilisé - ph tel que les solutés se fixent - fixation en présence d un tampon de faible force ionique B - Elution - modification des interactions électrostatiques entre soluté et phase stationnaire : changement de ph et/ou de force ionique. - en discontinu ou en continu. 2008-2009 Chromatographie 65

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 3 Chromatographie par échange d ions 2 3 4 Utilisation - utilisée pour la séparation de toutes substances porteuses de charges électriques (acides aminé, protéines, ) - particulièrement important pour les protéines (supports hydrophiles). 2008-2009 Chromatographie 66

Extraction - purification des enzymes 2005-2006 67

Charge + des protéines (cations) : séparation sur échangeur - (sur échangeur de cations) CM Charge - des protéines (anions) : séparation sur échangeur + (sur échangeur d anions) DEAE Extraction - purification des enzymes 2005-2006 68

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 4 Chromatographie par gel filtration 2 4 1 Principe 2 1 2 Supports 2 1 3 Conditions de fixation et d élutions 2 1 4 Utilisation 2008-2009 Chromatographie 69

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 4 Chromatographie par gel filtration - également appelée chromatographie de perméation de gel, chromatographie d'exclusion - diffusion - origine : mise sur le marché d'un gel hydrophile de dextrane artificiellement réticulé, le SEPHADEX TR, suite aux travaux en 1959 par PORATH et FLORKIN. 2008-2009 Chromatographie 70

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 4 Chromatographie par gel filtration Type d'interaction Phase stationnaire Phase mobile Conditions d'élution Mise en œuvre et Applications GEL FILT RAT ION ABSENCE d'interactions au sens strict Diffusion plus ou moins grande dans un support poreux : les molécules les plus grosses sont éluées les premières Liquide contenu dans les billes poreuses dont la matière constitue le support Les supports sont des composés organiques naturels (dextrane, agarose, ), synthétiques (polyacrylamide, résines, ) ou des composés minéraux (verre ou silice) Liquide : tampons (Tris, phosphate, citrate, ) de ph et µ donnés Simple percolation de la colonne par un tampon adéquat, sans modification au cours de l'élution (élution isocratique) - Sur colonne (CPL, CLHP) - Séparation de macromolécules (ADN, protéines, ) selon leur taille - Détermination de M par la représentation : K av = - log M + b 2008-2009 Chromatographie 71

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 4 Chromatographie par gel filtration 2 4 1 Principe - pas de liaison entre soluté et phase stationnaire = pas, ici, de "rétention«- comportement différent des molécules du fait de leur diffusion ou non à l intérieur d une matrice poreuse = tamisage moléculaire inverse dans un gel = sortie en premier des grosses molécules, exclues des billes d'un gel, ; en dernier, les petites qui ont diffusé = SEPARATION du fait de cette diffusion plus ou moins grande Remarques :. - séparation selon la taille des molécules d un type de forme déterminé (en général forme globulaire) - possibilité de déterminer les masses moléculaires. 2008-2009 Chromatographie 72

2008-2009 Chromatographie 73

v e v o v t 2008-2009 Chromatographie 74

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 4 Chromatographie par gel filtration 2 4 1 Principe A - La phase stationnaire - constituée de grains de gel pourvus de pores de diamètres variables, ceci dans une gamme permettant la diffusion des solutés de masses moléculaires déterminées. - pores de plus faible diamètre (diamètre minimal) - pores de plus grand diamètre (diamètre maximal) - ensemble de pores de diamètres intermédiaires - un support de gel filtration ne permet la séparation que dans une gamme déterminée de masses moléculaires. 2008-2009 Chromatographie 75

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 4 Chromatographie par gel filtration 2 4 1 Principe B -La phase mobile : - ne fait pas cesser des interactions entre solutés et phase stationnaire qui n existent pas - rôle : simplement à assurer le déplacement linéaire des solutés. -simple liquide qui passe à travers la phase stationnaire = liquide qui permet de garder les molécules dans leur état natif, c est à dire d un simple tampon dans le cas des protéines Copie 2008-2009 Chromatographie 76

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 4 Chromatographie par gel filtration 2 4 2 Supports - par définition, poreux - conditionnés sous forme de billes, pour faciliter le passage de la phase mobile, c est à dire diminuer les pertes de charge et éviter le colmatage - peuvent être organiques, minéraux ou mixtes. Documents 2008-2009 Chromatographie 77

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 4 Chromatographie par gel filtration 2 4 3 Conditions de séparation A - Description schématique du phénomène Supposons le gel immobilisé dans une colonne. Le comportement des solutés se divise en 3 classes de comportements : 1 - Les grosses molécules 2 - Les petites molécules 3 - Les molécules de taille intermédiaire Conclusion : Il y a pour chaque gel un domaine de masse moléculaire : - en dessous duquel il n'y a aucune séparation - au dessus duquel il n'y a aucune séparation - la séparation ne se réalise que dans un domaine de masse moléculaire spécifique du gel considéré (en fait, il correspond au diamètre maximum (moyen) et minimum (moyen) des pores). 2008-2009 Chromatographie 80

Mélange initial CONSTITUANTS NON SEPARES CONSTITUANTS NON SEPARES 1 - Les grosses molécules 2 - Les petites molécules 3 - Les molécules de taille intermédiaire Conclusion : Seule séparation 2008-2009 Chromatographie 81

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 4 Chromatographie par gel filtration 2 4 3 Conditions de fixation et d élution B - Quantification ; détermination des masses moléculaires 1 - Les divers volumes a Description : définition des divers volumes α - Vo : volume mort Aucune substance ne peut sortir avant ce volume : Vo, volume mort de la colonne Il correspond au volume de phase mobile entre les grains du gel ß - Vt : volume total de la colonne Vt = volume du soluté correspondant à la percolation totale de la colonne (extérieur et intérieur des billes) γ - Ve : volume d'élution ; valeur intermédiaire entre vo et vt 2008-2009 Chromatographie 82

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 4 Chromatographie par gel filtration 2 4 3 Conditions de fixation et d élution B - Quantification ; détermination des masses moléculaires 1 - Les divers volumes b Interprétation de ces divers volumes Vo : volume entre les grains Ve : volume d'élution de la substance étudiée V T : volume total, c est à dire somme des volume mort Vo, volume des grains Vg, volume et volume de liquide dans les grains Vs. REMARQUES : - Vo et VT se retrouvent dans tous les types de chromatographie (cf caractères généraux) - Vo et VT sont caractéristiques d une colonne remplie d une phase stationnaire donnée, percolée avec une phase mobile à un débit donné ; il y a changement de ces divers volumes caractéristiques d'une colonne selon les conditions : débit de phase mobile, pression, phase mobile, température d où nécessité de l utilisation d un paramètre caractérisant la diffusion d un soluté indépendamment de ces conditions ce sera K D. 2008-2009 Chromatographie 83

Approche de la valeur de V s à partir de l expression du volume total de la colonne V t = V o + V s + V g V s V g Vo 2008-2009 Chromatographie 84

CONSTITUANTS NON SEPARES CONSTITUANTS NON SEPARES v e v o v t 1 - Les grosses molécules 2 - Les petites molécules 3 - Les molécules de taille intermédiaire Conclusion : Séparation 2008-2009 Chromatographie 85

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 4 Chromatographie par gel filtration 2 4 3 Conditions de fixation et d élution B - Quantification ; détermination des masses moléculaires 2 - Le coefficient de diffusion K D, le coefficient de diffusion accessible : K av a - Le coefficient de diffusion K D α - Définition du coefficient de diffusion K D coefficient de diffusion K D d un soluté : rapport du volume de soluté supérieur à V o (soit V e - V o ) sur le volume contenu dans les grains V s. V e - V o K D = ---------------- V s 2008-2009 Chromatographie 86

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 4 Chromatographie par gel filtration 2 4 3 Conditions de fixation et d élution B - Quantification ; détermination des masses moléculaires a - Le coefficient de diffusion K D ß - Propriétés du coefficient de diffusion On démontre que K D = ß - α. log MM, d où K D 1 0 Log MM 2008-2009 Chromatographie 87

K D 1 Mais ceci concerne K D et log MM, avec 0 Log MM V e - V o K D = ---------------- V s Or, pour déterminer K D, il faut connaître V s. ce qui n est pas le cas.. d où une approche de la valeur de V s, par exemple, à partir de l expression du volume total de la colonne 2008-2009 Chromatographie 88

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 4 Chromatographie par gel filtration 2 4 3 Conditions de fixation et d élution B - Quantification ; détermination des masses moléculaires b - Le coefficient de diffusion accessible K AV V t = V o + V s + V g d où V s = V t - V o - V g Or V g est négligeable. On peut donc admettre que V s = V t - V o détermination du coefficient de diffusion; alors appelé coefficient de diffusion accessible... Kav (available = accessible) V e - V o K av = --------------- V t - V o 2008-2009 Chromatographie 89

v o v e v t Log kda v Copie 2008-2009 Chromatographie 90 K av

Courbes théoriques Courbes expérimentales K AV log MM 1 0 log MM 0 1 K AV et Log MM = - c. V e + d 2008-2009 Chromatographie 91

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 4 Chromatographie par gel filtration 2 4 3 Conditions de fixation et d élution B - Quantification ; détermination des masses moléculaires c - Détermination de masse moléculaire par chromatographie de gel filtration diverses opérations à réaliser : - Détermination de V o et V t avec des substances appropriées - Passage de substances étalons (dans de domaine de séparation) ; réalisation des calculs de K av ; construction de la courbe - passage de la substance à analyser ; calcul de K av et report sur la courbe 2008-2009 Chromatographie 92

Détermination de masse moléculaire par chromatographie de gel filtration 1/2 1 - Détermination de v o et v t avec des substances appropriées 2 - Passage de substances étalons (dans le domaine de séparation) ; réalisation des calculs de K av ; construction de la courbe K av Calcul des K av Copie2008-2009 Chromatographie 93 Log kda

Détermination de masse moléculaire par chromatographie de gel filtration 2 / 2 3 - Passage de la substance à analyser ; calcul de K av et report sur la courbe K av Calcul du K av K av Log kda Log kda X Copie2008-2009 Chromatographie 94

Expérience de dessalage Extraction - purification des enzymes 2005-2006 95

Extraction - purification des enzymes 2005-2006 96

Extraction - purification des enzymes 2005-2006 97

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 4 Chromatographie par gel filtration 2 4 4 Utilisation - initialement développée pour la séparation des protéines séparation détermination de la masse moléculaire, en concurrence avec l'électrophorèse en gel de polyacrylamide en milieu dénaturant - dessalage des solutions protéiques - concentration des solutions protéiques (en batch). 2008-2009 Chromatographie 98

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 5 Chromatographie par interactions biospécifiques (chromatographie d affinité) 2 5 1 Principe A - Généralités - condition sine qua non : soluté à séparer (protéine) capable de se fixer réversiblement à un ligand spécifique qui est attaché à une matrice insoluble. M + L <===== M L Macro- Ligand Complexe molécule attaché à la matrice - nécessite une connaissance préliminaire détaillée de la structure et de la spécificité biologique du composé à purifier 2008-2009 Chromatographie 99

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 5 Chromatographie par interactions biospécifiques (chromatographie d affinité) 2 5 1 Principe A - Généralités K A n (P) ( RL)/(L) M + L <===== M L (M L) K A = ----------------- (M). (L) - valeurs de K A comprises ici entre 10 5 et 10 8 M -1 - détermination de K A la méthodologie de Scatchard - ( RL)/(L) = K A n (P) - K A (RL) n (P) (RL) 2008-2009 Chromatographie 100

Mélange à séparer au contact de la phase stationnaire Fixation spécifique de la protéine («adsorption») au sens large Libération de la phase solide (désorption) 101

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 5 Chromatographie par interactions biospécifiques (chromatographie d affinité) Type d'interaction Phase stationnaire Phase mobile Conditions d'élution Mise en œuvre et Applications - Fixation des solutés par des interactions spécifiques avec un ligand fixé par covalence sur un support solide - Interactions protéine - ligand caractérisée par la constante de dissociation "K D" - Billes de composés organiques naturels (dextrane, cellulose, ), synthétiques (polyacrylamide, résines, ) ou minéraux (verre, silice, ) avec greffage d'un ligand par covalence - Exemples de ligands (classiquement de petites molécules) : 2',5'-ADP, 5'-AMP, arginine, bleu Cibacron, calmoduline, polyu, protéine A, protéine G, Liquide : tampons (Tris, phosphate, citrate, ) de ph et µ donnés. Variation au cours de l'élution et / ou tampon contenant une substance à plus forte affinité pour le ligand - Gradient de ph (discontinu) et / ou de force ionique croissante (discontinu ou continu) - Gradient de ligand de meilleure affinité - Sur colonne (CPL, CLHP) - Exemples d'application : interaction enzyme - substrat, antigène - anticorps, hormone - récepteur, Très efficace lors de la purification des enzymes 2008-2009 Chromatographie 102

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 5 Chromatographie par interactions biospécifiques 2 5 1 Principe B La phase stationnaire - Support (solide) sur lequel est fixé un ligand par une liaison solide, une liaison covalente C La phase mobile - Tampon faisant diminuer les interactions entre solutés et phase stationnaire (ligand) ou contenant un ligand ayant davantage d affinité pour le soluté macromoléculaire. 2008-2009 Chromatographie 103

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 5 Chromatographie par interactions biospécifiques 2 5 2 La phase stationnaire A Le support * propriétés de la matrice idéale pour la chromatographie d interactions biospécifiques : - posséder les groupements chimiques permettant la fixation covalente du ligand et être stable dans les conditions de cette fixation - interagir faiblement avec les autres macromolécules pour minimiser les adsorptions non spécifiques - posséder de bonnes propriétés de flux. * En pratique, particules sphériques, uniformes, et rigides : - les dextranes réticulés (SEPHACRYL S) - l'agarose (SEPHAROSE, BIO - GEL A) - les gels de polyacrylamide (BIO - GELS P) - le polystyrène(bio - BEADS S) - la cellulose - le verre poreux et la silice. 2008-2009 Chromatographie 104

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 5 Chromatographie par interactions biospécifiques 2 5 2 Les supports B Le ligand 1 - Généralités : choix du ligand - nature chimique du ligand déterminée par la connaissance préliminaire de la spécificité biologique du composé à purifier. - fréquemment possible de sélectionner un ligand qui montre une spécificité absolue - D'un autre coté, possible de sélectionner un ligand qui présente une sélectivité de groupe : il fixe des composés qui possèdent une spécificité chimique déterminée : Exemple : AMP 5' qui peut fixer réversiblement beaucoup de deshydrogénases à NAD + car l'amp 5' est analogue, du point de vue structure, à une partie de la structure du NAD +. 2008-2009 Chromatographie 105

2008-2009 Chromatographie 106

Copie 2008-2009 Chromatographie 107

Copie 2008-2009 Chromatographie 108

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 5 Chromatographie par interactions biospécifiques 2 5 2 Les supports B Le ligand 2 - Fixation du ligand au support pour constituer la phase stationnaire a - Groupement fonctionnel permettant la fixation b - Utilisation d'un bras («arm» - «spacer») c - Réactions de fixation 2008-2009 Chromatographie 109

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 5 Chromatographie par interactions biospécifiques 2 5 2 Les supports B Le ligand 2 - Fixation du ligand au support pour constituer la phase stationnaire Groupement fonctionnel permettant la fixation - ligand avec groupement chimique adéquat pour permettre sa fixation à la matrice (support) : groupements fonctionnels comme : - NH 2, - COOH, - SH et OH - support avec groupements fonctionnels compatibles = activation (voir synthèse peptidique et immobilisation des enzymes). Copie 2008-2009 Chromatographie 110

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 5 Chromatographie par interactions biospécifiques 2 5 3 Conditions de fixation et d élution A Fixation des solutés Conditions favorisant les interactions : - ph, - force ionique assez forte pour minimiser l'adsorption non spécifique des polyélectrolytes et des groupements chargés sur le ligand - présence de cofacteurs comme des ions métalliques nécessaires à l'interaction entre le ligand et les macromolécules. Pour que la fixation soit complète, ces conditions doivent être optimisées. Copie 2008-2009 Chromatographie 119

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 5 Chromatographie par interactions biospécifiques 2 5 3 Conditions de fixation et d élution B - Elution 1 - Sortie des substances non fixées (éluat 1) Passage d'un tampon faisant sortir de la colonne ce qui n'est pas fixé. 2 - Élution non spécifique Changement de ph : acide acétique dilué ou de l ammoniaque (NH 4+ OH - ) = changement dans l'état d'ionisation de groupes ionisables du ligand ou de la macromolécule (critique dans la liaison ligand macromolécule). Changement de force ionique : peut être effectué sans changement concomitant de ph : ceci provoque une élution due à la rupture des interactions entre ligand et macromolécules ; utilisation, par exemple, de NaCl 1 M 2008-2009 Chromatographie 120

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 5 Chromatographie par interactions biospécifiques 2 5 3 Conditions de fixation et d élution B - Elution 3 - Elution spécifique utilisation de substances ayant une plus grande affinité pour le ligand ou pour la macromolécule : - substrats ou inhibiteurs réversibles de la macromolécule s'il s'agit d'un enzyme - autre ligand ayant plus grande affinité pour la macromolécule : NADP + dans le cas de l'amp 5' Remarque : nécessité d éliminer (par exemple par gel filtration) les produits utilisés pour l'élution : sels, l autre ligand,... 2008-2009 Chromatographie 121

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 5 Chromatographie par interactions biospécifiques 2 5 4 Utilisation A Séparation d une molécule présente dans un mélange 1 - Spécificité absolue Séparation spécifique de protéines : - enzymes : - inhibiteur (compétitif) utilisé comme ligand (arginine, benzamidine, ) - analogues de coenzymes : 5 AMP, 2,5 ADP comme ligand - isolement d'enzymes du métabolisme des acides nucléiques par utilisation de nucléotides immobilisés comme ligand - récepteurs d'hormones - hormone utilisée comme ligand Remarque : utilisation également possible pour - la concentration de solutions diluées - la séparation de molécules natives de molécules dénaturées 2008-2009 Chromatographie 122

Ligand Substances séparées Copie 2008-2009 Chromatographie 123

Ligand Substances séparées Copie 2008-2009 Chromatographie 124

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 5 Chromatographie par interactions biospécifiques 2 5 4 Utilisation A Séparation d une molécule présente dans un mélange 1 - Spécificité absolue Séparation spécifique d acides nucléiques : * séparation d'arn m par hybridation sur des colonnes de poly (U)- SEPHAROSE 4B * séparation d'arn viral sur des colonnes de poly (A)-SEPHAROSE 4B : ceci est utilisé pour la préparation des ADN copies matrice * séparation d'arn complémentaire et d'adn à partir d'adn sb fixé sur 2008-2009 Chromatographie 125

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 5 Chromatographie par interactions biospécifiques 2 5 4 Utilisation A Séparation d une molécule d un mélange 2 - Spécificité de groupe * utilisation de colorants fixant des familles de macromolécules "dye-ligand chromatography" - BLEU CIBACRON : colorant couplé à un support par la triazine utilisé comme ligand pour purifier des protéines : interaction moins spécifique : séparation de sérum albumine (voir TP), d'interféron, de plasminogène et d enzymes de restriction - Rouge Procion (isolement d enzymes ayant des cofacteurs nucléotidiques) * Autres substances calmodulines, concavaline A immunoglobulines IgG : protéine G utilisée comme ligand lectines héparine : isolement de facteurs de croissance et de coagulation - 2008-2009 Chromatographie 127

Extraction - purification des enzymes 2005-2006 128

Extraction - purification des enzymes 2005-2006 129

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 5 Chromatographie par interactions biospécifiques 2 5 4 Utilisation B Techniques dérivées 1 - Séparation de cellules - Séparation de cellules dans un mélange - Par exemple, - utilisation des propriétés antigéniques de la surface cellulaire - utilisation de la nature chimique des résidus hydrates de carbone sur la surface - utilisation des interactions entre un récepteur membranaire et le ligand. Exemples de ligand : la protéine A (qui assure la liaison avec les régions Fc des Ig), les lectines des ligands spécifiques pour des récepteurs membranaires. 2008-2009 Chromatographie 130

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 5 Chromatographie par interactions biospécifiques 2 5 4 Utilisation B Techniques dérivées 2 - "Covalent chromatography" - formation d'une liaison covalente entre le ligand lié et le composé à séparer (en général des protéines) = pont disulfure entre thiols - support : thio-propyl SEPHAROSE et le thio-sepharose - élution réalisée par addition de dithiothreitol ou de cystéine qui vont se fixer sur le support - technique utilisée pour purifier la papaïne ou l uréase qui ont beaucoup de groupements thiols, de même pour la séparation des mrna nouvellement synthétisés. 2008-2009 Chromatographie 131

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 6 Chromatographie par interactions hydrophobes Introduction : historique : expériences de "contrôle" effectuées lors du développement des supports de chromatographie d'affinité étude du comportement de matrices contenant des bras espaceurs en l'absence de ligands dans la plupart des cas, aucune fixation notable = comportement espéré dans certains cas (bras héxaméthylène), forte liaison des enzymes même en l'absence de groupements chargés (amine ou carboxylique ) aux extrémités qui auraient pu fonctionner comme des échangeurs d'ions utilisation pour la séparation de protéines d une «chromatographie d'interactions hydrophobes», c'est-à-dire d une chromatographie fondée sur les interactions entre des chaînes aliphatiques d'un support et les régions hydrophobes à la surface de protéines. Copie2008-2009 Chromatographie 132

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 6 Chromatographie par interactions hydrophobes - Peu de fixation de protéines à de courtes chaînes aliphatiques à faible concentration saline (les interactions ioniques prédominent) - les interactions hydrophobes augmentent avec l'augmentation de la force ionique : les sels masquent les interactions électrostatiques (et provoquent la précipitation par «SOLTING OUT» (sulfate d'ammonium)) = extension de la chromatographie à toutes les protéines - Inconvénient : précipitation des protéines. Copie2008-2009 Chromatographie 133

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 6 Chromatographie par interactions hydrophobes 2 6 1 Principe - présence de résidus superficiels non polaires chez beaucoup de protéines Copie2008-2009 Chromatographie 134

Copie2008-2009 Chromatographie 135

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 6 Chromatographie par interactions hydrophobes 2 6 1 Principe Fixation de la protéine («adsorption») au sens large sur les groupements hydrophobes Élution de la protéine Extraction - purification des enzymes 2005-2006 136

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 6 Chromatographie par interactions hydrophobes 2 6 1 Principe - possibilité d utiliser ces interactions entre ces groupements et des groupements non polaires fixés à un support fixe. A - Phase stationnaire - supports classiques possédant des groupements hydrophobes B - Phase mobile - tampons permettant de diminuer les interactions hydrophobes entre support et protéines : par exemple, en diminuant la salinité du tampon. Copie2008-2009 Chromatographie 137

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 6 Chromatographie par interactions hydrophobes 2 6 2 Les phases stationnaires - le plus souvent dérivés de l agarose (SEPHAROSE TR ) avec substitution par des groupements amino hexyl ou octyl. - une des structures les plus classiques avec des groupements hydrophobes phényl ou octyl : phényl SEPHAROSE - O - CH 2 - CH - CH 2 - O OH (CH 2 ) 7 - CH 3 (octyl) Copie2008-2009 Chromatographie 138

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 6 Chromatographie par interactions hydrophobes 2 6 3 Conditions de fixation et d élution - forte force ionique afin de favoriser les interactions hydrophobes - en fait, concentration en sel (sulfate d'ammonium) juste inférieure à celle provoquant la précipitation de la protéine à purifier. - effet de la nature des ions sur les interactions hydrophobes et la précipitation : anions : PO 4 3- > SO 4 2- > CH 3 -COO - > Cl - > Br - > SO 4 2- > ClO 4- > I - > SCN - cations : A - Fixation NH 4+ < K + < Na + < Li + < Mg 2+ < Ca 2+ < Ba 2+ Plus la structure est perturbée, moins l'interaction hydrophobe est marquée Copie2008-2009 Chromatographie 139

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 6 Chromatographie par interactions hydrophobes 2 6 3 Conditions de fixation et d élution B - Elution - diminution de la température - utilisation de solvants organiques - diminution de la force ionique (remplacer le sulfate d'ammonium par du chlorure mercurique) - diminuer la polarité de l'éluant (éthylène glycol - SDS) - diminuer le ph : réduction des effets d'échange d'ions dus aux charges positives associées au couplage de l'isourée dans la matrice. Copie2008-2009 Chromatographie 140

Extraction - purification des enzymes 2005-2006 141

Extraction - purification des enzymes 2005-2006 142

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 6 Chromatographie par interactions hydrophobes 2 6 4 Utilisation - Technique utilisée pour la séparation des protéines dans des conditions assez semblables à celles de la précipitation fractionnée par les sels. - En fait, séparation sans très grande efficacité : chevauchement des composés les uns sur les autres. Après une précipitation fractionnée, les chances d'obtenir une bonne séparation sont minces... Copie2008-2009 Chromatographie 143

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 6 Chromatographie par interactions hydrophobes 2 6 4 Utilisation - Aspects positifs : - capacité de rétention des protéines aussi importante que celle réalisée pour l'échange d'ions - puisque la séparation est réalisée à haute concentration saline, il n'est pas nécessaire de changer le tampon avant application - du fait de l'effet stabilisant des sels, le rendement de récupération de l activité biologique est le plus souvent excellent. - Protéines fixées à faible concentration saline = celles ayant une faible solubilité dans l'eau : globulines, protéines associées aux membranes et protéines précipitant entre 20 et 40 % de sulfate d'ammonium ; peuvent être difficiles à éluer. - Technique en progression. Copie2008-2009 Chromatographie 144

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 6 Chromatographie par interactions hydrophobes 2 6 5 Technique dérivée : chromatographie par appariement d ions - addition à la phase mobile de substances ioniques capables de former avec les solutés à séparer des paires d ions à caractère hydrophobe R 1 + + R 3 R 2 Agent de la réalisation de la paire d ions R 4 R 1 + R 3 Échantillon moins hydrophobe - des sels d ammonium quaternaires tels que les tétraéthyl ou tétrabutylammonium (+Nbu 4 ) pour les composés ioniques - des alkylsulfonates pour la séparation des cations formés par protonation des amines - favorise leur rétention sur les silices greffées n-octyle : C 8 ou n-octadécyle : C 18 = séparation possible de composés ionisés ou ionisables. 2008-2009 Chromatographie 145 R 2 Complexe hydrophobe R 4 Phases réverses

R 1 + + R 3 R 1 + R 3 R 2 R 4 R 2 R 4 Agent de la réalisation de la paire d ions Échantillon moins hydrophobe Complexe hydrophobe Bu Bu - N + Bu - Bu Bu - = CH 3 CH 2 CH 2 CH 2 butyl Séparation en phases inverses 2008-2009 Chromatographie 146

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 7 " Metal chelate chromatography" ou "Immobilised metal affinity chromatography» (IMAC) technique dérivée de la chromatographie d affinité : séparation des protéines de même taille et de même point isoélectrique selon leur affinité pour des ions métalliques immobilisés par chélation (Zn 2+, Cu 2+, Cd 2+, Co 2+ Hg 2+ et Ni 2+ ). fixation des macromolécules en fonction du ph et de la présence d'un résidu histidine dans la macromolécule. échantillon appliqué à ph neutre et élution du composé en diminuant le ph et la force ionique du tampon ou en incluant de l EDTA dans le tampon (autres chélatants d'ions : l'acide iminodiacétique et le TRIS(carboxyméthyl) éthylènediamine) (technique utilisée pour la séparation du fibrinogène, de la superoxyde dismutase et des protéines nucléaires différentes des histones) utilisation pour des protéines recombinantes (de fusion) dans lesquelles sont inclus des «tags» (poly His) qui fixent des ions (Ni 2+ ) Copie 2008-2009 Chromatographie 147

- technique utilisée pour la séparation du fibrinogène, de la superoxyde dismutase et des protéines nucléaires différentes des histones - Utilisation pour des protéines recombinantes (de fusion) dans lesquelles sont inclus des «tags» (poly His) qui fixent des ions (Ni 2+ ) - protéines de fusion : protéines obtenues par génie génétique (expression dans une cellule hôte E. coli) comprenant : - la protéine d intérêt - un morceau («domaine») d une protéine servant de marqueur (tag) : ici poly His (mieux acceptée par la cellule hôte + facilité de séparation) Fixation des protéines (azote de His) par l intermédiaire d ions minéraux (Me 2+ = Ni 2+ par exemple (Zn 2+, Cu 2+, Cd 2+, Co 2+ Hg 2+ et Ni 2+ )). - élution par EDTA, par exemple Extraction - purification des enzymes 2005-2006 148

Séquence «tag» Protéines de fusion gène d intérêt ADN recombinant = obtenu par génie génétique Expression Extraction - purification des enzymes 2005-2006 149

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2008-2009 Chromatographie 151 Copie

3 Méthodologie et applications Cours TB 2003-2004 2008-2009 Chromatographie 152

1 Généralités 1 1 Définition de la chromatographie : principes généraux 1 1 1 - Définition 1 1 2 - Caractères généraux 1 2 - Différents types de chromatographies 1 2 1 - Classification selon l état des phases 1 2 2 - Classification selon le principe des interactions entre soluté et phase stationnaire 1 2 3 - Classification selon le mode d immobilisation de la phase stationnaire 1 2 4 - Classification selon les modalités de migration de la phase mobile Chromatographie 1 3 - Étude théorique et modélisation 1 3 1 - Modélisation intuitive 1 3 2 - Volumes de rétention 1 3 3 - Coefficient de partition, constante de distribution 1 3 4 -Facteur de capacité, facteur de partition 1 3 5 - Facteur de sélectivité α 1 3 6 - Efficacité de la colonne et résolution 1 3 7 - Représentation schématique d une chromatographie 2008-2009 Chromatographie 153

2 Principe des méthodes de chromatographie 2 1 Chromatographie d adsorption 2 2 Chromatographie de partage 2 3 Chromatographie par échange d ions 2 4 Chromatographie par gel filtration 2 5 Chromatographie par interactions biospécifiques 2 6 Chromatographie par interactions hydrophobes 2 7 Autres chromatographies 3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne A - Chromatographie en phase liquide B - Chromatographie en phase gazeuse 3 1 2 Chromatographie de surface A Méthodologie générale B Différence 3 2 Applications 3 2 1 Séparation des acides aminés 3 2 2 Séparation de médicaments par HPLC 3 2 3 Séparation des protéines par FPLC 3 2 4 Autres applications 2008-2009 Chromatographie 154

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne A - Chromatographie en phase liquide 1 Généralités a Les divers temps de mise œuvre et appareillage b Les principales méthodologies c Les principales différences entre méthodologies a Appareillage b Méthodologie 2 Basse pression 3 Moyenne haute pression a Appareillage b Méthodologie B - Chromatographie en phase gazeuse 1 Appareillage 2 Méthodologie 3 1 2 Chromatographie de surface A Méthodologie générale B Différences 3 1 3 Chromatographie en batch et méthodologies dérivées 3 2 Applications 3 2 1 Séparation des acides aminés 3 2 2 Séparation de médicaments par HPLC 3 2 3 Séparation des protéines par FPLC 3 2 4 Autres applications 2008-2009 Chromatographie 155

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne A - Chromatographie en phase liquide B - Chromatographie en phase gazeuse 3 1 2 Chromatographie de surface A Méthodologie générale B Différences 2008-2009 Chromatographie 156

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne A - Chromatographie en phase liquide B - Chromatographie en phase gazeuse 2008-2009 Chromatographie 157

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne A - Chromatographie en phase liquide 1 - Généralités a - Les divers temps de la mise en œuvre et l appareillage utilisé b Les principales méthodologies c Principales différences entre les méthodologies 2008-2009 Chromatographie 158

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne A - Chromatographie en phase liquide 1 - Généralités a - Les divers temps de la mise en œuvre et l appareillage utilisé a1 Les divers temps de la mise en œuvre - Mise en service et vérification de l appareillage - Préparation des réactifs - Préparation et mise en place de la phase stationnaire - charge de la colonne - Élution des substances non fixées - Élution des substances fixées - Détection - Lavage - Exploitation des résultats 2008-2009 Chromatographie 159

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3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne A - Chromatographie en phase liquide 1 - Généralités a - Les divers temps de la mise en œuvre et l appareillage utilisé a2 L appareillage utilisé pour la mise en œuvre - support : choix avec nature chimique, granulométrie, état physique (sec ou humide) - colonne : choix de la forme (rapport hauteur / diamètre) qui doit être adapté au type de chromatographie choisi ; taille de la colonne ; préparation de la colonne (vérification de l homogénéité du support = remplissage et le vérifier expérimentalement; garder les colonnes préparées (basse pression ; chambre froide)) -réservoir de phase mobile et pompe : préparation de la phase mobile et vérification de son débit (stabilité) et de la pression - introduction de l'échantillon à analyser - élution : appareil à gradient ou non : gradient ; gradient discontinu et gradient continu ou absence de gradient (isocratique) 2008-2009 Chromatographie 161

Gradient discontinu Élution par gradient Gradient continu En ordonnées, intensité d un paramètre physico-chimique P permettant l élution (polarité, ph, force ionique, concentration en ligand, température) Intensité de P Plusieurs étapes Intensité de P Attention : difficile pour ph Une seule étape linéaire convexe concave Volume de Volume de phase mobile Existence de gradients phase mobile 2008-2009 Chromatographie 162 décroissants

Appareil à gradient Intensité de P C 1 C 2 V1 V2 Volume de phase mobile Vers colonne 2008-2009 Chromatographie 163

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne A - Chromatographie en phase liquide 1 - Généralités a - Les divers temps de la mise en œuvre et l appareillage utilisé a2 L appareillage utilisé pour la mise en œuvre - détecteur : détection des solutés et leur quantification - système informatique : stockage et traitement des informations, commande et contrôle du système insérer figure des différentes parties d'un appareil de chromatographie 2008-2009 Chromatographie 164

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne A - Chromatographie en phase liquide 1 - Généralités b - Les principales méthodologies 1 - Initialement : phase stationnaire dans une colonne avec percolation de la phase mobile, éventuellement en augmentant la pression hydrostatique (en élevant le niveau du réservoir de solvant) pour obtenir un débit acceptable (1 ml / min) mais mauvais comportement des supports : - colmatage du SEPHADEX devant l'augmentation de la pression - particules anguleuses (alumine et gel de silice) ; perturbation du flux et mauvaises performances = impossibilité d'augmenter les pressions (impossible d obtenir qques atm) = chromatographie basse pression 2008-2009 Chromatographie 165 H

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne A - Chromatographie en phase liquide 1 - Généralités b - Les principales méthodologies 2 - apparition de nouveaux supports (adsorption et partage au début) - plus fins et billes (meilleure séparation) mais augmentation des pertes de charges - résistant à une augmentation de pression d'où le Concept de High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) ou Chromatographie Liquide à Haute Pression(CLHP) 2008-2009 Chromatographie 166

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne A - Chromatographie en phase liquide 1 - Généralités Chromatographie b - Les principales méthodologies 3 - De tels supports = non adaptés aux substances protéiques. PHARMACIA (1975?) : supports d'échange d'ions initialement hydrophiles (résines) et permettant de fonctionner à une pression plus faible, adaptée au protéines : concept de FPLC ("Fast Protein Liquid Chromatography"). d'ou le concept de chromatographie à moyenne pression 4 - supports de propriétés semblables proposés par d'autres fabricants : supports de types plus nombreux, fonctionnant à pression plus réduite ; globalement augmentation des performances par rapport à la basse pression Concept de Chromatographie Liquide à Haute Performance (CLHP) ou High Performance Liquid Chromatography (HPLC) 2008-2009 Chromatographie 167

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne A - Chromatographie en phase liquide Conclusion : Chromatographie 1 - Généralités b - Les principales méthodologies On distinguera : - chromatographie basse pression - chromatographie à moyenne et haute pression (chromatographie à haute performance) 2008-2009 Chromatographie 168

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne A - Chromatographie en phase liquide 1 - Généralités c Principales différences entre les méthodologies α - Colonne α1 - Taille - colonnes beaucoup plus petites en FPLC et HPLC pour échelle préparative et analytique : quelques ml ont même efficacité que 100 ml en basse pression - grosses colonnes à l'échelle développement et industriel : 10 litres...60 cm de large et 50 cm de hauteur α2 - Support - grandes variétés : aspect commercial voir catalogues - finement divisés ; homogénéité des supports 2008-2009 Chromatographie 169

Colonnes de chromatographique Principaux types (laboratoire) Basse pression Moyenne / haute pression 2008-2009 Chromatographie 170

Colonnes de chromatographique Principaux types (laboratoire) 2008-2009 Chromatographie 171

Colonnes de chromatographique Principaux types (industrie) Moyenne / haute pression 2008-2009 Chromatographie 172

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3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne A - Chromatographie en phase liquide 1 - Généralités c Principales différences entre les méthodologies maximum 200 bars ß Pression : basse pression jusqu'à 3 bars, HPLC vers 60 bars, au γ - Détection et traitement des résultats : technique très fine : d'où des détecteurs "à la hauteur" : au delà des détecteurs classiques spectrométrie de masse applicable aux protéines (recombinantes) δ - Automatisation : poussée pour FPLC / HPLC Conclusion : - basse pression : technique souvent manuelle ; mise en œuvre préparative - moyenne et haute pression : grand degré d'automatisation et d'informatisation : toutes parties performantes : appareillage sophistiqué, utilisation aidée par l'informatique ; mise en œuvre analytique et industrielle 2008-2009 Chromatographie 174

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne A - Chromatographie en phase liquide 2 - Basse Pression manuelle, longue, plusieurs heures de travail ; la nuit. a Appareillage schéma d'une système basse pression Réservoir d éluant Robinet Injection Sortie de colonne Colonne (avec adaptateur et jaquette) 2008-2009 Chromatographie 175

Réservoir d éluant Robinet Injection Sortie de colonne Colonne (avec adaptateur et jaquette) 2008-2009 Chromatographie 176

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3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne A - Chromatographie en phase liquide 2 - Basse Pression manuelle, longue, plusieurs heures de travail ; la nuit. a Appareillage a1 - colonne taille de l'ordre de 30 cm de haut, diamètre 1,6 cm (en moyenne) support en fonction du type de chromatographie choisi, c'est-à-dire en fonction du mélange de solutés : exemple PHARMACIA : gel filtration, échange d'ions, affinité, interactions hydrophobes... a2 Phase mobile réservoir : un ou deux pompe pour pression constante (supérieure à la pression atm), gradient (?) 2008-2009 Chromatographie 180

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3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne A - Chromatographie en phase liquide 2 - Basse Pression manuelle, longue, plusieurs heures de travail ; la nuit. a Appareillage a3 Dispositif d injection simple par une seringue ou robinet à plusieurs voies (voir schémas appareillage PHARMACIA) a4 - Détection manuelle (discontinue) ou spectrophotomètre à 280 nm ou autre longueur d'onde (254 nm) a5 - Recueil des fractions - manuel : discontinu - collecteur de fractions a6 - Résultats ; leur traitement 2008-2009 Chromatographie 184

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne A - Chromatographie en phase liquide 2 - Basse Pression manuelle, longue, plusieurs heures de travail ; la nuit. b Méthodologie b1 - Mise en route (basse pression) comprend : - montage ou remise en route de l'appareillage (absence de bulles) ; continuité liquide - préparation de la phase mobile : qques litres ; nécessité de dégazer pour éviter la formation de bulles - préparation de l'échantillon : changement de tampon (comment?) utilisation d un étalon (externe (standard) ou interne) b2 - Injection aiguille et seringue b3 - Élution gradient discontinu / continu 2008-2009 Chromatographie 185

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne A - Chromatographie en phase liquide b4 - Lavage régénération de la colonne : une colonne se garde en chambre froide (en présence d azoture de Na) soluté pics (aspect historique) Chromatographie 2 - Basse Pression manuelle, longue, plusieurs heures de travail ; la nuit. b Méthodologie b5 - Traitement des résultats enregistreur en général pour obtenir le diagramme d élution détermination de la forme des pics : qualité de la séparation détermination de la position des pics (t R ) : identification du détermination de la surface des pics (intégration de A = f(v)) intégration manuelle : découpage du papier et pesée des intégration automatique comparaison avec un étalon externe 2008-2009 Chromatographie 186

S = α. C Abs Détermination de la surface Se A Ce A = Se / α Ce A = Se. Cst A / Sst A Détermination des concentrations des différents solutés d un échantillon A B C Diagramme d élution d un échantillon t r Détermination de α = Sst A / Cst A Abs A B C Diagramme d élution d un standard (solution des divers solutés de concentration connue et traitée dans les mêmes conditions ) Étalon externe t r 2008-2009 Chromatographie 187

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne A - Chromatographie en phase liquide 2 - Basse Pression manuelle, longue, plusieurs heures de travail ; la nuit. b Méthodologie Conclusion : long : 3 heures pour un temps de passage ; utilisé à l'échelle préparative, souvent montages en chambre froide, toujours utilisé, bien que l'hplc devienne préparative ; mg de produit. 2008-2009 Chromatographie 188

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne A - Chromatographie en phase liquide 3 Moyenne et haute pression manuelle ; analytique et industriel a Appareillage a1 - colonne - beaucoup plus petites ; peuvent être dans une enceinte thermostatée pour augmenter la reproductibilité ; FPLC colonne de 5 cm de haut - taille des billes de l'ordre de 5 à 10 µm a2 Réservoirs et pompe pour la phase mobile - réservoirs : un, deux ou plus - pompe délivrant jusqu'à 300 bars (au début), actuellement de l'ordre de 100 bars ; technologies différentes 2008-2009 Chromatographie 189

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne A - Chromatographie en phase liquide 3 Moyenne et haute pression manuelle ; analytique et industriel a Appareillage a3 - Injecteur boucle d'injection de FPLC : systèmes à boucles : voir document PHARMACIA systèmes en HPLC 2008-2009 Chromatographie 190

2008-2009 Chromatographie 191

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Schéma d un appareillage FPLC 2008-2009 Chromatographie 193

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne A - Chromatographie en phase liquide a4 Détecteur Méthodes optiques spectrophotométrie à 280 nm, 203 nm ; pour substances absorbant dans l'uv Remarque : Chromatographie 3 Moyenne et haute pression manuelle ; analytique et industriel a Appareillage spectrophotométrie spectrale : spectrophotomètre avec comme récepteur une barrette de diodes ; permet l'obtention de chromatogrammes tridimensionnels. traitement informatique (voir documents) * fluorimétrie : méthode beaucoup plus sensible. Remarque : dérivatisation pré ou post-colonne * réfractométrie : sucres ; peu sensible Méthodes électrochimiques : réaction d'oxydoréduction des composés élués, produit un courant électrique mis en évidence Méthodes physiques : spectrométrie de masse 2008-2009 Chromatographie 194

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne A - Chromatographie en phase liquide 3 Moyenne et haute pression manuelle ; analytique et industriel a Appareillage a5 - Traitement des résultats (Moyenne et haute pression) enregistreur / intégrateur en général enregistrement graphique ou visualisation sur écran intégration de la courbe d élution stockage des données 2008-2009 Chromatographie 195

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne A - Chromatographie en phase liquide 3 Moyenne et haute pression manuelle ; analytique et industriel a Appareillage a5 - Traitement des résultats (Moyenne et haute pression) médicament) informatisation poussée : sortie des % mais réglage : la machine peut faire n'importe quoi. reliée à des banques de données pour, par exemple, identification des impuretés présentes (cas d'un 2008-2009 Chromatographie 196

étape Chromatographie 3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne A - Chromatographie en phase liquide 3 Moyenne et haute pression manuelle ; analytique et industriel b Méthodologie échelle analytique, préparative et industrielle en analytique : jamais première étape de séparation en préparatif et industriel : peut maintenant être première (et unique) b1 - Mise en route - remise en route de l'appareillage (allumer les diverses parties de l'appareillage dans l ordre défini) - préparation de la phase mobile : nécessité de filtrer et de dégazer les différentes phases mobiles (tampons) pour éviter le formation de bulles et la présence de poussières qui encrasseraient (colmateraient la colonne) - contrôle de l'appareillage : contrôle de la pression et contrôle de la ligne de base en particulier 2008-2009 Chromatographie 197

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne A - Chromatographie en phase liquide 3 Moyenne et haute pression manuelle ; analytique et industriel b Méthodologie b2 - Injection (Moyenne et haute pression) faible volume d'échantillon dans un tampon déterminé (problèmes de nature du tampon, de force ionique) passeurs d'échantillons 2008-2009 Chromatographie 198

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne A - Chromatographie en phase liquide 3 Moyenne et haute pression manuelle ; analytique et industriel b Méthodologie b3 - Élution gradient continu de phase mobile : 2 à 3 (ou plus phases mobiles) mélangées selon un gradient programmé ; recueil des fractions b4 - Lavage (Moyenne et haute pression) nettoyage de la colonne 2008-2009 Chromatographie 199

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne A - Chromatographie en phase liquide 3 Moyenne et haute pression manuelle ; analytique et industriel b Méthodologie b5 - Traitement des résultats - enregistrement graphique des valeurs sur enregistreur et/ou visualisation sur écran ; stockage sous forme de fichier -calcul de la surface des pics selon divers modes de calculs : prise en compte des caractères de la ligne de base, du chevauchement, du bruit de fond,... - certification BPL norme ISO 9002 assurance-qualité 2008-2009 Chromatographie 200

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne A - Chromatographie en phase liquide 3 Moyenne et haute pression manuelle ; analytique et industriel b Méthodologie b5 - Traitement des résultats détermination de la forme des pics : qualité de la séparation détermination de la position des pics (t R ) : identification du soluté détermination de la surface des pics (intégration de A = f(v)) intégration automatique comparaison avec un étalon : étalon externe / étalon interne 2008-2009 Chromatographie 201

Abs Détermination des concentrations des différents solutés d un échantillon Diagramme d élution d un échantillon Abs Étalon externe Abs t r Étalon interne Diagramme d élution d un standard (solution des divers solutés de concentration connue et traitée dans les t r Diagramme d élution d un échantillon avec étalon interne mêmes conditions ) 2008-2009 Chromatographie 202 t r

Abs Détermination de la surface Sd A Cd = Sd / α Cd = Sd. Sst A / Cst A Détermination des concentrations des différents solutés d un échantillon A B C Diagramme d élution d un échantillon t r Détermination de α = Sst A / Cst A Abs A B C Diagramme d élution d un standard (solution des divers solutés de concentration connue et traitée dans les mêmes conditions ) Étalon externe t r 2008-2009 Chromatographie 203

2008-2009 Chromatographie 204

2008-2009 Chromatographie 205

2008-2009 Chromatographie 206

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne B - Chromatographie en phase gazeuse - phase mobile gazeuse : importance de la température d ébullition - méthode utilisable pour la séparation de mélanges gazeux (azote, méthane, éthylène), de substances spontanément volatiles ou rendues volatiles par chauffage - nécessite, de ce fait, une méthodologie particulière - historiquement, amélioration de la méthodologie basse pression : possibilité de modifier les divers paramètres, donc d optimiser la technique 2008-2009 Chromatographie 207

1 - Appareillage 2008-2009 Chromatographie 208

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne B - Chromatographie en phase gazeuse 1 - Appareillage : les différentes parties a - Réservoir de gaz vecteur a1 - Le gaz vecteur ; propriétés et nature - grande pureté, - inertie par rapport aux substances à chromatographier, - très faible viscosité (la viscosité des gaz augmentant avec la température, il y aurait d'importantes diminutions de débit) ; -conductibilité thermique compatible avec le système de détection - les plus employés : azote, argon, hélium et hydrogène. 2008-2009 Chromatographie 209

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne B - Chromatographie en phase gazeuse 1 - Appareillage : les différentes parties a - Réservoir de gaz vecteur a2 Conservation et détendeur - conservé dans des bouteilles métalliques sous forte pression ; introduit après passage dans des détendeurs dans le système chromatographique sous des pressions allant de 1 à 4 bars a3 Débit ; sa régulation.- qualité de la chromatographie liée au débit du gaz vecteur ; régulateurs permettent de contrôler et de choisir la vitesse désirée ; varie suivant le diamètre des colonnes : colonnes de 1/4 de pouce 50-70 ml /min, colonne 1/8 de pouce 25-30 ml/min. 2008-2009 Chromatographie 210

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne B - Chromatographie en phase gazeuse 1 - Appareillage b - Chambre d'injection Chromatographie * échantillon à analyser gazeux ou préalablement mis en solution dans un solvant très volatil * injection à l'aide d'une micro seringue Hamilton sous des volumes allant de 1 à 10 µl, à travers une membrane d'élastomère qui obture la chambre d'injection ; solutions ne doivent pas trop concentrées et injection rapide pour éviter les élargissements de pics * double fonction de la chambre d'injection : - volatilisation instantanée de l'échantillon introduit - mélange homogène de la vapeur ainsi formée et du gaz vecteur * volume et géométrie soigneusement étudiés ; maintenue à des températures élevées, en général de 20 à 30 C supérieures à celles de la colonne ; attention à la décomposition thermique des substances de l'échantillon. 2008-2009 Chromatographie 211

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne B - Chromatographie en phase gazeuse 1 - Appareillage c - Le four Chromatographie - Température entre 150 et 300 C. - dispositif de programmation de la température permettant de l'augmenter progressivement (accélère la séparation) : gradient de température 2008-2009 Chromatographie 212

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne B - Chromatographie en phase gazeuse 1 - Appareillage d La colonne Chromatographie acier inoxydable ou verre au Cu -Al ou plastique 1 à 4 m spirale (pour n'occuper que des espaces restreints). - phase stationnaire liquide * fixée sur une phase solide constituée de particules solides * déposée sur la paroi de la colonne polyesters ou polyéthers de glycol, silicones, carbures saturés - phase stationnaire solide : petites particules solides ; greffage possible remplissage est délicat, d'où utilisation de colonnes prêtes à l'emploi. 2008-2009 Chromatographie 213

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne B - Chromatographie en phase gazeuse 1 - Appareillage e - Le détecteur Chromatographie -substances à détecter dans un état physique particulier, d'où des détecteurs particuliers - modification des propriétés physiques et chimiques du gaz vecteur du fait de la présence des solutés : transformation de ces différences de propriétés en signaux électriques, amplifiés, enregistrés et, éventuellement, transcrits sous forme graphique par un enregistreur. - observation de pics saillants par rapport à une ligne de base. 2008-2009 Chromatographie 214

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne B - Chromatographie en phase gazeuse 1 - Appareillage e - Le détecteur - flamme de dihydrogène brûlant entre 2 électrodes polarisées - production d ions du fait de la combustion des molécules organiques - production d un courant électrique recueilli par les électrodes et transmis, après amplification, à l'enregistreur ; courant de base, en général, peu important. Chromatographie e1 - F I D (flame ionisation detector) 2008-2009 Chromatographie 215

Insensible aux molécules minérales présentant un potentiel d ionisation élevé : H 2 0, CO, CO 2, N 2. Sensibilité variable selon les molécules : maximale pour hydrocarbures saturés ou non, diminue avec la présence de groupements halogène, amine, hydroxyle et surtout carbonyle et acide. Permet de déceler des quantités de l ordre du nanogramme. Inconvénient : destructif 2008-2009 Chromatographie 216

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne B - Chromatographie en phase gazeuse 1 - Appareillage e - Le détecteur e2 - Catharomètre - Utilisation de la conductibilité thermique. - fil métallique chauffé électriquement ; perd une quantité de chaleur constante dans le temps s'il est placé dans un gaz pur ; dans un mélange variation de la perte calorique d où variation de la résistance ; variation est déterminée par un pont de Wheatstone. 2008-2009 Chromatographie 217

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne B - Chromatographie en phase gazeuse 1 - Appareillage e - Le détecteur Chromatographie e3 Capture d électrons - source d'électrons pour transformer les molécules sortant de la colonne en ions qui sont attirés par une anode. - Enregistrement de la variation de courant. - utilisable uniquement pour les molécules capables de capter des électrons. 2008-2009 Chromatographie 218

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne B - Chromatographie en phase gazeuse 1 - Appareillage e - Le détecteur Chromatographie e4 Spectrométrie de masse Méthode très sensible ; permet d'élucider des structures. 2008-2009 Chromatographie 219

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne B - Chromatographie en phase gazeuse 2 - Méthodologie Chromatographie a - Caractéristiques générales * Avantages de la CPG, par rapport à la chromatographie basse pression : - grand nombre de facteurs sur lesquels on peut agir pour améliorer la séparation : température, nature et caractéristiques de passage de la phase mobile, nature de la phase stationnaire - utilisation d'une phase mobile gazeuse, inerte par rapport au soluté et permettant une utilisation de méthode de détection très sensibles - automatisation possible - rapidité des séparations réalisées ; encore améliorée avec des colonnes de microdiamètre * Traitement de l échantillon * Déroulement de la chromatographie 2008-2009 Chromatographie 220

rendre l'échantillon volatil ; échantillons rarement d'emblée volatils. Échantillons rendus plus volatils par introduction de groupement hydrophobes : séparation des molécules les unes des autres par absence de liaisons polaires entre elles... (TMS) -Si-(CH 3 ) 3 Chromatographie 3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne B - Chromatographie en phase gazeuse 2 - Méthodologie b - Traitement de l échantillon b1 - Réaction de silylation : utilisation du triméthylsilane Le groupement se substitue à un H mobile (par exemple alcoolique) R-OH + Cl-Si-(CH 3 ) 3 ---------> R-O-Si-(CH 3 ) 3 + H Cl chlorure de TMS fonction alcool polaire, responsable des interactions entre molécules : volatilité liée à l'absence d'interactions ; on diminue la possibilité de réaliser des liaisons hydrogène 2008-2009 Chromatographie 221

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne B - Chromatographie en phase gazeuse 2 - Méthodologie b - Traitement de l échantillon b2 - Réaction d'alcoylation - remplacement d'un H mobile par une radical R alcoyl (chaîne hydrocarbonée) b3 - Réaction d'acylation - remplacement d'un H mobile par une radical R acyl (chaîne hydrocarbonée d'un acide organique) Remarque : Utilisable pour de petites molécules, pas d'application aux macromolécules ; utilisation pour les alcools, ce qui sort d'un fermenteur 2008-2009 Chromatographie 222

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 1 Chromatographie sur colonne B - Chromatographie en phase gazeuse 2 - Méthodologie Chromatographie c - Déroulement de la chromatographie - technique la plus simple : maintien de la pression et la température constantes dans la colonne : chromatographie isotherme et isobare. - pour éviter de trop long temps de migration d'augmenter progressivement la température de la colonne selon un programme préétabli (gradient de température) : chromatographie à température programmée ; l'augmentation de température modifie le débit gazeux ce qui conduit à l'emploi d' un système de régulation automatique de débit en fonction de la température. Les températures les plus utilisées : 80 300 C 2008-2009 Chromatographie 223

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 2 Chromatographie de surface A Méthodologie générale B Différences 2008-2009 Chromatographie 224

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 2 Chromatographie de surface A Méthodologie générale 1 - Préparation de la phase mobile (simple ou complexe) monophasique ou biphasique chromatographie de partage : système monophasique ou biphasique Système monophasique N-butanol 3 Acide acétique 1 Eau 1 Système biphasique N-butanol 3 Acide acétique 1 Eau 4 2008-2009 Chromatographie 225

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 2 Chromatographie de surface A Méthodologie générale 2 - Préparation du support ; en particulier découpage - ciseaux - traits au crayon de papier - ligne de dépôt 3 Dépôts - équidistants 2008-2009 Chromatographie 226

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 2 Chromatographie de surface A Méthodologie générale 4 Migration : ascendante / descendante 2008-2009 Chromatographie 227

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 2 Chromatographie de surface A Méthodologie générale 5 Révélation réaction colorée permettant de mettre en évidence les solutés sous forme de taches = spots nature chimique des réactifs utilisés (corrosivité) 6 - Résultats et leur évaluation noter le front du solvant : calcul du Rf ou valeur relative à une substance de référence reproductibilité 2008-2009 Chromatographie 228

Front du solvant D d Dépôt Rf = d / D Exemple de la CCM après révélation 2008-2009 Chromatographie 229

Départ du front solvant D ref d Dépôt Rf = d / D Ref Exemple de la CCM après révélation 2008-2009 Chromatographie 230

Départ du front solvant D ref d Dépôt Rf = d / D Ref Exemple de la CCM après révélation 2008-2009 Chromatographie 231

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 2 Chromatographie de surface B - Différences 1 - Chromatographie sur papier (1944) - papier servant de support inerte - fixation de l'eau (en général) d'où une chromatographie de partage - 80 cm : chromatographie descendante - Révélation par des réactifs non corrosifs (ex : phtalate d aniline pour les sucres) 2008-2009 Chromatographie 232

sur papier 2008-2009 Chromatographie 233

Système biphasique Cas de la chromatographie sur papier Phase organique Phase aqueuse 2008-2009 Chromatographie 234

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 2 Chromatographie de surface - chromatographie sur couche mince : partage ou/et adsorption - plaques 20 X 20 cm maximum : souvent plus petites - Ascendante B - Différences 2 - Chromatographie sur couches minces (Stahl 1956) - révélation par des réactifs corrosifs (acides forts) 2008-2009 Chromatographie 235

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 2 Chromatographie de surface B - Différences 2 - Chromatographie sur couches minces (Stahl 1956) - automatisation possible : Rhône Poulenc - CCM avec couche de concentration utilisé pour étapes préparatoires de HPLC : mise au point de systèmes de solvants optimisant la séparation. 2008-2009 Chromatographie 236

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 3 Mise en œuvre en batch A Mode opératoire Chromatographie - addition de phase stationnaire au mélange à séparer = solide - mise en suspension par agitation 2008-2009 Chromatographie 237

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 3 Mise en œuvre en batch A Mode opératoire - décantation : séparation des deux phases recueil de la phase intéressante soit soit phase liquide Traitement ultérieur phase stationnaire Élution en batch ou sur colonne 2008-2009 Chromatographie 238

3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 4 Mise en œuvre en lit fluidisé Mode opératoire Charge en lit fluidisé soit Élution en batch puis soit Élution en colonne 2008-2009 Chromatographie 239

3 Méthodologie et applications 3 2 Applications : quelques exemples 3 2 1 Séparation des acides aminés 3 2 2 Séparation de médicaments par HPLC 3 2 3 Séparation des protéines par FPLC 3 2 4 Autres applications 2008-2009 Chromatographie 240

3 Méthodologie et applications 3 2 Applications : quelques exemples 3 2 1 Séparation des acides aminés A Séparation et dosage des acides aminés d un hydrolysat de protéines = détermination de la composition totale en acides mainés - purification de la protéine à séquencer : isolement d une chaîne polypeptidique - hydrolyse chimique acide et basique ; temps d hydrolyse - séparation des mélanges obtenus par chromatographie - échange d ions historiquement, actuellement interactions hydrophobes - automatisé 2008-2009 Chromatographie 241

3 Méthodologie et applications 3 2 Applications : quelques exemples 3 2 1 Séparation des acides aminés B - Détermination de la structure primaire des protéines - purification de la protéine à séquencer : isolement d une chaîne polypeptidique - hydrolyse enzymatique de la chaîne - séparation et purification des divers fragments - travail sur un fragment donné : utilisation du réactif d EDMAN, c est à dire détachement récurrente d acides aminés à partir de l extrémité NH 2 (PHT aas) - séparation des acides aminés par chromatographie d interactions hydrophobes - automatisé 2008-2009 Chromatographie 242

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Charge + des protéines (cations) : séparation sur échangeur - (sur échangeur de cations) CM Charge - des protéines (anions) : séparation sur échangeur + (sur échangeur d anions) DEAE 2008-2009 Chromatographie 245

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3 Méthodologie et applications 3 2 Applications : quelques exemples 3 2 2 Séparation de médicaments par HPLC 2008-2009 Chromatographie 247

Copie2008-2009 Chromatographie 248

Copie2008-2009 Chromatographie 249

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3 Méthodologie et applications 3 2 Applications : quelques exemples 3 2 3 Séparation des protéines par FPLC 2008-2009 Chromatographie 253

3 Méthodologie et applications 3 2 Applications 3 2 4 Autres applications 2008-2009 Chromatographie 254

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3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies 3 1 2 Chromatographie de surface A Méthodologie générale 1 - Préparation de la phase mobile (simple ou complexe) monophasique ou biphasique 2 - Préparation du support ; en particulier découpage 3 - Dépôts 4 Migration : ascendante / descendante 5 Révélation 6 - Résultats et leur évaluation 2008-2009 Chromatographie 257

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