Formation des métastases

01/04/2014 ADNOT Guillaume L2 BMCP Pr. Ouafik Relecteur 4 13 pages A. Rappels a. Tumorigénèse/progression Formation des métastases Plan: A. Rappels B. Principales étapes de la progression métastatique I. Dissémination tumorale II. Premières étapes de la cascade métastatique C. Hétérogénéité génétique des micro-métastases et leurs évolutions D. Transition Epithéliale Mésenchyme (EMT) : Modifications cellulaires I. Modifications cellulaires et moléculaires associées à l'emt II. Etapes de la progression métastatique : transformation EMT/MET Phase de croissance tumorale exponentielle Néoangiogénèse Masse tumorale à croissance in situ invasive métastases Interaction cellules tumorales microenvironnement Environnement permissif partenaire actif b. Changement dans les propriétés adhésives des cellules transformées L'interaction normale entre des cellules et la membrane basale (MB) se fait par l'intermédiaire de E- cadhérine (interaction homotypique épithélial-épithélial) et par des couples d'intégrines (principalement α5β1, α3β1). Lors de la transformation en cellule cancéreuse, le phénotype de la cellule change ainsi que son génotype. Cela entraine la disparition de l'expression de la E-cadhérine et son remplacement par la N-cadhérine permettant à la cellule de développer des interactions hétérotypiques avec des cellules mésenchymateuses du stroma. Il y a apparition de métalloprotéases à la MP permettant la dégradation de la MB ainsi qu'un changement de la population d'intégrines ( αvβ3, α6β4). 1/14

c. Tumorigenèse : Interactions tumeur-stroma Suite à la phase de prolifération, on a une angiogénèse stable et fonctionnelle nécessaire pour la croissance tumorale. Après cette angiogénèse, les cellules cassent la MB et entre en contact avec le stroma tumoral qui devient aussi actif que la cellule tumorale elle-même. Les différentes cellules du stroma vont tisser un lien avec les cellules cancéreuses et permettre leur migration. Le pouvoir métastatique représente la capacité des cellules cancéreuses à quitter la tumeur primitive. B. Principales étapes de la progression métastatique La cellule tumorale, en passant d'un phénotype épithélial à un phénotype mésenchymateux, peut se déplacer et d'atteindre la vascularisation. Une fois la circulation atteinte, on a un phénomène d'intravasation : la cellule tumorale pénètre le vaisseau puis voyage jusqu'au site secondaire. Il y a alors contact avec la paroi interne des cellules endothéliales et sortie du vaisseau (phénomène d'extravasation) après rupture de la membrane basale endothéliale. Le site secondaire est très souvent sur un organe avec une forte vascularisation de microcapillaires (poumon, cerveau, foie, rein, moelle osseuse). Le faible diamètre freine la circulation des cellules tumorales qui peuvent passer l'endothélium plus facilement. La cellule prolifère si elle trouve un environnement capable de tisser des liens avec elle ou s'endort en attendant l'instant propice (phénomène de métastases dormantes). 2/14

I. Dissémination tumorale Recherche par imagerie : PET-SCAN : injection de D-glucose-F 18 pour marquer l'activité métabolique cellulaire très active. IRM pour identifier une tumeur cérébrale (impossibilité de distinguer l'activité normale ou tumorale dans le cerveau avec le FDG, elle y est toujours importante) Sur le plan cellulaire : Présence de cellules d'ilots de pancréas au niveau du vaisseau lymphatique : Présence de cellules cancéreuses au niveau de la moelle osseuse : Coloration au Giemsa 3/14

a. Cascade invasion-métastase BMCP Formation des métastases Les tumeurs primitives et secondaires ont le même phénotype. Exemple de modèle d'invasion : Ce qu l'on voit en noir, ce sont des trous dégradés par la cellule cancéreuse. En rouge c'est le marquage à la E-cadhérine. Forte expression des intégrines (vert) dans les cellules sur le front de migration pour les interactions avec la matrice extracellulaire. Les cellules sur le front de migration change souvent d'expression car elle a besoin de nouvelles intéractions avec les cellules qu'elle rencontre. Synthèse de collagène et de fibronectine qui vont guider le front. b. Passage des cellules sanguines à travers les capillaires Déformation des globules rouges dans la lumière des microcapillaires Non-déformation des cellules tumorales qui se bloquent dans les intersections Intéractions physiques avec l'endothélium +++ 4/14

Exemple : modèle murin de cellules de fibrosarcome rendues fluorescentes et bloquées dans un virage L'intensité de la fluorescence montre que la cellule est en train de proliférer suite à son contact forcé avec l'endothélium. II. Premières étapes de la cascade métastatique - Transit: interactions avec les plaquettes - Arrêt et adhésion: interactions avec les neutrophiles, les monocytes et les macrophages (de 0min à 24h) - Extravasation (de 24h à 3j): premier contact avec le microenvironnement - Survie et croissance (entre 3j et quelques semaines) soit la cellules entre en dormance (3 à 5ans) - Métastases (au bout de quelques semaines à plusieurs années) a. Interactions entre la cellule tumorale et les cellules hôtes pendant les premières étapes du cascade métastatique 5/14

Important: les plaquettes sont indispensables au transport des cellules cancéreuses dans le sang (protection contre l'environnement vasculaire) Lors de la phase d'arrêt, il y a interaction avec les neutrophiles. Les plaquettes et les neutrophiles vont commencer à sécréter beaucoup de PDGF, de TGFβ pour empêcher les cellules NK d'activer le système immunitaire. Le contact entre la cellule tumorale et les neutrophiles permet l'interaction avec les macrophages et les monocytes favorisant la synthèse de nombreuses molécules qui vont activer l'endothélium (même mécanisme que pour l'angiogenèse). Ouverture de la paroi endothéliale et glissement de la cellule tumorale dans le stroma environnent. b. Les étapes de l'extravasation Interaction des plaquettes avec la cellule tumorale formation d'un trombus => Adhésion et interaction avec la MB +++ Dès qu'il y a un dialogue avec la paroi, le système enzymatique va dégrader les plaquettes permettant une microprolifération des cellules qui vont pouvoir sortir du vaisseau. C. Hétérogénéité génétique des micro-métastases et leurs évolutions Différents oncogènes peuvent être touchés dans la masse tumorale primitive, on trouve donc de nombreux clones avec des mutations différentes : hétérogénéité clonale génétique Lors du processus métastatique, de nombreux clones différents quittent la tumeur : notion de voyage de sélection (seules les cellules les plus robustes parviennent à coloniser une nouvelle niche et à proliférer) 6/14

Pour qu'il y ait une métastase il faudrait que la tumeur primitive libère un million de cellules dans la circulation sanguine. A partir d'un site secondaire il peut y avoir d'autres métastases, c'est ce qui explique la gravité de la situation. Exemple Cancer poumon : TKib = inhibiteur du récepteur à l'egf - Recherche par biopsie de mutations activatrices sur les exons 18/19/21 du gène du récepteur (18 L858R) - Prescription de TKib: - IRESSA R (Gefitinib) ressemble à l'atp et inhibe l'accès enzymatique au récepteur à l'egf - TARCEVA R (Erlotinib) Ce sont des inhibiteurs réversibles. Si il y a trop d'atp, celui-ci peut déplacer le médicament. - Afatinib : inhibiteur irréversible - Recherche lors d'une rechute de nouvelles mutations sur l'exon 20 (T790M) minoritaires initialement mutation de résistance au Tkib (plus de reconnaissance avec le récepteur) - Hypothèses : ouverture de la voie des clones mutés sur l'exon 20 par élimination des autres clones tumoraux la pression médicamenteuse sur la tumeur a pu provoquer l'apparition de cette mutation 50-60% des patients présentais déjà la mutation : la première hypothèse semble juste - IPASS : première étude portant sur l'inhibiteur IRESSA phase 2 et 3 : 450 patients (10% qui ont bien répondu) Seuls 10% des patients présentent des mutation des exons 18/19/21 du gène du récepteur à l'egf (=ceux qui ont bien répondu). L'IRESSA n'est prescrivable qu'à condition que le patient porte ces mutations. Les cellules tumorales dormantes : 7/14

On a l'impression que ces cellules cancéreuses sont morte mais quand on les met en culture elles se développent. C'est un phénomène métastatique en dormance : la cellule cancéreuse n'a pas trouvé des conditions propices pour proliférer donc elle entre en dormance soit définivement soit elle se développera lors d'un changement de l'environnement. D. Transition Epithéliale Mésenchyme (EMT) : Modifications cellulaires La cellule tumorale ne peut pas voyager avec expression de E-cadhérine. Celle-ci impose l'interaction avec ses co-partenaires. Le système E-cadhérine, α et β caténine interagit avec les protéines du cytosquelette d'actine pour maintenir la forme et la polarité de la cellule. Il y a disparition de l'expression de la E-cadhérine par mutation, méthylation du promoteur ou délétion du gène. La β-caténine devient libre et part, soit vers la dégradation dans le protéasome, soit dans le noyau pour s'associer à des facteurs de transcription (Tcf, LEF Tfs) entrainant l'activation de nombreux gènes cibles. Cette activation permet le passage à un phénotype mésenchymateux. EMT et le front d'invasion tumoral: 8/14

Marquage de la β-caténine en rouge, plus important sur le front de migration. La couleur du noyau des cellules du front de migration est beaucoup plus foncé que les cellules du centre de la tumeur. Les cellules du front ont un phénotype différent de celui des cellules du centre de la tumeur pour pouvoir migrer et voyager. β -caténine et voie de signalisation Wnt associée à EMT et cancer de la prostate : Mécanismes moléculaires fondamentaux intervenant dans le processus métastatique : Contrôle de l'expression de E-cadhérine : - Répression de la transcription par Snail, Slug, SIP1,Twist, def1, E12/E47 - Mutation de la β-caténine : rupture du lien avec la E-cadhérine ce qui la fragilise dans son intéraction avec la cellule voisine - Clivage protéolytique du domaine extracellulaire par les MMPs - Perturbation du cytosquelette qui fragilise la E-cadhérine - Augmentation de la dégradation cellulaire - Perte de la E-cadhérine peut être remplacée par la N-cadhérine - cadherin switch, associé au phénotype observé in vitro : EMT 9/14

I. Modifications cellulaires et moléculaires associées à la transition épithéliale-mésenchymateuse Perte : expression de la cytokératine protéine des jonctions adherens épithéliales (E-cadhérine) polarité cellulaire Acquisition : phénotype fibroblastique (forme de fibroblaste) mobilité programme invasif programme d'expression des gènes mésenchymateux protéines des jonctions adherens mésenchymateuses (N-cadhérine) sécrétion de protéases (MMP-2, MMP-9) expression de la vimentine sécrétion de fibronectine expression du récepteur au PDGF expression d'intégrines αvβ6 Transformations phénotypiques EMT entrainent des pertes et des gains de fonction. a. EMT et expression de marqueurs Expérience : Culture de cellules cancéreuses avec noyau en bleu. Marquage fluorescent des marqueurs épithéliaux (E-cadhérine, β et γ-caténines) et mésenchymateux (fibronectine et vimentine) après transfection d'un vecteur contrôle ou du facteur de transcription Twist. La surexpression du facteur de transcription Twist fait disparaitre l'expression des marqueurs épithéliaux (perte de marquage avec twist). Twist permet également aux cellules d'exprimer la fibronectine et la vimentine (marqueurs mésenchymateux) les préparant au changement de phénotype. Twist fait donc bouger tout un système en concordance entre 10/14

inhibition de l'expression de la E-cadhérine et en même temps expression de la fibronectine et de la vimentine. Western-blot: L'expression des marqueurs épithéliaux diminue fortement en présence de Twist alors que les marqueurs mésenchymateux sont surexprimés en sa présence. II. Etapes de la progression métastatique : transformation EMT/MET La cellule épithéliale doit absolument changer de phénotype pour pouvoir se déplacer et quitter la tumeur primitive. Les cellules cancéreuses mésenchymateuses vont entrer dans la circulation (intravasation) puis resortir près du site secondaire (extravasation). Elles doivent ensuite retrouver leur phénotype épithélial pour pouvoir nicher et se développer: transition mésenchyme-épithélial On développe des molécules pouvant être capables de bloquer ce retour au phénotype épithélial pour empêcher le processus métastatique. Réversibilité du système EMT : 11/14

Tumeur primaire et métastases dérivées : Marquage du récepteur à l'oestrogène et de HER2 sur une tumeur primitive et une métastase au cerveau d'un cancer du sein. On remarque une même expression des marquages membranaires sur la tumeur primaire et sur ses métastases. a. Manifestation de EMT à l'interface tumeur/stroma On retrouve l'expression de l'intégrine αvβ6 spécifiquement à l'interface tumeur/stroma, de même que tous les molécules présentes sur un phénotype mésenchymateux. C'est le front d'invasion et son phénotype qui permettent l'interaction de la tumeur avec le stroma ainsi que le processus métastatique. 12/14

Le prof est passé assez vite sur toutes les autres diapos du cours. J'ai mis quelques notes sur celles qu'il a un peu détaillées. Protéase: dégradation spécifique de la matrice extracellulaire Mécanismes d'activation des pro-protéases en protéases actives : La cellule stromale sécrète des pro-activateurs du plasmogène qui vont se fixer sur leurs récepteurs. Le complexe formé s'active et dégrade le plasminogène en plasmine, qui va elle-même dégrader les précurseurs des métalloprotéases en protéases actives. dégradation de la matrice La plasmine active également la protéine TGF β qui contrôle l'emt et qui est surexprimée dans le stroma. 13/14

Contrôle de l'emt par le TGF β: Après une semaine d'exposition au TGF β, les cellules ont presque perdu l'expression de la E-cadhérine au profit de l'expression de la vimentine. C'est la sécrétion de TGF β par les cellules stromales qui va initier la transformation phénotypique des cellules épithéliales. Système lymphatique au niveau de la glande mammaire : Possibilité importante d'intravasation dans les systèmes sanguins et lymphatiques. On recherche la présence de métastases dans les ganglions du système lymphatique et on peut prélever le ganglion sentinelle (premier ganglion de la chaine) pour l'analyser. 14/14