OPTIQUE POUR LA BIOLOGIE Yves USSON, Lab. TIMC- IMAG, Université Grenoble Alpes InvenHon airibuée aux ophciens hollandais Hans et Zacharria Janssen et son fils en 1590. Galilée 1609 : un occhiolino, un microscope composé d'une lenhlle convexe et d'une autre concave. Ce serait Antoni van Leuuwenhoek (1632-1723) qui a_ré l aienhon des biologistes sur les possibilités et l intérêt de la microscopie. 1
Bibliometry (Web of sciences) CLSM GFP & TPE EPI-FLUORESCENCE Microscopie confocale Stratégie : rejeter la lumière hors focale Approche : filtrage ophque 2
InvenHon of confocal microscope Marvin Minsky (1957) Confocal : conjugaison de plan focaux Source laser Plan focal source Plan focal objet Plan focal de détechon ObjecHf PM Specimen «pinhole» Filtre d arrêt 3
Confocal microscopy SecHonnement ophque Mitochondries dans une cellule vivante (rhodamine 123) 5 µm ConvenHonnel confocal Microscopie à excita#on à deux photons Stratégie : confiner la lumière d excitahon au foyer de la lenhlle Approche : excitahon non- linéaire 4
Principe confocal ExcitaHon bi- photonique Rejet des photons Hors- focaux Provoquer l excitahon Au niveau du foyer Comparaison entre SPE et TPE SPE TPE S1 S1 S 1 S λi 1 σ a2 σ a λe > λi ΔT λe < λi λi λi σ a1 S0 Excitation linéaire Emission σ SPE = σ a = 10-16 cm 2 S0 Excitation non-linéaire Emission σ TPE = σ a1 σ a2 ΔT = 10-34 cm 4.10-15 s 5
ExcitaHon à deux photons Requis: Une très grande densité en photons - Temporelle: Deux photons doivent aieindre le fluorophore dans un temps ultra- bref femto- seconde pulsed IR laser - SpaHale: Deux photons doivent aieindre le même fluorophore condihon obtenue grâce au fort pouvoir de focalisahon d un objechf à grande ouverture numérique : forte densité au foyer de la lenhlle ExcitaHon à deux photons DiluHon spahale Confinement temporel temps Confinement spahale Confinement temporel 6
Propriétés de l excitahon à deux photons SPEF TPEF SoluHon de FITC ExcitaHon 488nm ExcitaHon 976nm ObjecHf x10 Confinement de la fluorescence y ExcitaHon à deux photons Confinement du «photo- blanchissement» Zone de blanchissement GFP Fluorescence (TPEF) x z 0,6µm 7
Vers la super-résolution STED, PALM, SR-SIM STED : Modelage de l émission de fluorescence par déplétion forcée PALM : Détection de signaux ponctuels, ajustement SR-IM : Illumination structurée STED microscopy : STimulated Emission DepleHon Based sur l uhlsiahon simultanée de deux sources lasers, la première d excitahon normale (λi), la seconde (spahalement structurée) de dépléhon (λe) créant de la diffusion avant (λs). S1 SPE ns S1 SE ps λs S0 λi Absorption linéaire λe > λi S0 λi Absorption linéaire λe = λs Emission (ns) DépléHon forcée Diffusion vers l avant 8
Excitation Emission Fluorescence ns Z Excitation Dépletion, Diffusion forcée Emission finale STED ns Z Principe du STED D après S. Hell 9
Comparaison, Confocal versus STED D après S. Hell Photo Activated Localization Microscopy Repose sur la combinaison de deux approches : 1 ) Allumage sélectif et séquentiel des fluorophores : système de photoactivation à bas régime, puis photoblanchiment 2 ) Localisation du fluorophore allumé par application d un modèle de PSF, stockage de la position dans une nouvelle image 10
Tâches de diffrachon non résolues Photo AcHvated LocalizaHon Microscopy Fluorophore commutable Fluorophore commutable Ajustement PSF Détection du centre Points résolus Ajustement PSF Détection du centre After S. Hell 11
PhotoacHvated LocalizaHon Microscopy (PAL- M) SIM : structured image microscopy Repose sur une modulation spatiale de l amplitude d excitation du champ microscopique avec une fréquence égale à la fréquence de coupure de la lentille objectif. Par calcul on déploie le repli spectral créé par la modulation d amplitude. 12
La lenhlle réelle considérée comme un filtre passe- bas a b amplitude b-a b+a amplitude Fréquence spahale sin a. sin b = 0,5.(sin(b-a) + sin(b+a)) Fréquence spahale Modulation à la fréquence de coupure Repliement spectral amplitude amplitude fréquence spahale Filtrage passe- bas de la lenhlle fréquence spahale Déploiement spectral numérique 13
Structured Illumination Microscopy (SR-SIM) Amélioration : distance de résolution divisée par deux (à trois) Au delà de la fluorescence" Techniques de Microscopie Interférentielle! Digital Holographic Microscopy (DHM)! & Optical Coherent Tomography (OCT) 14
Digital Holographic Microscopy (DHM)! Stratégie : Holographie et reconstruction numérique! Approche : Holographie/interférométrie! Requis et propriétés:!!! Pas de nécessité de marquer ou colorer!!! Compatible avec des cellules vivantes ou des tissus vivants!!! Efficace au travers de spécimens épais transparents!!! Peut-être couplée à de la fluorescence!!! Imagerie en temps réel!!! Refocalisation numérique (hors-ligne)!!! Mesures nanométriques (épaisseur optique).! DHM : qu image-t-on, que mesure-t-on?" Objet de phase" Onde plane" Light propagation Front d onde déformé" To = n. D" To = épaisseur optique" n = indice de refraction" D = épaisseur physique" 15
Schéma de principe du DHM" Laser diode 658nm" Cube séparateur" 50/50" mirroir Bras de mesure" condenseur" échantillon" Longueur de bras" ajustable" mirroir Objectif" CCD camera" 1024x1024x8 bits" mirroir mirroir Hologramme hors-axe" Hologramme hors-axe (ou paralaxe) Hologramme" Front d onde de mesure" CCD" Front d onde de réféence" 16
10/12/15 Op#que pour la Biologie Analyse numérique de l hologramme" Calculs dans le domaine de Fourier" Hologram" Fourier transform" Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe Op#que pour la Biologie Analyse numérique de l hologramme" Développement/déploiement de la phase" Correction de planéité" Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe 17
10/12/15 Op#que pour la Biologie Refocalisation numérique" En ligne ou hors- ligne Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe Op#que pour la Biologie Exemple :Analyse du cycle cellulaire : morphologie 3D" Cellules FUCCI (fluorescence)" Grenoble 2015 Phase déployée φ : épaisseur optique" Séminaire Dautreppe 18
Metamorphose des plaquettes sanguines(k. Sadoul)" Monitoring morphological minute changes during platelet transformahon Plein champ: suivi d une plaqueie Epaisseur ophque de la plaqueie traquée Echelle verhcale : micromètres Exemple biophysique, mesure nanométrique" nano-marchess " (hauteurs présumées: 6 à 20 nm)" Dépot multi-couche (3 à 10) de poly-electrolyte sur une lamelle avec insert en plastic" Nano-empreinte" 19
Exemple biophysique, mesure nanométrique" Image de Phase 10 couches Surface de Phase 10 couches (marche de 20nm) Optical Coherent Tomography (OCT)! Stratégie : utiliser les photons balistiques" Approche: interférométrie" Requis et propriétéss:!!! Pas de nécessité de colorer ou marquer!!! Cellules vivantes et tissus vivants!!! Profondeur d imagerie jusqu à 500µm!!! Imagerie lente 20
La tomographie optique cohérente" L OCT est une technique de microscopie utilisant la lumière rétrodiffusée par le spécimen. Elle s effectue en lumière blanche et ne nécessite aucune coloration" Lumière rétro diffusée :" photons balistiques (trajectoire rectiligne)" photons serpentaires (trajectoire ondulée)" photons erratiques (trajectoire chaotique)" départ" arrivée" Temps de vol des photons" La tomographie optique cohérente" Détection des photons balistiques par interférométrie" Est basée sur la longueur de cohérence L c Si les différents chemins suivis par l'onde diffèrent d'une longueur supérieure à L c, il n'y aura pas d'interférences." Interféromètre de Michelson" Miroir de référence" Lame semi-" réfléchissante" Microscope OCT (Linnick)" Caméra C.C.D." 200 images/s" Source de" lumière" objet" Caméra CCD" Source de lumière" blanche" Objectif" grande O.N." PZT" Miroir de " référence" Actionneur" piézo" 21
10/12/15 Op#que pour la Biologie La tomographie optique cohérente" enveloppes" interférence s" Miroir de référence" Lame semi-" réfléchissante" objet" Z" Caméra CCD" Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe Op#que pour la Biologie La tomographie optique cohérente" OCT plein champ" Xenopus Laevis! z! x! y! Arnaud Dubois et al., ESPCI, Paris! Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe 22
La tomographie optique cohérente" OCT plein champ" Histopathologie" 450 µm" Epithelium œsophage humain (fixé)" Arnaud Dubois et al., ESPCI, Paris! Applied Optics 43, 2874 (2004)! Lumière polarisée et imagerie de bi-réfringence! APPLICATION A LA CARTOGRAPHIE! DU MYOCARDE 23
Anatomie d un cardiomyocyte Axe de contrachon 24
Anatomie d un cardiomyocyte L unité contrachle : le sarcomère Microscopie électronique en transmission Anatomie du sarcomère 25
DISPOSITIF OPTIQUE CAMERA ANALYSEUR TOURNANT LAME PLEINE ONDE REGLABLE SPECIMEN PLATINE BASCULANTE A DEUX AXES POLARISEUR TOURNANT DIFFUSEUR LUMIERE BLANCHE PREPARATION BIOLOGIQUE Inclusion en résine de Méthylmétacrylate 26
10/12/15 Op#que pour la Biologie PREPARATION BIOLOGIQUE Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe Op#que pour la Biologie DISPOSITIF OPTIQUE Grenoble 2015 Séminaire Dautreppe 27
Pilier auriculo- ventriculaire en ILP VariaHon de l intensité transmise en fonchon de la rotahon polariseur/analyseur VariaHon mesurée en un pixel en fonchon de l axe de sélechon du couple polariseur/ analyseur Huit images intensité B RotaHon (α) couple polariseur/analyseur Modèle empirique (Jouk et al 1995) I (α) = A + B * cos 2 (2.(α- Θ+π/4)) Θ : azimuth sur [0 90 ] B: dépend de l élévahon A: dépend de l homogénéité du Hssu A 28
MODELISATION DE LA CHAÎNE OPTIQUE AVEC DES MATRICES DE MULLER Polariseur = Objet = Analyseur = MODELISATION DE LA CHAÎNE OPTIQUE AVEC DES MATRICES DE MULLER M = Po. Ob. An M(1,1) intensité de la lumière polarisée transmise Après réduchon et simplificahon M(1,1) = = Posons B / 2 = (1- cos(ϕ)) / 8 alors M(1,1) = Formule empirique : I (α) = A + B * cos 2 (2.(α- Θ+π/4)) = = 29
SECTION DE CŒUR EN ILP 8 images, pour une rotahon totale de 78,25 par pas de 11,25 30
DISPOSITIF OPTIQUE Pleine onde - 45 Pleine onde 0 Pleine onde +45 Analyse en lumière polarisée de l orientahon des cellules myocardiques Cartographie (1/2 sphère) l orientahon des cardiomyocytes Texture superposée : représentahon par lignes de courant (Line Integral ConvoluHon) 31
Le futur PerspecHves Jusqu ici l usage de l ophque et des photons en biologie a été essenhellement dédié à l observahon et la quanhficahon de phénomènes biologiques Le futur qui se construit actuellement s oriente vers un usage intervenhonnel. C est- à- dire uhliser la lumière pour contrôler, modifier, orienter des mécanismes biologiques. Donner la possibilité d expérimenter in situ dans les cellules vivantes, opto- généhque et photo- achvahon. TransposiHon dans le domaine de la Santé : développer des approches thérapeuhques nouvelles, ciblage thérapeuhque contrôlé par la lumière. 32