Biopuces à tous les niveaux moléculaires Chromatine ADN Puces SNP Puces CNV ChIP-chip transcription ARN AAAAA traduction Puces à ADN Puces à exons Puces de couverture (Tiling-array) Protéine Puces à anticorps Puces à protéines Puces à tissus
Biopuces Différents types Sondes Cible Publication Transcriptome ADN ARN Schena et al. Science (1995) 270: 467-470470 Tissue-array Tissus Anticorps Kononen J. (1998) Nat. Med. 4: 844-847847 Fonction Protéines Ligands Zhu et al. Nature Genet (2000) 26: 283-289289 Protéome Anticorps Protéines De Wildt et al. Nature Biotech. (2000) 18: 989-994994 Fonction Cellules & Plasmides Ligands Ziauddin & Sabatini Nature (2001) 411: 107-110110 Interactome Protéines Protéines Zhu et al. Science (2001) 293: 2101-21052105
Puce à ADN Principe Matrice de sondes Echantillon marqué hybridation Mesure
Puces à ADN Applications Sondes Cible Publication Criblage de banques Transcriptome Oligo fingerprinting Reséquençage Phénotypage SNP CGH DNA-BP Suivi de réplication Détection de gènes ChIP-chip Validation de gènes ADN ADN ADN Oligo ADN Oligo ADN ADN ADN ADN ADN ADN ADN Gress TM et al. (1992) Mam. Genome 3: 609-619619 ARN Schena et al. (1995) Science 270: 467-470470 Oligos Drmanac S. et al. (1996) Genomics 37: 29-40 ADN Kozal MJ et al. (1996) Nat. Med. 2: 753-759759 ADN Gingeras et al. (1998) Genome Res. 8: 435-448448 ADN Winzeler et al. (1998) Science 281: 1194-11971197 ADN Pollack JR. (1999) Nature 23: 41-4646 Protéines Bulyk et al. (1999) Nature Biotech. 17: 573-577577 ADN Khodursky et al. (2000) PNAS 97: 9419 94249424 ARN Penn et al. (2000) Nature Genet. 26: 315-318318 ADN Iyer et al. (2001) Nature 409: 533-538538 ARN Shoemaker et al. (2001) Nature 409: 922-927927 Taille des ARN ADN ARN Hurowitz et al. (2003) GenBiol 5: R2
Génotypage CNV: Copy-Number Variation
Del(7q)
Bacille Calmette-Guérin Behr et al. (1999) Science 284: 1520-15231523 A partir d une souche sauvage, et après 230 passages en culture (entre 1908 et 1921) isolement d une souche à virulence réduite mais ayant gardé son immunogénicité). A cause de l impossibilité de congeler les souches, les différents lots mondiaux en 1960 avaient plus de 1.000 passages de différences. Mycobacterium bovis Caractérisation de souches Phénotypage
Puce de phénotypage Une souche de virus de la grippe caractérisé par ses variants d Hémagglutinine et de Neuraminidase: HxNy
Puce SNP SNP: Single Nucleotide Polymorphism Un SNP est un point de polymorphisme du génome, donc une mutation. Pour un SNP donné, on synthétise 2 oligonucléotides ayant la séquence connue et les 2 bases possibles en position centrale. GCGAATCGAGATAA G ATGGACCCGTGCTAA ATCGAGATAAATGGACCCGATGGACCCG ATCGAGATAGATGGACCCGATGGACCCG On hybride la puce constituée de ces oligonucléotides avec l ADN d un individu. ATCGAGATAAATGGACCCGATGGACCCG ATCGAGATAGATGGACCCGATGGACCCG Individu Homozygote G Individu Homozygote A Individu Hétérozygote A et G Génétique à haute résolution
Diagnostic génétique
Puce de reséquençage Pour toutes les positions à reséquencer, on synthétise 4 oligonucléotides ayant la séquence connue et les 4 bases possibles en position centrale. GCGAATCGAGATAGATGGACCCGTGCTAA ATCGAGATAAATGGACCCGATGGACCCG ATCGAGATATATGGACCCGATGGACCCG ATCGAGATACATGGACCCGATGGACCCG ATCGAGATAGATGGACCCGATGGACCCG TCGAGATAGATGGACCCGTTGGACCCGT TCGAGATAGTTGGACCCGTTGGACCCGT TCGAGATAGCTGGACCCGTTGGACCCGT TCGAGATAGGTGGACCCGTTGGACCCGT CGAGATAGAAGGACCCGTGGGACCCGTG CGAGATAGATGGACCCGTGGGACCCGTG CGAGATAGACGGACCCGTGGGACCCGTG CGAGATAGAGGGACCCGTGGGACCCGTG A T C G On hybride la puce constituée de ces oligonucléotides avec l ADN d un individu. GCGAATCGAGATAAATGGACCCGTGCTAA On lit directement la séquence
Amplichip CYP450 Reséquençage pour adapter le traitement Pharmacogénomique Vendre le traitement et le diagnostic qui justifie le traitement. Médecine personnalisée
Puce à ADN Transcriptome Matrice de sondes ARN marqués hybridation Transcriptome
Puces à ADN propriété mesurée Espèce hybridée marn marn marqués in situ (pulse) marn marqués in situ (pulse- chase) marn mrna liés aux polysomes mrna liés aux membranes mrna liés aux polysomes mitochondriaux Propriété mesurée Transcriptome Taux de transcription Taux de dégradation Référence Schena et al. (1995) Science 270: 467-470 Taux de dégradation Wang et al. 2002 PNAS 99: 5860-58655865 Taux de traduction Localisation subcellulaire Localisation subcellulaire Johannes et al. 1999 PNAS 96: 13118-13123 Diehn et al. 2000 Nature Genetics 25: 58-62 Marc et al. 2002 EMBO reports 31 (21)
Localisation membranaire Diehn et al. (2000) Nat. Genet. 25: 58-62
Lymphomes B à petites cellules Thieblemont et al. (2004) Blood 103: 2727-27372737 Profil d expression Signatures diagnostiques SLL MZL SLL MCL MCL MZL SLL MCL MZL L-selectin AKT1 GST
Cancer du sein Signatures prognostiques
Cancer of Unknown Primary 95% de prédiction Signatures diagnostiques mais surtout choix du traitement le plus adapté
Diagnostic - Pronostique Problème des pays émergents!!!
ChIP-chip Iyer et al. (2001) Nature 409: 533-538538 Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) et hybridation sur puce à ADN (chip) Identifier tous les sites de fixation d un facteur de transcription sur la chromatine Comprendre les mécanismes de régulation
Qualité de l eau
Groupes sanguins 99,8% de spécificité contre 97% aux techniques classiques Coût réduit
Les concurrents Spectrométrie de masse 10 puces SNP 6.0 Très faible coût Avantageux pour de nombreux échantillons
Les concurrents Séquençage Pas besoin de connaître le génome, ni même l organisme Métagénomique Prix Gènes faiblement exprimés séquence absente en CNV
Séquençage / reséquençage CIMNA: immunomonitorage idem avec puces? Pays émergents