DIRECTION ENVIRONNEMENT

DIRECTION ENVIRONNEMENT DÉTERMINATION DE L EFFICACITÉ BACTÉRIOSTATIQUE ET BACTÉRICIDE D UN REVÊTEMENT DE SOL Dossier CRIQ n o 640-PE35964 Rapport technique Madame Louise Larivière FORBO LINOLEUM INC. 8300, rue Pascal-Gagnon Saint-Léonard (Québec) H1P 1Y4 GUY GENEST, ING. CONSEILLER EN DÉVELOPPEMENT TECHNOLOGIQUE MICHEL COMEAU, TECHNICIEN R-D RESPONSABLE TECHNIQUE DIRECTION ENVIRONNEMENT MARIE-JOSÉE HARDY, MICROBIOLOGISTE DIRECTRICE ADJOINTE DIRECTION ENVIRONNEMENT QUÉBEC, LE 15 MARS 2006

FORBO LINOLEUM INC. ii TABLE DES MATIÈRES PAGE 1. INTRODUCTION... 1 2. OBJECTIF DU PROJET... 1 3. DESCRIPTION DES TRAVAUX... 1 3.1 PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS... 2 3.2 ÉVALUATION QUALITATIVE DE L EFFICACITÉ BACTÉRICIDE OU BACTÉRIOSTATIQUE SELON TNO SEEDLAYER METHOD... 2 3.3 ÉVALUATION QUANTITATIVE DE L EFFICACITÉ BACTÉRICIDE SELON AATCC 100... 3 3.4 UNE ÉVALUATION DU TEMPS DE CONTACT NÉCESSAIRE DU REVÊTEMENT MARMOLEUM AVEC LA BACTÉRIE POUR LA DÉTERMINATION DE L ACTIVITÉ BACTÉRICIDE OU BACTÉRIOSTATIQUE (MÉTHODE IN VIVO SIMULATIONS)... 4 4. RÉSULTATS OBTENUS... 4 4.1 RÉSULTAT DE L ÉVALUATION QUALITATIVE DE L EFFICACITÉ MESURÉE SELON TNO SEEDLAYER METHOD... 4 4.2 RÉSULTAT DE L ÉVALUATION QUANTITATIVE DE L EFFICACITÉ BACTÉRICIDE SELON AATCC 100... 5 4.3 RÉSULATS DE L ÉVALUATION DU TEMPS DE CONTACT (MÉTHODE IN VIVO SIMULATIONS)... 6 5. CONCLUSION... 7

FORBO LINOLEUM INC. iii LISTE DES TABLEAUX PAGE TABLEAU I : CROISSANCE OBSERVÉE APRÈS 72 HEURES D'INCUBATION (TNO SEEDLAYED METHOD)... 5 TABLEAU II : EFFICACITÉ BACTÉRICIDE... 6 TABLEAU III : CROISSANCE OBSERVÉE EN FONCTION DU TEMPS DE CONTACT... 7

FORBO LINOLEUM INC. 1 1. INTRODUCTION FORBO LINOLEUM INC. fabrique et distribue un revêtement de sol à base d huile de lin commercialisé sous le nom de Marmoleum. Ce revêtement a déjà été testé dans le passé pour en démontrer l efficacité bactéricide et bactériostatique sur différents microorganismes. 2. OBJECTIF DU PROJET L objectif de ce projet consistait à déterminer l efficacité bactéricide et bactériostatique du revêtement Marmoleum sur la bactérie Clostridium difficile selon trois méthodes d essais différentes auxquelles le revêtement Marmoleum avait déjà été soumis soit : une évaluation qualitative de l efficacité bactéricide ou bactériostatique (TNO seedlayed method); une évaluation quantitative de l efficacité bactéricide selon la norme AATCC 100; une évaluation du temps de contact nécessaire du revêtement Marmoleum avec la bactérie pour la détermination de l activité bactéricide ou bactériostatique (méthode in vivo simulations). 3. DESCRIPTION DES TRAVAUX Un échantillon de revêtement Marmoleum a été livré au CRIQ le 2 février 2006. Les essais se sont déroulés entre le 20 février et le 10 mars 2006. Chacun des essais a été réalisé sur un échantillon de revêtement tel qu il a été reçu ainsi que sur un échantillon ayant été soumis à une lixiviation d une heure dans de l eau du robinet et séché ensuite à l air ambiant. Dans tous les cas, les essais ont été réalisés dans du bouillon ou sur une gélose contenant le milieu de culture Reinforced Clostridium Medium et la souche utilisée fut Clostridium difficile ATCC 9689.

FORBO LINOLEUM INC. 2 3.1 PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS Avant de procéder à chacun des essais, les échantillons ont d abord été découpés selon la forme et la dimension requises. Ils ont ensuite été désinfectés avec une solution d alcool éthylique à 70 %. La moitié des échantillons ont, par la suite, été soumis à une lixiviation d une heure dans de l eau du robinet. Pour ce faire, ils ont été placés dans un contenant peu profond et une quantité d eau suffisante pour les recouvrir y a été ajoutée. Les contenants ont été placés sur une plaque agitante ajustée à une vitesse suffisamment élevée pour permettre un faible déplacement de l eau à la surface des pièces de revêtement. Après une heure, ils ont été retirés de la solution, égouttés et mis à sécher sur une grille en acier inoxydable pendant une heure à la température de la pièce. 3.2 ÉVALUATION QUALITATIVE DE L EFFICACITÉ BACTÉRICIDE OU BACTÉRIOSTATIQUE SELON TNO SEEDLAYER METHOD Le principe de cette évaluation consiste à mettre en contact une suspension de bactéries en concentration connue dans une gélose liquéfiée et de transférer une petite quantité de cette suspension à la surface du revêtement. Pendant la période d incubation, les échantillons sont inspectés périodiquement pour déterminer s il y a eu développement ou non de la bactérie. Une culture de Clostridium difficile a été réalisée en inoculant 10 ml de bouillon Reinforced Clostridium Medium et en l incubant en condition anaérobie à 35 C pendant 48 heures. Cette culture a ensuite été diluée dans une gélose liquéfiée contenant le même milieu de culture pour obtenir une concentration finale d environ 10 5 UFC (unités formatrices de colonies) par millilitre. Deux rondelles de téflon d un diamètre de 1 cm et d une épaisseur de 0,5 cm ont ensuite été placées sur un échantillon de revêtement de 5 cm sur 5 cm et chacune a été remplie avec 0,5 ml de gélose inoculée. Après solidification de la gélose, les échantillons ont été déposés dans des plats de pétri de 100 x 15 mm et incubés pendant 4 jours à 35 C en condition anaérobie. Un échantillon témoin a également été préparé en transférant la même quantité de gélose inoculée dans une rondelle placée au fond d un plat de pétri stérile et incubé dans les mêmes conditions, de même qu un contrôle de stérilité de la gélose avant son inoculation.

FORBO LINOLEUM INC. 3 Un dénombrement a, de plus, été réalisé sur la gélose fraîchement inoculée en effectuant des dilutions successives de celle-ci et en filtrant un volume connu de la dilution sur une membrane filtrante quadrillée hydrophobe. La membrane a ensuite été déposée à la surface d une gélose Reinforced Clostridium Medium et incubée pendant 72 heures à 35 C en condition anaérobie. À la fin de la période d incubation, le dénombrement a été effectué. L activité bactériostatique a été évaluée quotidiennement en examinant la présence ou l absence de croissance sur les échantillons. L absence de croissance confirme l activité bactériostatique ou bactéricide et à l inverse, la croissance démontre que cette activité n est pas enregistrée. 3.3 ÉVALUATION QUANTITATIVE DE L EFFICACITÉ BACTÉRICIDE SELON AATCC 100 L American Association of Textile Chemist and Colorists offre une méthode d évaluation quantitative de l activité bactéricide d une surface sur laquelle une quantité connue de bactéries est présente. Cette technique a été développée pour tester des tissus mais est totalement applicable à un revêtement de sol. Une suspension de Clostridium difficile à une concentration d environ 10 5 UFC par 0,1 ml a été préparée dans du bouillon Reinforced Clostridium Medium. Des échantillons de revêtement d un diamètre de 48 mm ont été découpés et placés individuellement au fond de bouteilles en plastique de 500 ml stériles. Les échantillons ont été inoculés avec 0,1 ml de la suspension et un dénombrement a été réalisé sur la moitié d entre eux en ajoutant 100 ml d une solution neutralisante contenant 0,1 % de peptone et 0,1 % de polysorbate 80 et en filtrant 1 ml de cette solution sur une membrane filtrante tel que décrit dans l essai précédent. Des échantillons témoins ayant été mouillés avec 0,1 ml d eau stérile ont également été préparés. L autre moitié des échantillons a été placée à l incubateur à 35 C, après avoir fermé hermétiquement les contenants, pendant 24 heures. Une bouteille ne contenant que 0,1 ml d inoculum sans échantillon a également été insérée pour valider la viabilité de l inoculum. Après à la période d incubation, un nouveau dénombrement a été effectué en ajoutant 100 ml solution neutralisante dans chacun des contenants et en filtrant 1 ml de la solution résultante.

FORBO LINOLEUM INC. 4 3.4 UNE ÉVALUATION DU TEMPS DE CONTACT NÉCESSAIRE DU REVÊTEMENT MARMOLEUM AVEC LA BACTÉRIE POUR LA DÉTERMINATION DE L ACTIVITÉ BACTÉRICIDE OU BACTÉRIOSTATIQUE (MÉTHODE IN VIVO SIMULATIONS) Cette évaluation consiste à déterminer le temps de contact requis entre une pièce de Marmoleum et la bactérie soit pour en empêcher la croissance et la multiplication, soit pour l éliminer. Une suspension de Clostridium difficile à une concentration d environ 10 5 UFC par 0,1 ml a été préparée dans du bouillon Reinforced Clostridium Medium. Un volume de 0,1 ml de cette suspension a été étalée à l aide d une tige de verre recourbée sur la surface de chaque gélose contenue dans un plat de pétri de 100 x 15 mm et mis à sécher 15 minutes sous une hotte à flux laminaire. Les échantillons de revêtement de 1 cm sur 1 cm ont été déposés sur une gélose face aux bactéries et mis à incuber à 35 C en condition anaérobie. Des pièces d échantillons ont été retirées après 1, 2, 4, 6 et 24 heures. Après chaque retrait, les géloses maintenant dépourvues de l échantillon de revêtement ont été replacées dans l incubateur dans les mêmes conditions et examinées à toutes les 24 heures jusqu à concurrence de 72 heures. La croissance inhibée totalement à la fin des 72 heures indique un effet bactéricide ou bactériostatique alors qu une inhibition partielle de la croissance au cours des 48 premières heures suivie d une croissance après 72 heures démontre plutôt une activité bactériostatique. La méthode est validée par la croissance des bactéries à la surface d une gélose inoculée qui n a pas été mise en contact avec les échantillons de même que par l insertion d une gélose non inoculée sur laquelle aucune croissance ne doit être observée. 4. RÉSULTATS OBTENUS 4.1 RÉSULTAT DE L ÉVALUATION QUALITATIVE DE L EFFICACITÉ MESURÉE SELON TNO SEEDLAYER METHOD Le dénombrement réalisé sur l inoculum utilisé pour la réalisation de cet essai a été de 1,2 x 10 5 UFC/ml. Le tableau I présente les résultats obtenus après 72 heures d incubation. Le symbole + indique qu il y a eu croissance tandis que le symbole représente l absence de croissance de la bactérie Clostridium difficile.

FORBO LINOLEUM INC. 5 TABLEAU I : CROISSANCE OBSERVÉE APRÈS 72 HEURES D'INCUBATION (TNO SEEDLAYED METHOD) ÉCHANTILLON CROISSANCE OBSERVÉE Marmoleum tel quel - Marmoleum trempé une heure - Témoin positif (gélose inoculée) + Contrôle de stérilité - Le résultat obtenu démontre que le revêtement Marmoleum possède une activité bactériostatique certaine et potentiellement bactéricide envers Clostridium difficile. 4.2 RÉSULTAT DE L ÉVALUATION QUANTITATIVE DE L EFFICACITÉ BACTÉRICIDE SELON AATCC 100 L inoculum utilisé lors de cette évaluation contenait 1,3 x 10 5 UFC/0,1 ml. Le tableau II présente les résultats obtenus lors des dénombrements réalisés tout de suite après l inoculation ainsi qu après 24 heures de contact entre la bactérie et le revêtement à 35 C. L efficacité est calculée de la façon suivante : R = 100 (B - A)/B où R = % de réduction après 24 heures de contact A = dénombrement de l échantillon inoculé après 24 heures de contact B = dénombrement de l échantillon inoculé après inoculation

FORBO LINOLEUM INC. 6 TABLEAU II : EFFICACITÉ BACTÉRICIDE ÉCHANTILLON Marmoleum tel quel (inoculé) Marmoleum tel quel (non inoculé) Marmoleum trempé une heure (inoculé) Marmoleum trempé une heure(non inoculé) DÉNOMBREMENT (UFC/SURFACE) LORS DE L INOCULATION APRÈS 24 HEURES DE CONTACT % EFFICACITÉ 1,2 x 10 5 < 100 > 99,9 < 100 < 100 --- 1,2 x 10 5 < 100 > 99,9 < 100 < 100 --- Inoculum 1,3 x 10 5 > 10 8 --- L augmentation du nombre de bactéries dans l inoculum après 24 heures d incubation démontre sa viabilité dans le temps. De plus, le fait que le dénombrement des échantillons non inoculés soit inférieur à 100 démontre qu ils n ont pas été contaminés lors des manipulations. 4.3 RÉSULATS DE L ÉVALUATION DU TEMPS DE CONTACT (MÉTHODE IN VIVO SIMULATIONS) Le tableau qui suit présente les résultats obtenus après 72 heures d incubation à la suite des différents temps de contact entre l échantillon et l inoculum. Le symbole + indique qu il y a eu croissance tandis que le symbole représente l absence de croissance de la bactérie Clostridium difficile. L inoculum utilisé pour cet essai contenait 5 x 10 5 cellules vivantes de Clostridium difficile au début de l essai.

FORBO LINOLEUM INC. 7 TABLEAU III : CROISSANCE OBSERVÉE EN FONCTION DU TEMPS DE CONTACT ÉCHANTILLON Marmoleum tel quel Marmoleum trempé une heure Témoin positif (gélose inoculée) Contrôle de stérilité CROISSANCE OBSERVÉE T = 1 HEURE T = 2 HEURES T = 4 HEURES T = 6 HEURES T = 24 HEURES - - - - - - - - - - + - Puisque aucune croissance n a été enregistrée après réincubation des échantillons une fois le revêtement enlevé, le Marmoleum semble ainsi être bactéricide envers Clostridium difficile. 5. CONCLUSION Le revêtement de sol Marmoleum possède des propriétés bactériostatique et bactéricide envers la souche de Clostridium difficile ATCC 9689. De plus, le fait de faire tremper l échantillon dans de l eau pendant une heure ne semble pas modifier ses propriétés antibactériennes. On peut ainsi conclure que : Le Marmoleum démontre son efficacité bactériostatique envers Clostridium difficile lorsque testé selon le TNO Seedlayer Method; Le Marmoleum possède une activité bactéricide supérieure à 99,9 % sur Clostridium difficile lorsque testé selon la méthode AATCC 100; Après une heure de contact avec la bactérie Clostridium difficile, le Marmoleum démontre son efficacité bactéricide lorsque testé selon la méthode in vivo simulations.