Peroxyde et catalase Le peroxyde H 2 O 2 est un composé de l'oxygène qui est thermodynamique ment instable. En présence d'un catalyseur approprié il se décompose en oxygène et en eau : Réaction de dismutation : 2H 2 O 2 2H 2 O + O 2 Le peroxyde avec un nombre d'oxydation de -1 réagit avec lui-même pour donner l'oxygène avec un nombre d'oxydation de 0 et de l'eau avec un nombre d'oxydation de -2. Le peroxyde reste un oxydant puissant utilisé comme décolorant non seulement des cheveux mais aussi du papier. Il a, dans ce dernier cas, l'avantage sur le chlore ou les oxydes de chlore de ne pas générer des halogénés toxiques (dioxines). En solution concentrée (100 %) il est utilisé comme comburant dans les fusées et les systèmes de guidage de satellites. En solution à 35 % sa manipulation n'est pas dangereuse si les précautions habituelles sont prises. Il faut toujours prévoir que, sous certaines conditions, il peut se décomposer en générant un important volume d'oxygène et pour la solution à 35 % un dégagement de chaleur (vapeur d'eau) amenant le liquide à ébullition. Au contact de la peau il cause une brûlure superficielle qu'un simple rinçage à l'eau peut empêcher et qui ne laisse pas de séquelle car le dégagement d'oxygène empêche une attaque en profondeur de la peau comme dans le cas des acides ou des bases fortes. Comme première expérience vous aurez à titrer un échantillon individuel de peroxyde en utilisant une solution de thiosulfate de sodium qui aura elle-même été titrée sur deux étalons primaires soit de l'iodate de K et le bichromate de K. Distribution des tâches : Par équipe de 4 étudiants, préparer en début de séance les solutions suivantes : Thiosulfate 0.10 M Bichromate de K 1/60 M Iodate de K 1/60 M Tampon phosphate HCl 5 M H 2 SO 4 2 M fait par la technicien(ne) Glucose 20% p/v Chaque membre effectue deux titrages 1. Du thiosulfate par le bichromate de potassium (2 mesures concordantes par étudiant pour un total de 8 mesures). 2. Du thiosulfate par l iodate de potassium (2 mesures concordantes par étudiant pour un total de 8 mesures). Individuellement : Titrez votre échantillon inconnu de peroxyde (au moins 3 titrages). 1
PROTOCOLE : A- Solutions à préparer : Bichromate de potassium standard primaire : Peser sur une balance analytique autour de 2,0 g de K 2 Cr 2 O 7 séché à 110 C. Transférer dans une fiole de 500 ml. Compléter à moitié avec de l'eau distillée. Agiter pour dissoudre le sel. Lorsque dissout, compléter jusqu'au trait de jauge. Iodate de potassium standard primaire : Peser sur une balance analytique autour de 1,8 g de KIO 3 séché à 110 C. Transférer dans une fiole de 500 ml. Compléter à moitié avec de l'eau distillée. Agiter pour dissoudre le sel. Lorsque dissout, compléter jusqu'au trait de jauge. Thiosulfate 0.10 M standard secondaire Peser au 0,01g près 100 g de thiosulfate de sodium Na 2 S 2 O 3.5H 2 O, Transférer le thiosulfate de sodium dans une fiole jaugée de 1 L. Compléter à moitié avec de l'eau distillée. Ajouter un peu de carbonate de sodium (0,1 g) et agiter pour dissoudre le sel. Lorsque dissous, compléter jusqu'au trait de jauge. Transférer dans un contenant en polythène de 4 L. Ajouter 3 autres litres d'eau pour un total de 4 L et agiter fortement pour bien mélanger. Tampon phosphate 0,1 M ph 6,95 ± 0.15 : Dissoudre 15,22 g de K 2 HPO 4.3H 2 O et 4,54 g de KH 2 PO 4 dans l'eau. Compléter à 1L. Solution de HCl 5 M : Mettre 200 ml d'eau dans une fiole jaugée de 1L. Opérez sous la hotte : Avec précaution, ajoutez 400 ml de HCl concentré mesuré au moyen d'un cylindre gradué. Compléter jusqu'au trait de jauge avec de l'eau. Solution de glucose : Mettre dans un erlenmeyer de 125 ml, 100 ml de la solution de tampon phosphate. Ajoutez 20 g de glucose. Agitez pour dissoudre. Solutions d'amidon et de H 2 SO 4, seront déjà préparées. 2
Iodure de potassium (KI) sera fourni en solide à votre table de travail: Pour l'ensemble des titrages avec le thiosulfate, l'oxydant (peroxyde, bichromate, iodate) réagit avec un excès d'iodure pour former l'ion tri iodure qui réagira avec le thiosulfate. On ajoute du KI à la dernière minute pour éviter que celui-ci en réagissant avec l'oxygène de l'air ne forme de l'ion tri iodure faussant ainsi le résultat. C'est pourquoi on ajoute le KI sous forme de sel et non sous forme de solution. Pour éviter de vous retrouver continuellement devant la balance, peser quelquefois entre 1 et 2 g de KI en notant quel volume ce poids représente sur la pointe de votre spatule. Utilisez une quantité analogue pour tous vos titrages. La réaction d'oxydation de l'iodure en tri iodure n'est pas une réaction très rapide, c'est pourquoi on ajoute du HCl 5M rendant le milieu 1M en H +. B- Manipulations 1- Étalonnage de la solution de thiosulfate avec le bichromate Remplissez votre burette de 50 ml avec la solution de thiosulfate. Pipetez 40 ml de la solution de bichromate dans un erlenmeyer de 125 ml. Ajoutez 1-2 g d'iodure de potassium et 10 ml de H 2 SO 4 2M au cylindre gradué. N.B. Il n est pas nécessaire de peser le KI à toutes les fois, une évaluation visuelle de la quantité sur une spatule est suffisante. La solution est brun foncé au début du titrage car l ion triiodure est en quantité importante, elle devient jaune verdâtre lorsque la concentration d'iode diminue. Titrez par le thiosulfate jusqu'à ce que la solution devienne brun-verdâtre. À ce moment, ajoutez environ le contenu d une pipette Pasteur d'amidon qui colorera la solution en bleu foncé (résultat de l association d I2 avec l amidon. Titrez par le thiosulfate jusqu'à la disparition de la couleur bleue foncé intense du complexe d amidon. Compte tenu de la présence de Cr 3+ la solution restera bleu-acier au point de virage. Le bichromate orangé se transforme en Cr 3+ bleu en milieu acide 2- Étalonnage de la solution de thiosulfate avec l'iodate Remplissez votre burette de 50 ml avec la solution de thiosulfate. Pipetez 40 ml de la solution d'iodate dans un erlenmeyer de 125 ml. Ajoutez 1-2 g d'iodure de potassium et 10 ml de HCl 5M au cylindre gradué. Titrez par le thiosulfate jusqu'à ce la solution devienne jaune pâle. A ce moment ajoutez de l'amidon qui colorera la solution en bleu foncé. Titrez jusqu'à incolore. Attention, le virage est très prononcé. 3-Échantillon de peroxyde. Dilution de l échantillon inconnu de peroxyde. Notez dans votre cahier le # de votre inconnu Pesez environ 12 g (au 0,01 g près) de l échantillon dans une fiole jaugée de 250 ml et complétez au trait de jauge. 3
Titrage de la solution diluée de l inconnu peroxyde Pipetez 40 ml de la solution diluée de votre échantillon de peroxyde dans un erlenmeyer de 250 ml. Ajoutez 50 ml d'eau et 50 ml de H 2 SO 4 2M au cylindre gradué. Ajoutez un morceau de 1cm de glace sèche (obligatoirement avant le KI) Ajoutez 1-2 gr d iodure de potassium. Il n est pas nécessaire de peser le KI à toutes les fois. Une évaluation visuelle de la quantité sur une spatule, par exemple, est suffisante. Ajoutez 3 gouttes de la solution de molybdate d ammonium 3%. Agitez et laissez reposer 1-2 minutes pour que la réaction entre le peroxyde et l iodure soit complète. Titrez avec le thiosulfate 0,10 M déjà préparé jusqu à presque disparition de la couleur jaune. Ajoutez quelques gouttes d amidon Comme la solution est relativement concentrée, l addition de l amidon n est pas nécessaire mais vous pouvez le faire cependant. Titrez jusqu à ce que la solution devienne incolore. Répétez pour avoir trois mesures concordantes. Faites vos calculs de la molarité du thiosulfate et de la concentration en % (p/p) de H 2 O 2 de votre inconnu. Équations IO - 3 + 6H + + 6e - I - + 3H 2 O Cr 2 O 2-7 + 14H + + 6e - 2Cr 3+ + 7H 2 O 2-2 S 2 O 3 S 4 O 2-6 + 2e - H 2 O 2 + 2H + + 2e - 2H 2 O 4
Catalase (travail partagé par 2 équipes) Extrait d'épinard Peser 2 g de feuilles d'épinard en prenant de préférence la partie verte. Mettre dans un mélangeur contenant 200 ml d'eau froide et 50 ml de la solution de tampon phosphate. Mettre le mélangeur en marche en augmentant la vitesse peu à peu. Mélanger pendant environ 2 minutes. Vous obtenez ainsi une suspension ne contenant pas de gros fragments d'épinard. Filtrer avec du coton à fromage. Solution de peroxyde 0,20 M Mesurez 50 ml de peroxyde 3% et transférez-le dans un ballon jaugé de 250 ml. Complétez au trait de jauge. Évaluation de la dilution pour mesure cinétique Pour avoir une mesure valable de la cinétique de la réaction de la catalase il faut qu'une fraction d au plus 20% du peroxyde dans la solution réagisse pendant la période de mesure. Comme vous ne connaissez pas à l'avance l'activité de la catalase dans votre extrait d'épinard, il faudra faire une première série pour trouver la concentration optimale pour la mesure de la cinétique. Vous utiliserez différentes dilutions de la solution de catalase et évaluerez la quantité restante de peroxyde après 8 minutes. Préparez, dans des erlenmeyers de 100mL, les solutions suivantes: Solution Eau Solution de glucose Extrait d'épinard (ml) (ml) (ml) A 40 5 10 B 45 5 5 C 48 5 2 D 49 5 1 E 50 5 0 Pour ajouter rapidement le peroxyde vous utiliserez la pipette automatique de 5 ml (P5000). La réaction doit durer 8 minutes pour chacun des erlenmeyer, vous partirez donc les réactions, en ajoutant successivement à toutes les trente secondes, un 5 ml de peroxyde à chacun des erlenmeyers (une seule fois 5 ml de H 2 O 2 pour chaque tube mais à 30 secondes d intervalle) Au bout de huit minutes, vous arrêterez les réactions dans le même ordre à toutes les trente secondes, avec l'addition de 10 ml de HCl 5M mesuré approximativement dans un cylindre gradué. Titrez comme précédemment chaque erlenmeyer pour connaître le peroxyde résiduel. Ajouter d un morceau de glace sèche. Ajouter de 1-2g de KI au moyen d une spatule Ajouter 2 à 3 gouttes de molybdate d ammonium. Agiter et attendre 1-2 minute que la réaction entre le peroxyde et l iodure soit complétée. 5
Vous procédez au titrage avec le thiosulfate et vers la fin du titrage n oubliez pas d ajouter l amidon comme précédemment. D'après les résultats obtenus, évaluez le volume d'extrait d'épinard qui décompose moins de 20% du peroxyde durant les huit minutes. Il reste donc 80% du peroxyde. Mesure cinétique Utilisant le volume (X) d extrait d épinard qui décompose moins de 20 % du peroxyde durant les huit minutes selon les résultats de l expérience précédente, préparez dans des fioles coniques (Erlenmeyers) de 100mL les trois solutions suivantes. Solution Eau Solution de glucose Extrait d'épinard Temps de réaction (ml) (ml) (ml) (min) A 45-X 5 X 3 B 45-X 5 X 6 C 45-X 5 X 9 Ajoutez à trente secondes d intervalle 5 ml de peroxyde aux tubes A, B puis C et arrêtez les réactions au bout de 3 min pour le tube A, 6 pour le tube B et 9 minutes pour le tube C. L'arrêt se fait par : Addition de 10 ml de HCl 5M mesuré approximativement dans un cylindre gradué Ajout d un morceau de glace sèche. Addition de 1-2g de KI au moyen d une spatule Ajout de deux à trois gouttes de molybdate d ammonium. Attendre 2 à 3 minutes Procéder au titrage avec le thiosulfate comme précédemment n oubliez pas d ajouter l amidon vers la fin du titrage (Valeur au temps zéro 0) Il faut faire une mesure supplémentaire permettant de mesurer la quantité de peroxyde présente au temps 0. En enzymologie il est d usage de préparer un tube où la réaction sera bloquée avant de la débuter : Dans une fiole conique (Erlenmeyer) de 100 ml vous ajoutez successivement 45 - x ml d'eau x ml d'extrait d'épinard 5 ml de solution de glucose 10 ml de HCl 5M mesuré gradué ainsi la réaction potentielle de la catalase est bloquée. 5 ml de peroxyde 0,2M. Titrez comme précédemment l erlenmeyer pour connaître le peroxyde résiduel. 6