Étude Théorique de deux Mécanismes de Désactivation

MASTER DE PHISYCO-CHIMIE MOLÉCULAIRE Université Paris-Sud 11 Rapport de stage : Janvier-Juin 26 Fluorescence de la Cyan Fluorescent Protein : Étude Théorique de deux Mécanismes de Désactivation Germain VALLVERDU Laboratoire de Chimie Physique (UMR 8) Université Paris Sud 11 Responsables de stage : Isabelle DEMACHY, Bernard LEVY

Remerciements Je remercie Alain FUCHS et Mehran MOSTAFAVI, directeurs du Laboratoire de Chimie- Physique de m avoir permis de faire ce stage au sein de ce laboratoire. Je tiens à remercier Bernard LEVY, Isabelle DEMACHY et Jacqueline RIDARD pour leur accueil et la qualité de leur encadrement. Je remercie également Pascal PERNOT pour les nombreuses discussions enrichissantes que j ai pu avoir avec lui au cours de mon stage. Je remercie également Hélène LAGUITTON-PASQUIER pour ses explications et pour m avoir permis d utiliser les résultats de ses travaux. Enfin je remercie tous les membres du laboratoire pour leur accueil et leur gentillesse.

Table des matières 1 Introduction 1 2 Méthodologie 3 2.1 Champ de force, Dynamique moléculaire.............................. 3 2.2 Obtention des états électroniques d une molécule......................... 4 2.2.1 Interaction de configurations de type CIS.......................... 4 2.2.2 Calculs TD-DFT........................................ 4 2.3 Approche mixte classique-quantique utilisée............................ 5 3 Présentation du cadre de l étude 6 3.1 Propriétés structurales de la CFP................................... 6 3.2 Dynamique de la CFP, choix du couple donneur accepteur pour le transfert de proton.... 7 4 Transfert de Proton 9 4.1 Modélisation............................................... 9 4.1.1 Système restreint........................................ 9 4.1.2 Géométrie du système (chromophore+anion formiate).................. 1 4.1.3 Etats excités du système (chromophore+anion formiate)................. 1 4.2 Surfaces d énergie potentielle..................................... 12 4.2.1 Construction.......................................... 12 4.2.2 Courbes d énergie potentielle................................ 13 4.2.3 Résultats pour l ensemble des distances N9-OE1...................... 14 4.3 Effet de l environnement........................................ 15 4.3.1 Méthodes de calcul....................................... 15 4.3.1.1 Calcul quantique dans le champ électrostatique des charges de l environnement.......................................... 15 4.3.1.2 Calcul indépendant................................. 16 4.3.1.3 Comparaison des méthodes............................ 17 4.3.2 Echantillonnage des valeurs de E et Ea......................... 18 5 Transition vers un état non fluorescent par transfert d électron 2 5.1 Elongation de la liaison N9-H9.................................... 21 5.2 Probabilité de changer d état électronique.............................. 22 5.2.1 Méthode d obtention des grandeurs quantiques intervenant dans la formule de Landau- Zener............................................... 23 5.2.2 Résultats et discussion..................................... 24 5.2.3 Calcul de la probabilité de changer d état électronique.................. 25 5.3 Déclin de la population de l état fluorescent............................. 27 5.3.1 Modélisation de la probabilité d atteindre un croisement................. 27 5.3.2 Modélisation des oscillations de la liaison N9-H9..................... 28 5.3.3 Calcul du déclin de la population de l état fluorescent................... 29 6 Conclusion 31

Chapitre 1 Introduction Ce travail présente une étude théorique portant sur l interprétation des déclins de fluorescence d une protéine fluorescente, la Cyan Fluorescent Protein, étudiée expérimentalement au Laboratoire de Chimie Physique. Durant ces dix dernières années, de nombreuses techniques d imagerie par fluorescence in vivo ont été développées et mises en oeuvre grâce à l apparition de nouveaux senseurs biochimiques performants, en particulier la Green Fluorescent Protein, GFP, et ses nombreux mutants [1, 2]. Parmi ces derniers, la Cyan fluorescent Protein, CFP et la Yellow Fluorescent Protein, YFP, forment un bon couple donneur-accepteur utilisable dans les techniques de transfert résonant d énergie de fluorescence, FRET, employées in vivo pour déterminer les interactions entre les partenaires moléculaires impliqués dans des processus biologiques [3]. Cependant, pour permettre l étude de processus moléculaires spécifiques en conditions physiologiques, les sondes doivent être à la fois brillantes, photo-résistantes et parfaitement biocompatibles. De plus, l exploitation de paramètres spectroscopiques (tels que les caractéristiques spectrales ou les durées de vie de fluorescence) pour la mise en place de nouveaux modes d imageries dites fonctionnelles, nécessite une parfaite maîtrise des photoréactions, des propriétés physico-chimiques et de la sensibilité environnementale des sondes employées. Or, la CFP présente une fluorescence complexe, comportant probablement plusieurs espèces émissives avec des déclins de fluorescence poly-exponentiels et le plus souvent sensibles à l environnement et notamment au ph [4], figure 1.1. De plus, la CFP est peu brillante pour deux raisons principales : d une part son rendement quantique de fluorescence est faible (φ CF P =.4 alors que celui de la EGFP ( Enhanced Green Fluorescent Protein ) est φ EGF P =.6 [2]) d autre part car elle absorbe moins que la EGFP. Déclins de fluorescence Distribution de durée de vie FIG. 1.1 Déclins de fluorescence et distributions de durée de vie de la CFP en fonction du ph. Ces résultats ont été obtenus à partir d expériences de fluorescence résolues en temps réalisées par H. Laguitton-Pasquier au Laboratoire de Chimie Physique. Du fait de ces défauts, de nouvaux mutants sont recherchés et le groupe Biophysique du Laboratoire de Chimie Physique travaille dans cette voie. Cependant, pour pouvoir suggérer une mutation qui conduira à l amélioration des propriétés photophysiques de la protéine, il est nécessaire d identifier les mécanismes et de caractériser les modes de relaxation mis en jeu. Dans cet objectif, une étude théorique à l interface Chimie Théorique-Biologie est en cours au Laboratoire de Chimie Physique. Décrire la fluorescence d une protéine implique de combiner des approches quantiques et classiques, afin de prendre en compte la dynamique de la protéine qui joue un rôle essentiel sur l évolution de l état excité du chromophore. Dans ce 1

CHAPITRE 1. INTRODUCTION contexte les travaux présentés ici traitent de certains mécanismes responsables de la désactivation de la fluorescence. Plusieurs types de processus sont fréquemment rencontrés dans ce type de système : les mouvements internes du chromophore, comme les isomérisations, les transferts de proton entre le chromophore et un résidu proche, le transfert d électron et le transfert résonant de fluorescence qui est souvent observé entre un chromophore et un acide aminé aromatique présent dans la protéine [5]. Dans le cas de la GFP, la fluorescence et les processus de désexcitation ont été largement étudiés, aussi bien d un point de vue expérimental [2, 6] que théorique [7 14]. Cependant, une relation entre la structure et les propriétés photophysiques n a pas été clairement établie. De plus, les chromophores de la CFP et de la GFP sont chimiquement différents, ce qui ne permet pas de transposer directement les résultats connus pour la GFP. Pendant ce stage nous nous sommes tout d abord intéressés à la possibilité d un transfert de proton entre le chromophore et un acide glutamique proche. Au cours de cette étude, il s est avéré qu il existait une possibilité d un transfert d électron du groupement carboxylate vers le chromophore. Ce dernier qui participe à l extinction de la fluorescence, a été étudié en détail. Une première partie présentera tout d abord la structure et la dynamique de la CFP et définira le cadre de l étude. Les deux processus photochimiques étudiés, le transfert de proton et le transfert d électron, seront abordés respectivement dans les chapitres 4 et 5. 2

Chapitre 2 Méthodologie Cette partie expose brièvement le principe des techniques de mécanique classique et de mécanique quantique utilisées, et la façon de les associer pour effectuer des calculs mixtes classiques-quantiques. 2.1 Champ de force, Dynamique moléculaire Les techniques de mécanique moléculaire s appliquent principalement à l étude des conformations, des propriétés thermodynamiques et des modes vibrationnels des molécules. Ce sont des méthodes utilisant la mécanique classique. La molécule est modélisée par des sphères et des ressorts représentant les déformations internes. Elle est décrite comme un système mécanique, sans prendre en compte explicitement la nature microscopique et quantique des interactions entre les électrons et les noyaux. La densité électronique est traitée de manière effective par l intermédiaire de charges ponctuelles. L énergie du système est calculée par une somme de termes paramétrés, additifs et indépendants les uns des autres, équation (1). Ils correspondent aux énergies potentielles des différentes déformations possibles de la molécule et des interactions entre atomes non liés : interactions électrostatiques (entre charges ponctuelles) et de Van Der Waals (figure 2.1). Le champ de force correspond à la définition de l ensemble des fonctions mathématiques et des paramètres relatifs aux différents termes de l énergie. La recherche des conformations d équilibre consiste alors à minimiser cette énergie potentielle. V = liaisons K r (r r eq ) 2 + angles K θ (θ θ eq ) 2 + 1 V n [1 + cos(nφ γ)] + 2 dièdres i<j A ij Rij 12 B ij Rij 6 + q iq j (1) ɛr ij FIG. 2.1 Déformations internes d une molécule et interactions entre atomes non liés. A partir de l équation (1) et de la connaissance des paramètres qui interviennent, il est possible de réaliser des simulations de dynamique moléculaire, mimant le comportement réel du système au cours du temps. Son évolution est déterminée en définissant à chaque pas de temps un point de l espace des phases à l aide d une résolution numérique des équations du mouvement, dans le cadre de la mécanique Newtonnienne. Ces simulations donnent des résultats statistiques sur les grandeurs géométriques du système et les trajectoires des atomes ou résidus. 3

CHAPITRE 2. MÉTHODOLOGIE Un des grands avantages de ce type de calculs est leur rapidité ce qui permet d étudier des systèmes réels, complexes et de taille importante, comme par exemple des systèmes biologiques. Alors que les calculs quantiques sont limités à quelques centaines d atomes, la mécanique moléculaire est adaptée à des systèmes comportant jusqu à une centaine de milliers d atomes. Cependant, la réorganisation électronique n étant pas prise en compte, il est impossible de simuler des phénomènes liés à des ruptures de liaison ou à des transferts de charge. 2.2 Obtention des états électroniques d une molécule Pour obtenir les états électroniques d une molécule il est nécessaire de tenir compte explicitement des degrés de liberté électroniques. En effet, les transitions électroniques mettent en jeu une réorganisation du nuage électronique de la molécule. Deux types de méthodes ont été utilisées dans ce travail : des calculs de type interaction de configurations, et des calculs basés sur la théorie de la fonctionnelle de la densité dépendant du temps, TD-DFT. 2.2.1 Interaction de configurations de type CIS Les calculs avec interaction de configurations consistent à chercher la fonction d onde sous la forme d une combinaison linéaire de déterminants de Slater, construit sur la base des orbitales moléculaires (OM), χ i, fonctions propres de l opérateur de Fock. C est une extension des calculs de type Hartree-Fock, qui permet d améliorer la qualité de la fonction d onde et de l énergie, en minimisant l énergie de corrélation. Cette méthode peut être mise à profit pour déterminer les états électroniques excités et calculer l énergie des transitions électroniques. Elle consiste à réaliser une interaction de configurations en cherchant la fonction d onde totale, Φ, sous la forme d une combinaison linéaire de déterminants de Slater comprenant celui de l état fondamental Ψ () et des déterminants correspondant à des configurations électroniques excités. Dans la méthodes CIS ( Configuration Interaction Single ) seul les déterminants Ψ (1) correspondant à des configurations électroniques mono-excitées sont pris en compte, équation (2). Φ = c () Ψ () + i c (1) i Ψ (1) i Ψ = χ 1...χ N (2) Il n existe aucun couplage entre le déterminant Ψ () et les déterminants Ψ (1) i, car ils ne diffèrent que d une orbitale. Les fonctions propres de l hamiltonien du système sont donc le déterminant Ψ () et des combinaisons linéaires de déterminants mono-excités. La diagonalisation de l hamiltonien donne donc les énergies des premiers niveaux excités ainsi que l analyse de la transition électronique de l état fondamental vers un état excité sous la forme d une combinaison de transitions mono-électroniques d OM occupées vers des OM vacantes. En précisant l état électronique excité étudié, il est possible d optimiser la géométrie de la molécule pour minimiser l énergie de l état excité en question. 2.2.2 Calculs TD-DFT La théorie de la fonctionnelle de la densité (DFT) est une méthode permettant de calculer l énergie d un système dans son état fondamental. L énergie est calculée à l aide d une fonctionnelle de la densité électronique qui prend en compte les énergies d échange et de corrélation. La théorie de la fonctionnelle de la densité dépendant du temps, TD-DFT, permet de déterminer l énergie d une transition électronique et la combinaison de transitions mono-électroniques d OM occupées vers des OM vacantes qui la compose. La démarche est la suivante : Soit Ψ X la fonction d onde de l état fondamental et Ψ A celle d un état excité, toutes deux fonctions propres de l hamiltonien du système, H. Il en résulte les deux équations suivantes : HΨ X = E X Ψ X et HΨ A = E A Ψ A Soit T A un opérateur linéaire, définit par : Ψ A = T A Ψ X. Les deux équations ci-dessus donnent : T A HΨ X = E X Ψ A et HT A Ψ X = E A T A Ψ X La différence de ces deux dernières équations, donne l équation aux valeurs propres suivante : [H, T A ] = (E A E X ) T A 4

CHAPITRE 2. MÉTHODOLOGIE La résolution de cette équation donne donc (E A E X ) qui est l énergie de la transition électronique conduisant de Ψ X à Ψ A, et T A qui définit entre quelles OM a lieu la transition électronique. Pour résoudre cette équation, il est préférable de se placer dans le cadre de la seconde quantification, et d écrire les opérateurs T A et H en fonction des opérateurs création et annihilation. En faisant l approximation que la transition électronique est une combinaison linéaire de monoexcitations, l opérateur T A s écrit alors : T A = t ij a i a j, où l indice i se réfère à une l OM occupée et j à une OM vacante. i,j La diagonalisation du commutateur [H, T A ], dans la base des opérateurs {a i a j}, conduit donc aux énergies des transitions électroniques (les valeurs propres). Les vecteurs propres, T K, donnent la décomposition sur les OM de la transition électronique. Bien que moins précise que des méthodes multiconfigurationnelles, pour la description des états excités, la méthode TD-DFT se révèle très efficace pour traiter des systèmes complexes comme des molécules organiques étendues ou des complexes de métaux de transition. 2.3 Approche mixte classique-quantique utilisée Des approches classiques et quantiques sont nécessaires dans le cas étudié : les simulations de dynamique moléculaire fournissent des résultats statistiques sur les conformations prises par la protéine dans son solvant. Les calculs de chimie quantique sont réalisés sur un système de taille plus petite, représentatif des propriétés étudiées comme par exemple les énergies de transition électronique, pour toutes ou une partie des configurations fournies par la simulation. L effet électrostatique de l environnement peut être pris en compte, en rajoutant dans les calculs quantiques un potentiel externe dû à la distribution des charges de la protéine. Les calculs de mécanique quantique ont été effectués avec le programme GAUSSIAN (23) [15], en utilisant les méthodes CIS, ou DFT et TD-DFT avec la fonctionnelle hybride B3LYP [16, 17]. Les dynamiques moléculaires ont été réalisées en utilisant le programme AMBER version 8 [18], et le champ de force utilisé pour les acides aminés est le champ de force AMBER 1999 [19] particulièrement adapté à la description des protéines. En ce qui concerne le chromophore qui est un résidu atypique, les charges effectives et les constantes de forces de déformations ont été déterminées au cours d études précédentes [2, 21]. Les charges ont été obtenues en les ajustants de telle sorte qu elles reproduisent le potentiel électrostatique créé par le chromophore, calculé au niveau B3LYP/6-31G* pour l état fondamental et CIS/6-31G* pour l état excité. Les constantes de force de déformations du chromophore ont été choisies dans le champ de force AMBER 1999 lorsque c était possible ou ont été obtenues à partir de calculs quantiques. Les simulations ont été réalisées à température et pression constante (3 K, 1 5 Pa) sur une durée de 1 ns, avec un pas de calcul de 1 fs. Elles ont porté sur l ensemble de la protéine, plus les 166 molécules d eau cristallographiques, ainsi que des ions Na + nécessaires pour neutraliser le système, cet ensemble étant placé dans une boite d eau parallélépipédique contenant environ 8 molécules d eau décrites par le potentiel TIP3P, dont les dimensions sont approximativement : 6x7.6x7.7nm 3. La boite contient 285 atomes au total. Des conditions périodiques aux limites sont imposées et les interactions électrostatiques sont décrites à l aide de la méthode d Ewald [22]. Des conformations de la protéine ont été extraites toutes les picosecondes. 5

Chapitre 3 Présentation du cadre de l étude 3.1 Propriétés structurales de la CFP La CFP, constituée de 229 acides aminés, est une protéine dérivée par mutation de la protéine naturelle GFP. Son repliement, caractéristique de la GFP et de ses mutants, conduit à une structure tridimensionnelle presque cylindrique, et lui confère la forme d un tonneau (4.2 nm de long et 2.4 nm de large). Celui-ci est engendré par 11 feuillets β et donne à la protéine une certaine rigidité (figure 3.1). Le chromophore, responsable de la fluorescence, est le 5Z-5(1H-indol-3-ylmethylène-4H-imidazol-4-one) avec pour formule brute C 17 H 16 N 4 O 3, il est fixé environ à mi-distance des extrémités du tonneau, sur une hélice α confondue avec l axe du cylindre. Son emplacement, au coeur de la protéine l isole de l extérieur ce qui limite les sources de désactivation de la fluorescence. La formation du chromophore résulte d une cyclisation autocatalytique, postérieure au repliement de la protéine entre les résidus 65, 66, et 67 [1]. Dans la CFP, les trois résidus impliqués dans la formation du chromophore sont : la Thréonine 65, le Tryptophane 66 et la Glycine 67, figure 3.1. La CFP est obtenue à partir de la GFP grâce à une série de plusieurs mutations. La Tyrosine 66 qui intervient dans la formation du chromophore de la GFP est substituée par un Tryptophane. Ensuite pour obtenir une intensité de luminescence suffisante, d autres mutations sont nécessaires (S65T, F64L, N146I, M153T, V163A) et conduisent à la ECFP, Enhanced CFP qui est la protéine que nous avons étudiée [2]. Son absorption est caractérisée par deux maxima à 434 et 452 nm et son émission présente un maximum pour 476 nm [1]. La CFP selon l axe du tonneau La CFP perpendiculaire à l axe du tonneau Le chromophore FIG. 3.1 La CFP et son chromophore Une étude par Résonance Magnétique Nucléaire du 19 F [23] a permis de mettre en évidence l existence de deux conformations qui peuvent s échanger avec un temps caractéristique de l ordre de la dizaine de millisecondes. La structure aux rayons X de ces deux conformations a été résolue et montre l existence d une conformation majoritaire, A, et une minoritaire, B. Elles diffèrent par l orientation des chaînes latérales de plusieurs résidus, dont la Tyrosine 145 et l Histidine 148 qui sont relativement proches du chromophore [24]. Dans ce travail nous nous sommes limités à l étude de la protéine dans sa conformation majoritaire, la 6

CHAPITRE 3. PRÉSENTATION DU CADRE DE L ÉTUDE conformation A. La figure 3.2 donne un aperçu en trois dimensions de l environnement du chromophore dans cette conformation. La géométrie présentée sur cette figure est issue de la Protein Data Bank [25, 26]. Parmi les acides aminés proches du chromophore, l Histidine 148, mentionnée ci-dessus, est présente sur la gauche de la figure. De plus, à proximité de la partie indolique du chromophore, se trouvent la Sérine 25 et l Acide Glutamique 222 qui présentent des fonctions alcool et acide carboxylique, succeptibles de former des liaisons hydrogène avec le chromophore. Pour obtenir le réseau de liaisons hydrogène, des simulations de dynamique moléculaire ont été effectuées, elles sont présentées dans la section suivante. FIG. 3.2 Vue d une partie de l environnement du chromophore. 3.2 Dynamique de la CFP, choix du couple donneur accepteur pour le transfert de proton Dans une étude antérieure, réalisée au Laboratoire de Chimie Physique, des simulations de dynamique moléculaire ont été réalisées dans l état fondamental du chromophore pour les deux conformations A et B [2] et dans son état excité ππ dans la conformation A [21]. Ces simulations fournissent les trajectoires des déformations internes de l ensemble des résidus de la protéine et des mouvements relatifs de ces résidus les uns par rapport aux autres. Elles ont permis de déterminer les réseaux de liaisons hydrogène au voisinage du chromophore, présentés sur la figure 3.3. Etat fondamental du chromophore Etat excité ππ du chromophore FIG. 3.3 Réseau de liaisons hydrogène dans la conformation A de la CFP, pour l état fondamental et l état excité ππ du chromophore. Les flèches sont orientées de l accepteur de doublet, A, vers le donneur, D. Les nombres indiqués donnent en pourcentage le temps pendant lequel la liaison hydrogène existe. Les critères d existence sont : une distance DA inférieure à.32 nm et un angle DHA supérieur à 12. Les liaisons hydrogène sont généralement des chemins privilégiés pour le transfert d un proton d un résidu à l autre. Dans la GFP, de nombreuses études semblent démontrer que la déprotonation de la fonction phénol du chromophore est la conséquence d un transfert de proton le long d une chaîne de liaisons 7

CHAPITRE 3. PRÉSENTATION DU CADRE DE L ÉTUDE hydrogène impliquant une molécule d eau, la Sérine 25 et Glu222, généralement considéré comme le résidu accepteur terminal [27, 28]. Les réseaux de liaisons hydrogène de la figure 3.3 montrent que dans l état excité, il existe une liaison hydrogène forte entre un oxygène de Glu222 (OE1) et l azote du cycle indole du chromophore (N9). Ainsi, dans la CFP, l azote N9 du chromophore et l oxygène OE1 de Glu222 semble être un couple donneur accepteur potentiellement capable d échanger un proton. Toutefois, la fonction indole est moins acide que la fonction phénol. Cependant le caractère systématique du transfert de proton dans l état excité de la GFP et l existence dans la CFP d une liaison hydrogène reliant directement le donneur et l accepteur (N9 et OE1), permet d envisager l existence d un transfert de proton partiel à partir du groupement indole dans l état excité de la CFP. L énergie de réaction, E, de l échange d un proton entre le chromophore dans son état fondamental ou dans son état excité ππ et un acide glutamique, placés à l infini l un de l autre, a été évaluée par des calculs quantiques dans le vide, au niveau DFT/B3LYP/6-31G* pour les calculs à l état fondamental ou TD-DFT/B3LYP/6-31G* pour les états excités. Nous utiliserons à partir d ici les notations suivantes : Notation Espèce associée CroH Le chromophore tel qu il est présenté sur la figure 3.1 Cro La base conjuguée du chromophore correspondant à la perte du proton H9 CroH Cro Les deux espèces ci-dessus dans leur état excité ππ Glu Base conjuguée de l acide glutamique GluH Acide glutamique F OR Base conjuguée de l acide formique HCOO F ORH Acide formique HCOOH F OR Radical de la base conjuguée de l acide formique HCOO CroH Radical anion du chromophore présenté sur la figure 3.1 TAB. 3.1 Notations des différentes espèces. L introduction de l acide formique sera justifiée plus tard. Les différences d énergie obtenues (tableau 3.2) montrent que l espèce protonée est systématiquement plus basse en énergie que la base correspondante. Ceci conduit aux énergies de réaction suivantes : CroH + Glu Cro + GluH CroH + Glu Cro + GluH E = 71.74 kj.mol 1 E = 84.7 kj.mol 1 L énergie vibrationnelle de point zéro apporte une contribution négligeable au calcul du E. Dans l état fondamental elle est de l ordre de E ZP E =.3kJ.mol 1. Les résultats obtenus montrent que le transfert de proton est exothermique, à l état fondamental comme à l état excité ce qui renforce l idée selon laquelle un transfert de proton pourrait avoir lieu au sein du couple donneur-accepteur que nous avons considéré, c est à dire entre la partie indolique du chromophore et le résidu Glu222. Glu GluH Cro CroH Cro CroH Différence d énergie (kj.mol 1 ) -1477.1-144.7-1391.9 ZPE (kj.mol 1 ) 348.8 383.8 929.1 964.4 / / TAB. 3.2 Résultats des calculs quantiques effectués pour évaluer le E du transfert de proton. Les différence d énergie sont prises par rapport à l espèce basique de chaque couple. 8

Chapitre 4 Transfert de Proton Par analogie avec le transfert de proton existant dans la GFP et étant donné la structure et la dynamique du réseau de liaisons hydrogène impliquant le chromophore de la CFP, nous avons considéré l étude du processus de transfert de proton entre l azote N9 de la partie indolique du chromophore et un oxygène de l acide glutamique 222, OE1 (figure 3.3). Dans cette partie, seront présentés les résultats obtenus lors de l étude de ce processus. La simulation de dynamique molélaire de la CFP avec le chromophore dans son état excité ππ, paragraphe 3.2, a permis d obtenir un échantillon représentatif des configurations de la protéine. Pour chacune d entre elles, à l aide de calculs quantiques, il faut évaluer la hauteur de la barrière d activation, Ea et la différence d énergie entre les produits et les réactifs, E, relatives au transfert de proton (figure 4.1). Ces résultats nous permettront par la suite de calculer la probabilité du transfert de proton. Energie (unité arbitraire) CroH * + Glu - Ea Cro -* + GluH E distance N9-H9 (unité arbitraire) FIG. 4.1 Définition de la barrière d activation, Ea, et de l énergie de réaction, E sur un profil énergétique caractéristique d un échange de proton. Cependant il n est pas possible de faire des calculs quantiques de E et Ea systématiques, sur l ensemble des configurations extraites de la simulation. Nous avons alors effectué au préalable, une série de calculs de courbes d énergie potentielle, construites en déplaçant rectilignement le proton H9, du donneur N9 vers l accepteur OE1, pour différentes distances N9-OE1, dans un modèle restreint qui sera précisé cidessous. L ensemble de ces courbes a permis de construire une surface de potentiel bi-dimensionnelle pour H9. Pour une configuration donnée de la protéine, E et Ea sont obtenus par interpolation des courbes d énergie potentielle précalculées et corrigées de l énergie d interaction électrostatique dûe au reste de l environnement. 4.1 Modélisation 4.1.1 Système restreint Dans une étude antérieure, plusieurs modèles ont été envisagés pour le chromophore [2]. Celui qui a été retenu est constitué de l ensemble des acides aminés qui interviennent dans la formation du chromophore (Thréonine 65, Tryptophane 66 et Sérine 67), augmenté des liaisons peptidiques qui le lient à la protéine (figure 3.1). La coupure intervient au niveau de la liaison simple entre la fonction amide et le carbone α de chaque résidu voisin (Leucine 64 et Valine 68). Le système CroH ainsi obtenu est saturé par des atomes d hydrogènes. D autre part, l acide glutamique déprotoné est modélisé par l anion formiate, 9

CHAPITRE 4. TRANSFERT DE PROTON F OR (voir tableau 3.1). L ensemble de la protéine et des molécules d eau présentes dans les simulations est divisé en deux sous parties : un petit sous système composé du chromophore et de l anion formiate (chromophore+anion formiate), comportant 5 atomes qui sera utilisé pour les calculs quantiques des surfaces de potentiel puis l environnement, constitué du reste de la protéine et des molécules d eau dont l effet sera discuté au paragraphe 4.3. 4.1.2 Géométrie du système (chromophore+anion formiate) Avant de construire les surfaces d énergie potentielle, il faut choisir la position et l orientation relative des deux fragments : l anion formiate et chromophore. L optimisation de géométrie au niveau B3LYP/6-31G* ne conduit pas à une orientation des deux molécules compatible avec les contraintes imposées par la protéine. La figure 4.2 a) présente la géométrie optimisée d un système où CroH a été substitué par un indole (l optimisation de la géométrie du système complet n est pas présentée ici car sa réalisation pose d autres difficultés intrinsèques au système). La raison principale qui nous a conduit à rejeter cette géométrie est l orientation de la liaison CH de l anion formiate. En effet en comparant les figures 4.2 a) et 4.2 b) il est visible que cette orientation n est pas compatible avec la position du squellette protéique auquel Glu222 est relié. Or ce dernier fait partie d un feuillet β [29] qui est une structure rigide, les contraintes imposées par la protéine n autorisent donc pas l orientation de la figure 4.2 a). a) Conformation issue de l optimisation de géométrie b) Conformation dans la protéine FIG. 4.2 Comparaison entre la géométrie optimisé et une géométrie de la protéine. Nous avons alors choisi comme géométrie de départ du système composé du chromophore et de l anion formiate une configuration extraite de la simulation de dynamique moléculaire de la protéine avec le chromophore dans l état excité, paragraphe 3.2. Celle-ci a été choisie parmi les configurations dans lesquelles la liaison hydrogène entre Glu222 et l azote N9 du chromophore existe et où les différents angles de valence et angles dièdres qui permettent de la caractériser sont proches des valeurs moyennes. Les caractéristiques de cette géométrie, notée G, sont données dans le tableau 4.1 Elle a été choisie comme point de départ pour tous les calculs quantiques. Une vue en trois dimensions de la configuration extraite de la protéine est présentée sur la figure 4.2 b). G Moyenne Domaine de variation OE1N9C8 118 112 [7 ; 14 ] OE2OE1N9 69 81 [5 ; 12 ] OE1N9C8H8 2-13 [-5 ; 3 ] OE1OE2N9C8-4 -42 [-8 ; ] CDOE2OE1N9 173 191 [15 ; 25 ] TAB. 4.1 Caractéristiques de l orientation de l anion formiate par rapport au chromophore dans la géométrie G, extraite de la simulation. 4.1.3 Etats excités du système (chromophore+anion formiate) Pour identifier les états excités du système composé du chromophore et de l anion formiate en tout point des surfaces d énergie potentielle, un calcul préalable sur une géométrie proche de la situation d équilibre précédent le transfert de proton (N9-H9=.1 nm et N9-OE1=.3 nm) a été effectué au niveau TD-DFT 1

CHAPITRE 4. TRANSFERT DE PROTON B3LYP/6-31G*. Les OM occupées et vacantes intervenant majoritairement dans les premières transitions électroniques sont représentées dans le tableau 4.2. Etat OM occupées OM vacante TC 1 n(o) antisymétrique de F OR TC 2 π COO de F OR TC 3 LUMO de CroH : π n(o) symétrique de F OR F HOMO de CroH : π TAB. 4.2 Orbitales occupées et vacantes intervenant majoritairement dans les premières transitions électroniques du système (chromophore+anion formiate). Les trois premières transitions électroniques conduisent à des états excités à transfert de charge, TC, d une OM occupée de l anion formiate vers la première OM vacante du chromophore. Ils conduisent donc à un état électronique formé par l association du radical anion CroH du chromophore avec le radical F OR. Ce sont des états obscurs (force d oscillateur nulle) et leur énergie est située entre 1.6 et 2.1 ev au dessus de l état fondamental. Le quatrième état électronique est associé à la configuration électronique ππ du chromophore. C est l état responsable de l absorption et de la fluorescence de la CFP. Sa force d oscillateur est élevée, de l ordre de.75 et il se place aux alentours de 3. ev au dessus de l état fondamental. La méthode DFT (et donc TD-DFT) est réputée pour sous estimer l énergie d un état à transfert de charge [3]. Si une molécule A B est dans un état de type A + B, la variation avec la distance de l interaction entre les densités de charges portées par les fragments A et B est mal décrite par les fonctionnelles usuelles de la DFT (mauvaise modélisation de l échange). Dans notre système il y a bien transfert de charge, mais il n y a pas apparition de charge. En effet, l état fondamental est de type A B et les états excités à caractère transfert de charge sont de type A B. L interaction mal décrite par la méthode DFT est donc absente ici, 11

CHAPITRE 4. TRANSFERT DE PROTON ou identique entre l état fondamental et les états excités. L ordre des états et les écarts d énergie entre les différents états électroniques sont donc probablement corrects. Le transfert de charge, tel qu il est observé ici pose un second problème. Dans ces méthodes, le calcul des énergies de transition électronique, décrites comme une combinaison de mono-excitations, utilise les OM de l état fondamental. Or dans notre cas le composé qui était neutre dans l état fondamental devient anionique dans l état excité et inversement. Les OM utilisées pour calculer les états excités sont donc mal adaptées, ce qui engendre une incertitude sur la détermination de ces états. De plus, la présence d anion nécessiterait d inclure des fonctions diffuses dans la base utilisée ce qui n a pas été fait au cours de ce stage. Dans ce travail, les résultats donnés par la méthode TD-DFT sont supposés suffisament précis pour être interprétés. Des calculs CASPT2 sont actuellement en cours pour évaluer l incertitude sur la position relative des états excités à transfert de charge par rapport à l état fondamental ou à l état excité ππ. 4.2 Surfaces d énergie potentielle 4.2.1 Construction La surface d énergie potentielle est construite en déplaçant, dans le système composé du chromophore et de l anion formiate, le proton H9 entre N9 et OE1, en fixant tous les autres atomes du système. En effet, compte tenu de la différence de masse entre le proton et les atomes du donneur et de l accepteur (azote et oxygène), il semble raisonnable de supposer que le mouvement du proton se fait à géométrie fixe pour les autres atomes. Dans un premier temps la surface d énergie potentielle a été calculée en deux dimensions (figure 4.3) : la distance donneur-accepteur, N9-OE1, et la distance donneur-hydrogène, N9-H9, qui sont les deux coordonnées habituelles de ce type de réaction [31,32]. Le domaine de variation pour la distance N9-OE1 va de.2 à.36 nm, avec un pas de.1 nm, plus une série de points à.4 nm. Pour chaque distance N9-E1, la distance N9-H9 varie de.8 nm jusqu à une distance inférieure ou égale à la distance N9-OE1 avec un pas de.5 nm. L intervalle choisi pour la distance N9-OE1 est cohérent avec les valeurs extraites de la dynamique moléculaire, paragraphe 3.2, dans laquelle la distance N9-OE1 a une valeur moyenne de.28 nm et un domaine de variation compris entre.25 nm et.42 nm. En chaque point de la surface d énergie potentielle, l énergie de l état fondamental et des quatre premiers états excités du système (chromophore+anion formiate) est calculée dans la même orientation que la géométrie G définie au tableau 4.1. Les calculs sont fais au niveau B3LYP/6-31G* pour l état fondamental et avec la méthode TD-DFT au niveau B3LYP/6-31G* pour les états excités..25 Cro - + FORH N9-OE1 =.28 nm.2 N9-H9 (nm).15.1 Cro + FOR -.2.25.3.35.4 N9-OE1 (nm) FIG. 4.3 Surface d énergie potentielle de l état fluorescent en fonction des distances donneur-hydrogène, N9-H9 et donneur-accepteur, N9-OE1. Les courbes rouges et bleues sont des isopotentielles équidistantes les unes des autres de 26.2 kj.mol 1. Le minimum, représenté par la croix rouge se situe à une distance N9- OE1 de.26 nm et une distance N9-H9 de.11 nm. Les trois droites en pointillés représentent la position de croisements entre l état fluorescent, F, et les états à transfert de charge TC1, TC2 et TC3 qui seront discutés au paragraphe 4.2.2. La droite verticale correspond à la courbe d énergie potentielle de la figure 4.5. 12

CHAPITRE 4. TRANSFERT DE PROTON Les valeurs de E et Ea ont été calculées à partir de courbes d énergie potentielle, obtenues en réalisant des coupes selon une droite perpendiculaire à l axe des distances N9-OE1 de la surface d énergie potentielle (droite noire en trait plein figure 4.3). Cette coupure correspond au déplacement de H9 entre le donneur et l accepteur que nous avons choisi. La trajectoire est telle que le proton se déplace de manière rectiligne, sur une droite colinéaire à la direction N9-H9 initiale pour une distance N9-OE1 fixe. Pour des petites valeurs de distances N9-H9, ce mouvement est proche de la trajectoire exacte car le groupement qui agit majoritairement sur l hydrogène est le donneur. De plus, les atomes N9, H9 et OE1 sont presque alignés ( N9H9OE1 = 17 ) et H9 est presque dans le plan de la fonction carboxylate de l anion formiate. Il est donc très peu probable que la liaison N9-H9 subisse un mouvement de flexion de grande amplitude qui courberait la trajectoire. Cependant, pour les grandes distances N9-H9, en restant sur cette droite, le proton s éloigne de la trajectoire idéale car elle n aboutit pas exactement dans le puit de potentiel proche de OE1, figure 4.4..3 N9.2 H9 Y (nm).1 -.1 OE1 CD Glu222 OE2 -.2 -.1.1.2.3 X (nm) FIG. 4.4 Surface d énergie potentielle autour de l anion formiate calculée au niveau B3LYP/6-311+G*. Les courbes sont des isopotentielles équidistantes les unes des autres de.5 ev. Les atomes ont été placés selon les coordonnées de la géométrie G. X et Y sont des coordonnées cartésiennes du plan contenant la fonction acide carboxylique de l anion formiate. Cette approximation apporte une incertitude sur l énergie du système après transfert du proton, et donc sur l énergie de réaction, E. Notons que la position de H9 est correcte jusqu à mi-distance entre N9 et OE1 et donc les hauteurs des barrières, Ea, également. En effet, la position de la barrière d activation se situe a priori à mi-distance du donneur et de l accepteur. Jusqu à ce qu il atteigne ce point, le proton est fortement sous l influence du donneur et continue de se déplacer dans la même direction que l élongation N9-H9. 4.2.2 Courbes d énergie potentielle Pour chaque distance N9-OE1, les coupes de la surface d énergie potentielle donnent un ensemble de cinq courbes d énergie potentielle qui correspondent à l état fondamental et aux quatre premiers états excités du système composé du chromophore et de l anion formiate. Pour toutes ces courbes, l état fluorescent ππ, F, conserve une force d oscillateur élevée, entre.7 et.8, quelque soit la distance N9-H9. La figure 4.5, présente ces courbes d énergie potentielle pour une distance N9-OE1 de.28 nm. Les points correspondant à l état F sont facilement identifiables grâce à la force d oscillateur et sont donc reliés les uns aux autres (courbe rouge). Les autres courbes, correspondant aux états à transfert de charge, sont construites en reliant les points adiabatiquement. Pour les petites distance N9-H9 (inférieure à.15 nm) les états à transfert de charge correspondent aux états présentés au paragraphe 4.1.3. 13

CHAPITRE 4. TRANSFERT DE PROTON a) Energie (kj.mol -1 ) 5 4 3 2 1 Etat fluorescent (F) TC1 TC2 TC3 Etat fondamental force d oscillateur.8.1.12.14.16.18.2 N9-H9 (nm) b).8.7.6.5.8.1.12.14.16.18.2 N9-H9 (nm) FIG. 4.5 a) Courbes d énergie potentielle de l état fondamental et des premiers états excités du système (chromophore+anion formiate). Les noms des états ont été définis au paragraphe 4.1.3. Pour les états à transfert de charge, au delà de.15 nm, les courbes d énergie potentielle présentent des points anguleux dûs à la présence d autre états électroniques plus excités. b) Force d oscillateur de l état fluorescent en fonction de la distance N9-H9. D après la figure 4.5 a), à cette distance donneur-accepteur, en considérant une trajectoire rectiligne, le transfert de proton est endothermique aussi bien dans l état fondamental que dans l état excité. Cependant la barrière d activation, Ea, et l énergie de réaction, E, sont légèrement plus faibles dans l état excité que dans l état fondamental : Ea = 48.7 kj.mol 1 E = 37.6 kj.mol 1 Ea = 53.2 kj.mol 1 E = 44.3 kj.mol 1 D autre part, l état fluorescent croise, pour différentes valeurs de la distance N9-H9, les états excités à transfert de charge TC1, TC2 et TC3 (tableau 4.1.3) qui sont non fluorescents. Ces croisements expliquent les accidents dans l évolution de la force d oscillateur, figure 4.5 b), car en ces points il y a un mélange entre l état fluorescent et les états obscurs ce qui a pour conséquence une chute de la force d oscillateur. Un nouveau processus possible de désactivation de la fluorescence est mis en évidence, correspondant à une relaxation de l état fluorescent vers un état à transfert de charge non fluorescent, par l intermédiaire de ces croisements. Ce mécanisme correspond à un transfert d électron de F OR vers CroH, contrôlé par la vibration de la liaison N9-H9. En effet, si la distance N9-H9 augmente, le système peut passer d un état excité (ππ ) du chromophore, à un des états excités à transfert de charge, de type (CroH F OR ) dans lequel l anion formiate cède un électron au chromophore. Cette réaction de transfert d électron sera étudiée au chapitre 5. 4.2.3 Résultats pour l ensemble des distances N9-OE1 Une étude similaire à celle réalisée au paragraphe précédent a été faite pour l ensemble des distances N9-OE1 considérées dans la construction de la surface d énergie potentielle. Elle a notamment permis de localiser les croisements entre l état F et les états à transfert de charge, représentés par les droites en pointillés sur la figure 4.3 et de confirmer leur existence quelque soit la distance N9-OE1. Les énergies de réaction, E, et les barrières d activation, Ea, ont été calculées pour toutes les distances donneur accepteur, figure 4.6. Dans tout le domaine de variation de la distance N9-OE1, E est plus faible dans l état excité que dans l état fondamental, mais dans les deux cas le transfert de proton est endothermique. Pour l état fondamental E varie entre 28 et 48 kj.mol 1 et dans l état excité fluroescent, E varie entre 25 et 39 kj.mol 1. L énergie d activation est peu différente entre l état fluorescent et l état fondamental et est strictement croissante quand la distance N9-OE1 augmente. Ce comportement est cohérent, car lorsque le donneur et l accepteur s éloigne l un de l autre, aucun des deux ne stabilise la zone correpondant à l état de transition. L énergie de ce dernier augmente et donc Ea augmente. Il est important de noter que 14

CHAPITRE 4. TRANSFERT DE PROTON les valeurs de Ea sont très élevées, elles varient entre 5 et 2 kj.mol 1 ce qui rend le transfert de proton très peu probable. E (kj.mol -1 ) Ea (kj.mol -1 ) 5 45 4 35 3 25 2 2 15 1 5 a).26.28.3.32.34.36 b).26.28.3.32.34.36 N9-OE1 (nm) FIG. 4.6 Évolution de l énergie de réaction E et de la barrière d activation, Ea correspondant au transfert de proton en fonction de la distance donneur-accepteur dans l état excité fluorescent (en rouge) et l état fondamental (en noir). Les résultats des calculs quantiques dans le vide sur le système (chromophore+anion formiate), montrent que le transfert de proton selon une trajectoire rectiligne à distance N9-OE1 fixe est endothermique. D autre part, étant donné que la force d oscillateur reste constante quelque soit la distance N9-H9, le transfert de proton, s il a lieu, ne conduirait pas à une désactivation de la fluorescence mais à une nouvelle espèce émissive correspondant à l anion du chromophore. Cependant, pour discuter de la possibilité d un transfert de proton entre le chromophore et Glu222 dans la protéine il est indispensable de compléter ces résultats en prenant en compte l effet de l environnement. 4.3 Effet de l environnement Le chromophore et Glu222, modélisé par l anion formiate, est en fait immergé au sein de la protéine, elle même solvatée par un ensemble de molécules d eau. L ensemble de la protéine et des molécules d eau constitue l environnement. Son effet doit être pris en compte dans le calcul de la barrière d activation et de l énergie de réaction. Il est essentiellement dû aux forces électrostatiques exercées par l ensemble des charges portées par les atomes de la protéine et des molécules d eau. L effet électrostatique de l environnement peut être calculé de deux manières. Dans une première méthode, le calcul quantique est directement réalisé dans le champ électrique dû aux charges portées par les atomes de la protéine et des molécules d eau. Dans une deuxième méthode (appelée par la suite calcul indépendant ) nous avons calculé l énergie d interaction entre les charges de l environnement et les charges du système (chromophore+anion formiate). Cette énergie est ensuite ajoutée à l énergie quantique calculée dans le vide. 4.3.1 Méthodes de calcul 4.3.1.1 Calcul quantique dans le champ électrostatique des charges de l environnement Cette méthode est la plus exacte, elle permet de calculer les coubes d énergie potentielle en tenant compte de la polarisation de la densité électronique du système composé du chromophore et de l anion formiate par les charges portées par les atomes de la protéine et des molécules d eau. La figure 4.7 présente la courbe d énergie potentielle calculée pour la configuration de la protéine d où a été extraite la géométrie G à partir de laquelle ont été fais tous les calculs quantiques. 15

CHAPITRE 4. TRANSFERT DE PROTON 3 25 Energie (kj.mol -1 ) 2 15 1 5.1.15.2.25 N9-H9 (nm) FIG. 4.7 Courbes d énergie potentielle de l état fluorescent dans le vide (en noir), courbe d énergie potentielle calculée dans le champ électrostatique des charges de l environnement (en bleu). La contribution de l environnement (en rouge) est obtenue en faisant la différence des deux courbes d énergie potentielle précédentes. Les charges de l environnement ont un effet défavorable sur le transfert de proton. L énergie d interaction entre ces dernières et le système composé du chromophore et de l anion formiate augmente au fur et à mesure que le proton se déplace du donneur vers l accepteur. Ceci conduit a des valeurs de Ea et E plus élevées en présence des charges de l environnement que dans le vide. Etant donné la durée des calculs quantiques il est impossible de calculer les courbes d énergie potentielle en présence des charges pour chaque configuration extraite de la simulation. Pour obtenir des données statistiques sur les valeurs de Ea et E, une méthode de calcul plus rapide a été mise en place. 4.3.1.2 Calcul indépendant L intéret de cette méthode est qu elle permet d obtenir une évaluation rapide de la contribution de l environnement sur Ea et E. Pour ce faire, en chaque point d une courbe d énergie potentielle, c est à dire pour chaque distance N9-H9, l énergie est calculée en faisant la somme, d une part, de l énergie d interaction entre les charges du chromophore et de l anion formiate et celles de l environnement et d autre part, de la valeur en ce point de l énergie du système (chromophore+anion formiate) calculée dans le vide (paragraphe 4.2). Pour les atomes de la protéine et les molécules d eau, les charges utilisées sont issues du champ de force AMBER qui a été utilisé pour faire la simulation. Pour le chromophore et l anion formiate, les charges effectives sont ajustées pour qu elles reproduisent le potentiel électrostatique calculé au niveau CIS/6-31G*. Elles ont été calculées pour la géométrie d équilibre des réactifs (CroH, F OR ) et celle des produits (Cro, F ORH). En chaque point de la courbe d énergie potentielle elles sont obtenues par une interpolation linéaire entre les deux jeux de valeurs relatives aux réactifs et au produits. La figure 4.8 montre, pour la configuration à partir de laquelle la géométrie G a été définie, l allure de la contribution électrostatique de la protéine et des courbes d énergie potentielle dans le vide et dans la protéine. 16

CHAPITRE 4. TRANSFERT DE PROTON 3 25 Energie (kj.mol -1 ) 2 15 1 5.1.15.2.25 N9-H9 (nm) FIG. 4.8 Courbe d énergie potentielle dans le vide de l état fluorescent (en noir), contribution de la protéine (en rouge) et la courbe d énergie potentielle au sein de la proteine (en bleu) qui résulte de la somme de ces deux contributions. L effet de l environnement sur la courbe d énergie potentielle évalué avec cette deuxième méthode est similaire avec ce qui a été observé précédemment. Les charges portées par les atomes de la protéine et des molécules d eau conduisent à augmenter les valeurs de Ea et E, elles défavorisent le transfert de proton. 4.3.1.3 Comparaison des méthodes La figure 4.9 présente les courbes d énergie potentielle du système composé du chromophore et de l anion formiate pour l état excité F dans la géométrie G, calculées en tenant compte de l effet de l environnement avec les deux méthodes décrites ci-dessus. Energie (kj.mol -1 ) 4 3 2 1 Calcul indépendant Calcul dans le champ électrostatique.1.15.2.25 N9-H9 (nm) FIG. 4.9 Comparaison entre la courbe d énergie potentielle de l état F caclulée comme la somme d une contribution quantique et d une contribution électrostatique indépendante (noir) et celle calculée directement dans le champ électrostatique des charges de l environnement (rouge). Les deux courbes d énergie potentielle obtenues sont qualitativement les mêmes. L écart entre les résultats des deux méthodes est faible : il est de l ordre de 4.8 kj.mol 1 soit 3% pour Ea et de l ordre de 13.2 kj.mol 1 soit 1% pour E. Les résultats obtenus en faisant deux calculs indépendants pour le système quantique et l effet des charges de l environnement sont donc corrects. La polarisation de la densité électronique peut donc être négligée pour calculer l énergie de réaction et la hauteur de la barrière. L intérêt de faire cette approximation réside dans la possibilité de considérer un gand nombre de configurations de la protéine afin d obtenir une statistique réprésentative pour estimer la probabilité de transfert de proton. Quelque soit la configuration considérée, l effet de l environnement est similaire à celui observé sur la figure 4.8. Les charges portées par les atomes de la protéine et des molécules d eau défavorisent le transfert du proton. Cependant, ceci n est pas dû à l interaction entre H9 et l environnement, voir figure 4.1. 17