Analyses microbiologiques de l'eau à l'hôpital Dr. Dominique Blanc, MER, PD Laboratoire d'épidémiologie Service de Médecine préventive hospitalière
L eau à l hôpital Consommation par patient: 750-1000 litres par jour Consommation domestique par personne: 150 200 litres par jour
Les différentes eaux et leur utilisations Eaux potables Eaux techniques Eaux stériles conditionnées Eaux bactériologiquement maîtrisées
Eaux potables (froide et chaude) Types Eau du réseau d adduction Eaux conditionnées en bouteilles Eaux des fontaines réfrigérées Utilisation Alimentation humaine, hygiène corporelle, lavage des mains, soins: douche préopératoire, lavage gastrique, lavement et goutte-à-goutte rectal, plâtre Alimentation humaine Alimentation humaine
Eaux techniques Type Utilisation eau pour la climatisation Humidification de l'air. eau pour la production de glace Glace alimentaire et non alimentaire Eau des tours de refroidissement Refroidissement de l'air ou de système
Eaux stériles conditionnées Conforme à l essai de stérilité (Pharmacopée) Type eau purifiée (bidistillée) stérile eau stérile qualité injectable eau stérile pour préparation des injectables Utilisation Destinées aux soins et à la production de médicaments non injectables Préparation des médicaments injectables Utilisée à la pharmacie
Eaux bactériologiquement maîtrisées Eau purifiée Eau hautement purifiée Eau de dialyse Eau de rinçage des fibroscopes Eau pour la stérilisation centrale
Eau purifiée Pharmacopée Européenne: eau utilisée pour la fabrication de médicaments non stériles Norme: <10 2 germes aérobies mésophiles revivifiables /ml
Eau hautement purifiée Pharmacopée Européenne: eau utilisée pour la fabrication de médicaments non stériles lorsqu'une eau de qualité élevée est nécessaire Norme: <10 germes aérobies mésophiles revivifiables / 100 ml
Eau pour dilution des solutions concentrées pour hémodialyse Pharmacopée Européenne (6.0) Nombre de germes aérobies viables totaux: <10 2 microorganismes/ml = eau purifiée!
European Best Practice Guidelines for Haemodialysis Eau hautement purifiée Recommandée pour: Hémodialyse conventionnelle Hémodialyse conventionnelle à haut flux Obligatoire: Hémofiltration en ligne Nephrol Dial Transplant 2002, 17 (suppl 7):45-62
Eau de rinçage des L/D, norme 15883-1 chap. 6.4.2.4: Effectuer un dénombrement de la flore bactérienne mésophile aérobie viable Filtration sur membrane d un échantillon de min. 100 ml d eau de rinçage finale Pas de quantité minimale admissible!!! Le but est de suivre les tendances de la biocontamination et de définir ses propres niveaux d'actions
Eau de rinçage final des L/D d endoscopes thermolabiles - norme 15883-4 chap. 4.9.2.3 et 6.3 <10 cfu/ 100 ml de bactéries mésophile aérobie viable Absence de Pseudomonas aeruginosa / 100 ml Absence de Legionella / 100 ml Absence de Mycobacteria / 100 ml
Surveillance microbiologique des eaux à l'hôpital Type d'eau Recherche Normes Eau purifiée Germes totaux Pha. Eur. Eau hautement purifiée Germes totaux Pha. Eur. Eaux pour dialyse conventionnelle Eaux pour hémodiafiltration Eau de rinçage des L/D fibroscopes Germes totaux Germes totaux Germes totaux, Pseudomonas, légionelles, mycobactéries Pha. Eur. Euro. guideline Euro. guideline Norme ISO 15883-4 Eau potable Légionelles Rec. OFSP Eau des tours de refroidissement Légionelles Rec. OFSP
Comment mesurer le nombre de germes? Quelques notions de microbiologie
Enumération des germes Compte cultivable ou revivifiable Viable, cultivable Compte viable Viable, non cultivable Compte total Morte
Méthodes de dénombrement Culture : une particule donne naissance à une colonie: ufc (ou cfu) Viable, cultivable Viable, non cultivable Colorations biochimiques Microscopie Morte
Germe viable non cultivable Métabolisme de la bactérie trop différent de celui qu elle devrait utiliser dans le milieu de culture (stress) Pas de croissance sur le milieu de culture (manque facteur de croissance) Pas de croissance dans les conditions de culture (T, air, durée ) Influence sur le dénombrement des germes!!!
Température et croissance bactérienne Psychrophiles: 10 C (-5 à 15 C) Psychrotrophes: 25 C (0-35 C) Mésophiles: 35 C (20 à 40 C) Thermophiles: 45-50 C
Effet du milieu, de la méthode d ensemencement et de la durée d incubation sur le dénombrement de germes totaux dans l eau minérale 10'000 Incubation 2 versus 5 j: 10 X 1'000 100 Milieux KAB versus R2A: 100 X 10 Milieu R2A, méthode étalement Milieu R2A, méthode incorporation Milieu KAB, méthode incorporation Korsholm et Sogaard, 1987, Zbl Bakt. Hyg. B. 185:112
Croissance des germes: fonction des conditions de culture Composition du milieu (pauvre, riche..) Température d incubation Atmosphère d incubation Durée d incubation
Enumération des germes Aucune méthode ne permet de définir une mesure absolue Cette mesure relative est un indicateur Comme tout indicateur, c'est sa variation au cours du temps qu'il faut suivre Nécessite que le laboratoire utilise toujours la même méthode
Biofilm Assemblage d'organismes microscopiques (bactéries, algues, protozoaires ) attachés à une surface, dans une matrice de polymères produite par l'organisme lui-même. Formation de biofilm: sur n'importe quelle surface qui est exposée à un liquide non stérile (environnement, industrie, médecine...)
Répartition des germes dans un volume d'eau Culture de laboratoire Prélèvement d'environnement
Charge faible en microorganismes: Filtration sur membrane Volume: 10 ml 1000 ml Déposez la membrane sur la surface d une plaque gélosée Dénombrez les colonies qui se sont développées Pharmacopée Européenne
Charge moyenne en microorganismes: Dénombrement sur plaques par étalement en surface Volume: 0.1 0.2 ml étalez l échantillon sur le milieu gélosé Si nécessaire, diluez l échantillon afin d obtenir un nombre présumé <300 colonies. Pharmacopée Européenne
Quel volume d'eau analyser? Volume Seuil Pha Eur Eau hautement purifiée Seuils CHUV Seuil Pha Eur Eau purifiée 200 μl 20 ml 100 ml 200 ml 1 2 4 20 200 1 2 10 20 100 200 400 1 10 100 500 1 10 20 100 200 400 cfu/plaque 0.005 0.05 0.1 0.5 1 2 5 10 20 100 1000 cfu/ml
EN ISO 19458 Qualité de l eau: Echantillonnage pour analyse microbiologique Plan et points de prélèvements Représentatifs de toute la variation géographique et temporelle L hétérogénéité du système doit être prise en considération Ex. les point d un réseau ne sont pas équivalents car il peut exister des culs-de-sac et des sections où le débit est réduit
Quelle eau analyser? Eau de ville (100 cfu/ml) Eau purifiée Dialysat frais Traitement (osmose inverse, filtration etc.) Filtre Dialyseur Patient Concentré Dialysat utilisé
Technique de prélèvement EN ISO 19458 Qualité de l eau: Échantillonnage pour analyse microbiologique Formation du personnel effectuant les prélèvements Flacons de prélèvements: propres et stériles (si réutilisé: attention à ce que le processus de lavage/désinfection ne laisse pas des résidus de désinfectants)
Technique de prélèvement EN ISO 19458 Qualité de l eau: Échantillonnage pour analyse microbiologique Prélèvement à un robinet: Type d eau Retirer les accessoires et les inserts Désinfecter Rincer Eau dans le réseau principal Oui Oui Oui Eau telle qu elle parvient au robinet Oui Oui Non (bref) Eau telle qu elle est utilisée Non Non Non Désinfection: flambage, solution alcoolique ou chlorée Rinçage: abondant (???) ou bref pour annuler les effets de la désinfection du robinet
Technique de prélèvement EN ISO 19458 Qualité de l eau: Échantillonnage pour analyse microbiologique Prélèvement à un robinet: Veiller à ce que les échantillons soient prélevés de façon aseptique avec des mains propres ou en utilisant des gants stériles (désinfection des mains et port de gants non stérile), en protégeant l échantillon contre les courants d air et les éclaboussures Pendant le remplissage, le bouchon du flacon ne doit pas entrer en contact avec aucun élément (doigts, sol, poche, dents) Laisser un volume d air dans le flacon de sorte à permettre l agitation appropriée avant l analyse Fermer le flacon immédiatement. Ne pas utiliser cet échantillon d eau pour la mesure de la T ou autre paramètre mesuré sur site
Formulaire de prélèvement EN ISO 19458 Qualité de l eau: Échantillonnage pour analyse microbiologique Identifier et étiqueter le flacon de manière unique Remplir le formulaire de prélèvement avant ou immédiatement après le prélèvement Nom et adresse du client Liste des paramètres à analyser Date, heure et site du prélèvement Nom de la personne ayant prélevé l échantillon Nature de l échantillon Objectif de l analyse (choix des méthodes) Autres si nécessaires (T, )
Transport et conservation EN ISO 19458 Qualité de l eau: Échantillonnage pour analyse microbiologique Transport Protéger les prélèvements contre les rayonnements solaires (effet de stérilisation ) Réfrigérer les échantillons (mais pas les congeler! ->mort de >99% des cellules) Si la microflore se multiplie: la vitesse de multiplication est d autant plus grande que la T est élevée Si la microflore est en train de mourir, la réaction est accélérée lorsque la T augmente Délai Plus le délai est long entre le prélèvement et l analyse en laboratoire, plus la fiabilité des résultats est diminuée < 8h. (le jour même)
Fréquence des tests Ex. Qualité de l eau de rinçage final des L/D d endoscopes thermolabiles (ISO 15883-4) Bactéries mésophiles aérobies viables: Avant la mise en production Régulièrement après la mise en production: Chaque semaine jusqu à ce qu il ait été établi que la qualité de l eau est régulière, puis à des intervalles plus étendus P.aeruginosa, Legionella et mycobacteria Avant la mise en production Au moins annuellement