Chromatographie analytique sur couche mince et purification d un produit à l aide d une colonne chromatographique 13 mai 2009-1 - Coralie Fournier
1. But de l expérience Identifier les acides aminés contenus dans un mélange par la méthode de chromatographie sur couche mince. Puis purifier un mélange, en séparant l alcool et l ester et en éliminant le colorant alimentaire, à l aide de la chromatographie sur colonne. 2. Principe de la méthode La chromatographie est une méthode de séparation de produits. La séparation à lieu en fonction des affinités qu ont les différents produit avec les deux phases : mobile et stationnaire. La chromatographie sur couche mince (ccm) sert aussi bien à séparer les produits qu à les identifier. Le procédé de la couche mince est le suivant, déposer une goutte du produit à analyser sur une plaque, généralement de silice, puis y déposer aussi des gouttes des produit de références. La plaque est alors plongée dans une cuve avec du solvant qui montera le long de la plaque par capillarité. Les différents composés migrent avec le solvant à des vitesses différentes. Plus ils auront d affinité avec le solvant plus ils migreront vite. La chromatographie sur colonne est une technique de séparation efficace lorsqu un produit contient encore des impuretés. La colonne contient souvent un gel de silice (phase stationnaire). Les substances introduites au sommet de la colonne sont plus ou moins retenues dans la phase stationnaire suivant leur polarité et sont donc plus ou moins facilement entraînées par le solvant qui migre dans la colonne. 3. Chromatographie analytique sur couche mince (ECHANTILLN N 3) Acides aminées contenus dans le mélange : Alanine Phénylalanine Sérine Valine. 3.1 Partie expérimentale Déposer sur une plaque de silice, sur une même ligne, un spot de référence pour chaque acide aminés et un spot du mélange. Mettre la plaque dans la cuve où se trouve un fond de solvant. Dans ce cas, le solvant est un mélange de N-butanol(56.5%), CH3CH (21.7%) et H2 distillée (21.8%). Laisser un moment, le temps que le solvant migre le long de la plaque. Ressortir la plaque de la cuve, la laisser sécher, puis y vaporiser de la ninhydrine comme révélateur. La ninhydrine réagit avec les acides aminés en donnant le pourpre de Ruhemann ce qui permet de donner de la couleur et donc d observer les acides aminés. Finalement le coefficient de rétention peut être calculé. Réaction acide aminé et ninhydrine : H R H 2 N CH 2 NH + - Acide aminé Ninhydrine Pourpre de Ruhemann H H Hydrindantine 13 mai 2009-2 - Coralie Fournier
3.2 Résultats Schéma de la plaque de chromatographie obtenue : Tableau N 1 : Coefficient de rétention des acides aminés de référence Acide aminé Migration [cm] Rf Alanine 3.7 0.50 Phénylalanine 5.5 0.74 Sérine 3.4 0.46 Valine 4.4 0.59 Tableau N 2 : Coefficient de rétention des acides aminés contenu dans le mélange 3.3 Discussion Acide aminé Migration [cm] Rf Alanine 3.5 0.47 Phénylalanine 5.3 0.72 Sérine 3.0 0.40 Valine 4.3 0.58 Nous remarquons facilement que les quatre acides aminés sont contenus dans le mélange. Les Rf obtenus avec les acides aminés de référence sont légèrement différents de ceux obtenus pour le mélange, mais il reste tout de même très proche. Cette différence est peut-être due au faite que l éluant ne migre pas à la même vitesse uniformément sur toute la plaque de silice. 13 mai 2009-3 - Coralie Fournier
4. Purification d un produit organique à l aide d une colonne chromatographique 4.1 Partie expérimentale Rendement de la colonne = 95% Préparer la colonne, avec du gel de silice, y introduire le produit dilué à la surface. Attendre que la produit migre le long de la colonne. Plusieurs fractions sont récupérées dans des éprouvettes. Les premières éprouvettes ne contiennent pas de produits, uniquement du solvant. La présence de produit dans les éprouvettes est vérifiée par CCM et observée sous lumière UV. Dans les prochaines éprouvettes sont récupérés les produits, tout d abord les moins polaires suivis de ceux qui le sont plus. Les éprouvettes contenant les mêmes produits sont réunies et passées au rotavap pour évaporer tout le solvant, les produits séparés peuvent alors être récupérés. 4.2 Résultats Schéma des plaques CCM obtenues : 13 mai 2009-4 - Coralie Fournier
Masse d alcool pur = 0.7 g Masse mélange alcool et ester (avec principalement de l ester = 1.1 g Masse ester pur = 0.1 g Calcul du rendement : η = MasseProduitRécupéré MassePr oduitdépart = 1.9 = 0.95 = 95% 2.0 4.3 Discussion Nous obtenons un bon rendement, la petite perte est due au colorant alimentaire qui ne migre pas dans la colonne, car trop polaire, il reste donc retenu par la phase stationnaire. Nous remarquons que c est tout d abord l alcool qui migre et sort de la colonne, il est donc moins polaire que l ester qui ne sort qu en second. Dans les éprouvettes 6 et 7, il persiste un mélange des deux produits, mais l ester y est présent en grande majorité. 13 mai 2009-5 - Coralie Fournier