Module de BI 121 Cours de biochimie des acides nucléiques (Enseignante : Eve de Rosny)
Plan I - Introduction = présentation rapide Les acides nucléiques Rôle de l AD et de l AR Les nucléotides II Structure chimique des acides nucléiques Les différentes bases azotées ucléosides et nucléotides omenclature Cours 1 III - Chaines d AD et d AR Structure primaire Conventions d écriture IV - Structure tridimensionnelle (structures secondaires et tertiaires) AD (la double hélice, compaction) AR (transfert, ribosomiques et messagers) V - Propriétés physico-chimiques de l AD Absorbance Stabilité (dénaturation) VI - Méthodes d étude de l AD Manipulation de l AD (plasmides et enzymes de restriction) Principales techniques d analyse (électrophorèse) Applications pour la police scientifiques Cours 2 Cours 3
Pyrimidine C C C C 3 2 4 1 5 6 Formule développée Formule semidéveloppée Formule semidéveloppée simplifiée (sans les ) 3 4 2 5 3 4 5 C 3 3 4 5 2 1 6 2 1 6 2 1 6 Cytosine (C) Thymine (T) Uracile (U) AD et AR AD AR
Purine 1 2 6 7 5 3 4 9 8 Formule semi-développée 1 2 6 7 5 8 1 6 5 7 2 3 4 9 2 2 3 4 9 Adénine (A) AD et AR Guanine (G) AD et AR
Le pentose C C C C C 1 2 3 4 5 5 4 C 2 3 2 1 5 4 C 2 3 2 D-Ribose β-d-ribose β-d-2 désoxyribose 1
Le pentose : liaison -osidique 2 C 1 2 2 6 7 5 3 4 1 9 8 1 2 2 C 2 6 7 5 3 4 9 1 8 ucléoside (adénosine)
L acide phosphorique pk a = 11,9 P pk a = 2,1 pk a = 7,2 - P + - Forme majoritaire à A p physiologique 7,4 R R 2 - P + - Fonction ester phosphorique
ucléoside mono-phosphate Fonction ester phosphorique - P - 5 C 2 Base - P + - 5 C 2 Base+ 2
ucléoside di-phosphate (liaison anhydre d acide) C 3 C 3 + - P - P - - α 5 C 2 1 1 - P β - P - α 5 C 2 1 1 + 2 Desoxythymidine 5 monophosphate Desoxythymidine 5 diphosphate
ucléoside tri-phosphate (liaison anhydre d acide) C 3 - P - + - P - β P α - 5 C 2 1 1 Désoxythymidine 5 diphosphate C 3 - P - γ P β P - - + 2 α 5 C 2 1 1 Désoxythymidine 5 triphosphate
Dinucléotide Extrémité 5 C 3 (T) - P - - P R R Fonction ester phosphorique R Fonction diester phosphorique ou Phosphodiester - P - Liaison 3-5 phosphodiester α 5 C 2 P 3 - α 1 1 5 2 C 2 3 9 1 (A) Extrémité 3
Trinucléotide Extrémité 5 - P Liaison 3-5 phosphodiester - α 5 C 2 P - 3 1 α C 3 (T) 1 2 5 C 2 P (A) 9 3 1 - α 2 9 5 C 2 3 Extrémité 3 1 (G)
Quizz I 5 4 C 2 3 2 1 Cette molécule est : A - du ribose B - du désoxyribose C du glucose IV Le carbone C6 est porté par A la base azotée B le ribose C le phosphate II III 1 2 2 6 7 5 3 4 9 8 Il s agit d une base : A - purique B - pyrimidique C azotée Un nucléoside est formé de A une base azotée B une base azotée + un ribose C une base azotée + un ribose + un phosphate D une base azotée + un ribose + deux phosphates V Redonnez à chaque liaison numérotée son nom : - P - 1 2 3 P - P - A ester phosphorique B -osidique C anhydre d acide C 2 4 C 3
Découverte de la double hélice par Watson et Crick
Liaisons hydrogènes entre les bases (paires de bases) 9 C1 (désoxyribose) 6 2 δ- 1 δ+ δ+ δ- 4 C 3 3 1 C1 (désoxyribose) δ- δ+ 6 4 δ+ δ- 9 1 3 2 C1 1 3 δ- (désoxyribose) C1 δ+ (désoxyribose)
Antiparallélisme - P - Extrémité 5 5 C 2 3 P - A T 5 C 2 3 P - Extrémité 3 2 C C G 5 C 2 3 3 5-3 P Extrémité 3 2 C 5 - P 3 T A 2 C 5 - P Extrémité 5 -
La double hélice en chiffres élice B Un tour : 10 paires de bases Angle entre deux paires de bases 3,4 nm 2 nm élice droite
Petit et grand sillon Grand sillon C1 (désoxyribose) C 3 C1 (désoxyribose) Petit sillon
Condensation de l AD dans le noyau des cellules eucaryotes Cellule eucaryote en interphase Longueur totale de l AD chromosomique : 1,8 m, taille du noyau 10 µm Cellule eucaryote en phase de mitose
Condensation de l AD dans les bactéries AD génomique (le plus souvent circulaire) Plasmide 1 à 400 kb L AD a été artificiellement épaissi pour être visible Longueur d un AD bactérien : 1,6 mm, longueur d une bactérie 2 µm
Structure des AR Coiffe en 5 5 Structure d un ribosome bactérien range : ARr Bleu : protéines de la petite sous unité Vert : protéines de grande sous unité Rouge : antibiotique lié au ribosome Structure tertiaire AR de transfert Structure secondaire ARm (eucaryote) PolyA en 3
Ribosome Synthèse des protéines AR m AR t
Quizz I Quel est le nombre de liaisons hydrogènes entre une guanine et une cytosine A - 1 B - 2 C 3 IV Quelle est la molécule représentée?: A AD B AR messager C AR ribosomique D AR de transfert II Quel atome se situe à l extrémité 5 d un AD A Carbone V B xygène C Azote D ydrogène Que montre la flèche : A le grand sillon B le petit sillon III Parmi ces types de liaisons indiquez celles qui sont dîtes «faibles». Quelles sont celles qui stabilisent la double hélice d AD? A liaison hydrogène B liaison covalente C interactions hydrophobes Les protéines qui reconnaissent l AD se fixent : A dans le grand sillon B dans le petit sillon
Spectre d absorbance de l AD
Stabilité de l AD
Suivi de la dénaturation de l AD
Dénaturation de l AD
Plasmide AD bactérien extra-chromosomique Site de restriction 1 Site de restriction 2 Site de restriction 3
Amplification d un plasmide Etape 1 (extraction des plasmide à partir de bactéries) Lyse bactérie + Purification des plasmide Etape 2 (entrée du plasmide dans une autre bactérie) + Etape 3 (amplification du plasmide = multiplication de la bactérie) Etc.
Exemple de carte de restriction Position relative des sites de restriction sur un plasmide
Digestion enzymatique d'un vecteur et d'un insert par EcoRI
Insertion de l insert dans le plasmide
Electrophorèse Séparation de l AD en fonction de la taille (unité = paires de bases ou pb) Echelle de poids moléculaire - + Lumière blanche Lumière UV Bromure d ethidium
Electrophorèse avec un plasmide surenroulement
Southern Blot Coupures par enzymes de restriction Gel d agarose Membrane de nitrocellulose + Etc.. radioactif
Polymorphisme de longueur Séquences courtes en tandem Preuve par l AD Raphaël Coquoz CTGG CTGG CTGG CTGG CTGG Chromosome 1 Chromosome 2 Chromosome 1 Chromosome 2 Chromosome 1 Chromosome 2 Individu 2 (homozygote) Individu 3 (hétérozygote) Individu 1 (hétérozygote)
Détection du polymorphisme de longueur de fragments de restriction (par Southern Blot) 1 - Digestion des AD par des enzymes de restriction 2 migration sur un gel l électrophorèse 3 Southern blot incubation avec un fragment d AD radioactif complémentaire des séquences répétées (GACCGACC)
Exemple réel d un cas de viol Qui est l agresseurs?
Méthode utilisée aujourd hui (PCR) 1 Amplification des séquences répétées 2 migration sur un gel d électrophorèse 3 coloration du gel par du bromure d éthidium. e vont être visibles que les fragments amplifiés.
Le suspect est-il coupable? Exemple réel
Exemples de marqueurs utilisés par le FBI
Quizz I L AD et l AR absorbent fortement la lumières à : A 280 nm? B 260 nm? C 400 nm? IV L électrophorèse sépare l AD en fonction A de la charge B de la taille C de la séquence II Quelle séquence a la température de dénaturation (Tm) la plus élevée? A CACGATGA GTGCTACT V Est-il le père? B TGACTAGC ACTGATCG III Parmi ces séquences laquelle est susceptible d être reconnues par une enzymes de restriction? A TCGATT AGCTAA B AAGCTT TTCGAA