Test HPV en pratique C. PASQUIER Laboratoire de Virologie, IFB CHU de Toulouse Oncomip 29/09/11
Plan Physiopathologie de l infection Les Tests HPV : principes et intérets La situation actuelle : nomenclature et indications Mise en oeuvre d un test HPV
Plan Physiopathologie de l infection Les Tests HPV : principes et intérets La situation actuelle : nomenclature et indications Mise en oeuvre d un test HPV
Structure des HPV Petit virus nu (55 nm), Capside icosédrique 200 types Virus ubiquiste (commensal)
De multiples types d HPV Cutanéo-muqueux Cutané Cutané Cutané
Le génome viral ADN db circulaire, 8 kb oncogénèse L1-L2 Capside VLP (virus-like particles) E1-E4 réplication
Les 2 formes du génome viral Episome vs linéaire intégré oncogénèse L1-L2 Capside VLP (virus-like particles) E1-E4 réplication
Réplication des HPV Frazer, Nature Rev Immunol 2004
Infection par HPV Différenciation cellulaire. Infection des cellules basales. Zones de jonctions épithéliales. Microlésions?
Infection récente virions Asymptomatique ++ Condylomes acuminés Koïlocytose.Transmission ++ IST.Délai d apparition cours.récidives fréquentes.hpv-6, 11 (BR>>HR) Infection productive Episomes. Evolution vers guérison. Evolution vers infection persistante
Evolution vers la guérison Différenciation cellulaire. Latence dans les cellules basales. Contrôle immunitaire. Immunité spécifique de type. Tests HPV négatif
Evolution vers infection persistante Dysplasie CIN I E6/E7.Transmission faible. Délai d apparition long. Récidives rares. Régression très fréquente. HPV-16, 18 (HR)
Infection persistante Dysplasie CIN II E6/E7.Transmission faible. Délai d apparition long. Récidives rares. Régression possible. HPV-16, 18 (HR)
Infection persistante Dysplasie CIN III E6/E7.Transmission faible. Délai d apparition long. Récidives rares. Régression rare. HPV-16, 18 (HR)
Infection persistante Cancer in situ / invasif E6/E7.Transmission faible. Délai d apparition long. Récidives rares. HPV-16, 18 dans plus de 70% des cas (HR)
Carcinogénèse du col utérin Infection transitoire Infection persistante HPV-HR + Cofacteurs: tabac, grossesses multiples, immunodépression, Progression Invasion Col sain infection Lésions précancéreuses cancer Contrôle imunologique Clairance Régression 10-15 ans
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Objectifs des tests HPV Détection de l infection à HPV Prédiction du risque de dysplasies et Cancers??! Corrélation avec histologie
Les tests disponibles Détection par PCR consensus ADN HPV ± typage Détection ARNm E6-E7 HPV-HR Détection ADN HPV-HR
PCR concensus Amplification région L1 (HPV-HR/BR) Typage des amplicons : séquençage + phylogénie Fragment long Sensibilité ++ Typage exhaustif Non commercialisé Hybridation sur bandelette Fragment court Sensibilité +++ 25 à 37 types Lecture ± automatisée Inno-Lipa HPV genotyping (Innogenetics) Linear Array HPV Genotyping (Roche Diagnostics) Hybridation sur puce Fragment court Sensibilité +++ 24 à 35 types Lecture automatisée CLART (Genomica) PapilloCheck (Greiner)
Détection ARNm E6-E7 Amplification ARNm E6 et E7 Détection automatisée Nuclisens EasyQ HPV (BioMérieux - Proofer) Discrimination des types : 16, 18, 31, 33, 45 APTIMA HPV Assay (Gen-Probe) Détection des 14 HPV-HR Spécificité accrue, conservation des ARN Hors nomenclature
Détection ADN HPV-HR Amplification / Hydridation Détection automatisée Hybrid Capture II (Digene - Qiagen) Real-Time HR HPV (Abbott) Cobas 4800 HPV (Roche) Hybridation ADN/ARN Pas de discrimination des types 13 HR (possible 5 BR) PCR-temps réel Discrimination : 16, 18, autres 12 HR PCR-temps réel Discrimination : 16, 18, autres 12 HR Automatisation ++ Automatisation +++ Automatisation +++ Pot natif Sensibilité ++ Long++ Sensibilité +++ Sensibilité +++
Autres tests Quantification : 16 et 18 (protocole ANRS), non commercialisé Détection ADN HPV intégré : non commercialisé
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Situation actuelle CODE : ZZQP173-4127 LIBELLE : papillomavirus humains (HPV) oncogènes : détection du génome viral (ADN) Code regroupement : ATM - Acte technique médical Prix de l'acte : 37,8 euros (B140, P139) Notes : Indication : selon les recommandations de bonnes pratiques Anaes 2002 (frottis ASC-US) Formation : spécifique : formation à la biologie moléculaire Environnement : spécifique : à réaliser dans les mêmes conditions que celles des laboratoires d'analyse de biologie médicale
Nomenclature ABM 2004 Identification des ASC-US à risque (Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance) ASC-US Colposcopie + biopsie HPV HR FCV (6 mois) FCV (1 an) FCV (routine)
Autres indications Suivi post-conisation Quel test? Dépistage primaire d infections HPV persistantes Tests ADN HPV positifs (intervalle > 1 an) Très bonne valeur prédictive négative cancer du col Spécifique de l infection HPV pas du cancer du col! Algorithme de dépistage (FCV) Expertise médicale Typage nécessaire Comparaison de séquences
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Mise en œuvre Laboratoire de biologie moléculaire Gestion du risque infection Gestion du risque de contamination BM Validation de la méthode Gestion de la qualité des échantillons Gestion de la traçabilité Référentiels GBEA COFRAC ISO 15189
Gestion du risque infectieux Faible avec HPV Possible autres pathogènes associés : HSV, Chlamydiae, Gonocoques, Mycoplasma, HIV, Milieux fixateurs PSM pour manipulations préanalytiques Procédure de décontamination Surface de manipulation Laboratoire Exposition du personnel
Gestion du risque de contamination en BM Lié à la diffusion des amplicons Adaptation des locaux Classiques 3 pièces ou moins si automatisé Laboratoire(s) avec accès contrôlé (Sas) Conditions de manipulation tenue, hotte PCR, Procédure et mode opératoire, formation, Décontamination KOH, NaOCL, HCL Aliquotage et conservation des réactifs
Gestion de la qualité des échantillons Standardisation des échantillons Cellularité des échantillons Contrôle d un gène de ménage Absence d inhibiteur de PCR (QC)
Validation de la méthode Contrôles des performances sur sites Comparatif avec données du fabricant Comparatif avec la méthode précédente Spécificité Répétabilité/reproductibilité Sensibilité diagnostique Contamination
Gestion de la traçabilité Chaîne d information validée Lien patient échantillon Lien entre les différentes de l analyse Lien bidirectionnel avec l informatique de labo Conservation de l échantillon ( 1 an) et du résultat (indéfinie)
Contrôles Contrôles du fabriquant Témoin négatif / positif Contrôles de qualité interne indépendant (CQII) Validation indépendante de la totalité process Validation des lots de réactifs Contrôles de qualité externe (CQE)
Conclusions Physiopathologie complexe Des tests et des indications en évolution Une nomenclature en retard Un test de biologie moléculaire automatisé avec une praticabilité en hausse