AGREGATION DE BIOCHIMIE GENIE BIOLOGIQUE CONCOURS EXTERNE Session 2004 TRAVAUX PRATIQUES DE BIOCHIMIE PHYSIOLOGIE LAIT ET INTOLERANCE AU LACTOSE L'intolérance au lactose se caractérise par l'incapacité de digérer des quantités significatives de lactose. Cette incapacité résulte d'un déficit en lactase (b galactosidase : EC 3.2.1.23), normalement produite par l intestin grêle. A la naissance le taux de lactase intestinale est élevé puis diminue avec l âge et atteint un niveau très bas vers l'âge de cinq ans. Ainsi près de 70 % de la population mondiale adulte est déficiente en lactase. Chez ces individus la consommation de lait ou de produits lactosés provoque des symptômes gênants mais sans gravité : nausée, diarrhée... La consommation de lait par les personnes intolérantes au lactose nécessite par exemple son hydrolyse. Ce sujet propose, après étude de la localisation de la lactase ainsi que de ses paramètres cinétiques, une méthode de «délactosation» du lait. Le sujet comporte trois parties : - localisation de la lactase intestinale ; - détermination des caractéristiques cinétiques de la b galactosidase ; - réalisation d'un réacteur de «délactosation» du lait. - Page 1 sur 9 -
1. Localisation de la lactase intestinale 1.1. Mise en évidence par coloration in toto chez la souris nouveau né - Prélever l ensemble de l intestin, du duodénum au cæcum, et le déposer dans du PBS 1X en boite de Pétri. - Présenter à l examinateur la préparation en indiquant les zones à prélever : duodénum, jéjunum et iléon. - Couper trois segments de 2 à 3 mm de chacune de ces régions. - Déposer chaque segment dans un puits d une microplaque contenant 350 µl de PBS 1X. - Rincer avec du PBS 1X. - Incuber avec 100 µl de mélange réactionnel. - Prélever délicatement à la pince, aux temps 5, 10 et 15 minutes, un segment de chaque région et le transférer dans un puits contenant du PBS 1X. - Sous la hotte : - transférer dans un puits contenant du fixateur et laisser incuber 15 minutes minimum ; - vider le fixateur dans un récipient à solvants organiques ; - rincer au PBS 1X. - Observer l évolution de la coloration au cours du temps. - Présenter le résultat à un examinateur. 1.1.1. Noter l évolution de la coloration au cours du temps. 1.1.2. Conclure. Réactifs PBS X1 Mélange réactionnel - 5-bromo-4 chloro-3-indoxyl b D-fucopyranoside 0,3 mg.ml -1 - Tampon phosphate ph 6 100 mmol.l -1 - Hexacyanoferrate (II) de potassium 4 mmol.l -1 - Hexacyanoferrate (III) de potassium 4 mmol.l -1 Fixateur - Para formaldéhyde 4 % dans du PBS X1 1.2. Mise en évidence par coloration histochimique sur coupe d intestin de souris adulte Sur la lame histologique fournie, sont déposées de gauche à droite deux coupes de duodénum, deux coupes de jéjunum et deux coupes d iléon. Les coupes ont été réalisées à partir d intestin de souris à jeun. - Recouvrir les coupes de 300 µl de PBS 1X. - Attendre 10 minutes. - Eliminer le PBS 1X. - Recouvrir avec 150 µl de mélange réactionnel. - Incuber 15 minutes à température ambiante. - Page 2 sur 9 -
- Rincer au PBS 1X. - Fixer sous la hotte : - recouvrir de fixateur et laisser incuber 15 minutes ; - vider le fixateur dans un récipient à solvants organiques ; - rincer au PBS 1X. - Monter entre lame et lamelle dans du PBS 1X. - Observer et présenter le résultat à un examinateur. 1.2.1. Décrire les observations et conclure. 1.2.2. Comparer les résultats obtenus chez le nouveau-né et chez l adulte. Réactifs PBS X1 Mélange réactionnel - 5-bromo-4 chloro-3-indoxyl b D-fucopyranoside 0,3 mg.ml -1 - Tampon phosphate ph 6 100 mmol.l -1 - Hexacyanoferrate (II) de potassium 4 mmol.l -1 - Hexacyanoferrate (III) de potassium 4 mmol.l -1 Fixateur - Para formaldéhyde 4 % dans du PBS X1 2. Détermination des caractéristiques cinétiques de la b galactosidase Dans cette partie, les paramètres cinétiques de la b Galactosidase seront déterminés grâce à son action catalytique sur l un de ses substrats le 2-nitro-phényl-b D galactoside (ONPG). 2.1. Etude préliminaire : détermination du coefficient d absorbance spécifique molaire de l ONP Réaliser une gamme d étalonnage d ortho-nitro-phénol (ONP) en tampon ph 7, à 37 C en semi microcuve. Le volume total est de 1 ml et la quantité maximale d ONP est de 1 µmol. 2.1.1. Présenter un tableau de gamme complet avec le résultat des mesures. 2.1.2. Déterminer le coefficient d absorbance spécifique molaire de l ONP exprimé en m_.mol -1 à 405 nm, en tampon phosphate ph 7, à 37 C. 2.1.3. Compléter le tableau récapitulatif des résultats. - Page 3 sur 9 -
Réactifs ONP en tampon ph 7 1 mmol.l -1 Tampon ph 7 - Tampon phosphate de potassium à ph 7 0,05 mmol.l -1 - Mg 2+ 1,5 mmol.l -1-2-mercaptoéthanol 15 mmol.l -1 2.2. Détermination des paramètres cinétiques de la lactase Dans cette partie la constante de Michaélis (K M ) sera déterminée à ph 7 vis-à-vis de l ONPG : - seul ; - en présence de lactose ; - en présence de galactose. La vitesse maximum (V m ) sera également déterminée dans chacun des cas. Toutes les mesures cinétiques seront réalisées en cuve visible, en spectrophotomètre thermostaté, dans les conditions suivantes : - tampon phosphate ph 7 ; - température 37 C ; - préincubation 5 minutes ; - latence 15 secondes. 2.2.1. Détermination de K M vis-à-vis de l ONPG Mesurer l absorbance à 405 nm toutes les 5 secondes pendant 40 secondes. ONPG 10-2 mol.l -1 (ml) 0,1 0,15 0,2 0,5 0,8 Eau distillée (ml) 0,9 0,85 0,8 0,5 0,2 Tampon ph 7 (ml) 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 Enzyme diluée au 1/500 (ml) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 Déterminer la vitesse initiale pour chaque concentration d ONPG. Remplir le tableau de résultats bruts. Déterminer K M et V m, un tableur grapheur est à disposition. 2.2.1.1. Joindre à la copie les courbes imprimées. 2.2.1.2. Compléter le tableau récapitulatif des résultats. 2.2.2. Détermination de K M vis-à-vis de l ONPG en présence de lactose Mesurer l absorbance à 405 nm toutes les 5 secondes pendant 40 secondes. - Page 4 sur 9 -
ONPG 10-2 mol.l -1 (ml) 0,1 0,15 0,2 0,5 0,8 Lactose 10 g.l -1 (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Eau distillée (ml) 0,7 0,65 0,6 0,3 0 Tampon ph 7 (ml) 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 Enzyme diluée au 1/500 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 Déterminer la vitesse initiale pour chaque concentration d ONPG. Remplir le tableau de résultats bruts. Déterminer K M et V m un tableur grapheur est à disposition. 2.2.2.1. Joindre à la copie les courbes imprimées. 2.2.2.2. Calculer K M vis à vis du lactose. 2.2.2.3. Compléter le tableau récapitulatif des résultats. 2.2.2.4. Conclure. Donnée : M lactose = 342 g.mol -1 2.2.3. Détermination de K M vis-à-vis de l ONPG en présence de galactose Mesurer l absorbance à 405 nm toutes les 5 secondes pendant 40 secondes. ONPG 10-2 mol.l -1 (ml) 0,1 0,15 0,2 0,5 0,8 Galactose 50 g.l -1 (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Eau distillée (ml) 0,7 0,65 0,6 0,3 0 Tampon ph 7 (ml) 1,9 1,9 1,9 1,9 1,9 Enzyme diluée au 1/500 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 Déterminer la vitesse initiale pour chaque concentration d ONPG. Remplir le tableau de résultats bruts. Déterminer K M, et V max, un tableur grapheur est à disposition. 2.2.3.1. Joindre à la copie les courbes imprimées. 2.2.3.2. Calculer K I vis à vis du galactose. 2.2.3.3. Compléter le tableau récapitulatif des résultats. 2.2.3.4. Conclure. Donnée : M galactose = 180 g.mol -1 - Page 5 sur 9 -
Réactifs ONPG en eau distillée 10-2 mmol.l -1 Tampon ph 7 - Tampon phosphate de potassium à ph 7 0,05 mmol.l -1 - Mg 2+ 1,5 mmol.l -1-2-mercaptoéthanol 15 mmol.l -1 Enzyme diluée au 1/500 3. Réalisation d un réacteur de «délactosation» du lait 3.1. Immobilisation de la b galactosidase en billes d alginate La b galactosidase est immobilisée en billes d alginate en présence de chlorure de calcium et de chitosan. 3.1.1. Préparation des billes - Dans la seringue contenant 3 ml d alginate à 3 % : - introduire 1,5 ml de solution enzymatique au 1/50 ème ; - homogénéiser avec l agitateur fourni très doucement, sans incorporer d air. - Disposer sous la seringue le bécher de 400 ml contenant 150 ml de solution de CaCl 2 - chitosan. - Agiter de façon à disperser les billes sans les déformer. - Laisser s'écouler le mélange d une hauteur de 40 cm environ. - Placer le bécher contenant les billes 30 minutes dans la glace. - Disposer de la gaze sur le bécher et éliminer la solution dans un autre bécher. - Rincer deux fois les billes rapidement à l'eau distillée. - Les rincer en tampon dans un bécher de 150 ml pendant 5 minutes. - Egoutter les billes sur un papier filtre. - Compter le nombre total de billes obtenues. 3.1.2. Mesure de l'activité soluble de la solution enzymatique Dans une cuve pour spectrophotomètre, introduire : - ONPG 10-2 mol/l 1,00 ml - Tampon ph 7 1,95 ml - b galactosidase au 1/50 0,05 ml Conditions de mesure : - ph 7 ; - température 37 C ; - préincubation 5 minutes ; - latence 15 secondes. Mesurer l absorbance à 405 nm toutes les 5 secondes pendant 40 secondes. - Page 6 sur 9 -
3.1.2.1 Calculer l activité de la solution enzymatique au 1/50 en µmol.min -1.mL -1 de solution d enzyme. 3.1.2.2. Compléter le tableau récapitulatif des résultats. 3.1.3. Mesure de l'activité de l'enzyme immobilisée - Placer 6 billes dans un tube à hémolyse contenant 1 ml de tampon ph 7. - Préincuber 2 minutes à 37 C. - Ajouter 1 ml d'onpg préalablement incubé à 37 C. - Incuber exactement 1 minute en agitant. - Prélever 1 ml de surnageant et le transférer dans une semi microcuve. - Mesurer immédiatement l'absorbance à 405 nm contre un témoin convenable. - Mesurer à nouveau l'absorbance 5 minutes après. 3.1.3.1. Indiquer le nombre total de billes obtenues. 3.1.3.2. Préciser la composition du témoin utilisé. 3.1.3.3. Calculer l'activité de l'enzyme immobilisée exprimée en µmol.min -1.mL -1 de solution d enzyme. 3.1.3.4. Déterminer le rendement d'immobilisation. 3.1.3.5. Indiquer comment évolue l'absorbance après le prélèvement du surnageant? Que peut-on en déduire? 3.1.3.6. Compléter le tableau récapitulatif des résultats. Réactifs Alginate 3 % Solution de CaCl 2 - chitosan - CaCl 2 100 mmol.l -1 - chitosan 8 g. L -1 ONPG en eau distillée 10-2 mmol.l -1 Tampon ph 7 - Tampon phosphate de potassium à ph 7 0,05 mmol.l -1 - Mg 2+ 1,5 mmol.l -1-2-mercaptoéthanol 15 mmol.l -1 b galactosidase au 1/50 3.2. Dimensionnement d un réacteur de «délactosation» du lait 3.2.1. Hydrolyse du lactose en continu - Placer le reste des billes dans une seringue de 5 ml dont le fond est garni de gaze. - Régler le débit de lait entre 0,1 et 0,2 ml/min à l aide de la pince de Mohr en récupérant l éluat dans un tube à hémolyse gradué. - Traiter sur cette colonne quelques millilitres de lait et récupérer l'éluat dans un tube à hémolyse. - Page 7 sur 9 -
- Doser le lactose et le galactose sur le lait et sur l éluat, par la méthode fournie en annexe en réalisant un seul témoin réactif pour les deux dosages. 3.2.1.1. Justifier la composition des différentes cuves. 3.2.1.2. Calculer la teneur en lactose et en galactose du lait et de l éluat et valider le dosage. -1 C = (mmol.l ) = (A2 - A1). 19,05 C galactose lactose -1 (mmol.l ) = ((A2 - A1).190,5) - C galactose 3.2.1.3. Démontrer les relations précédentes. 3.2.1.4. Calculer la proportion de lactose hydrolysé. 3.2.1.5. Comparer la quantité de lactose hydrolysé et la quantité de galactose apparu. 3.2.1.6. Conclure. 3.2.1.7. Compléter le tableau récapitulatif des résultats. 3.2.2. Calcul de la taille de la colonne A l aide des résultats obtenus précédemment, dimensionner la colonne nécessaire pour hydrolyser 80 % du lactose du lait. Pour un réacteur à piston à écoulement uniforme et en présence d inhibiteur, la relation suivante s applique : ds - dt = K M Vm S Ê (I) ˆ Á1+ + S K Ë I 3.2.2.1. Justifier cette relation et montrer que I = S 0 - S. 3.2.2.2. Montrer qu en intégrant l équation différentielle du premier ordre ci-dessus, il vient : K M S0 S0 ( S0 - S). (1 - ) + K M. Ln (1+ ) = Vm. K S K I I t 3.2.2.3. Calculer le temps de séjour (t) pour obtenir une hydrolyse de 80 % du lactose initial. 3.2.2.4. Calculer la taille de la colonne. - Page 8 sur 9 -
Principe DOSAGE DU LACTOSE ET DU GALACTOSE DANS LE LAIT b-galactosidase Lactose + H 2 O ææææææææ D Glucose + D Galactose D Galactose déshydrogénase D Galactose + NAD + ææææææææææææ Acide D Galacturonique + NADH + H + Le NADH est dosé par mesure de l'absorbance à 340 nm. Défécation du lait Dans un microtube de 2 ml : Lait 100 µl Hexacyanoferrate II de potassium 100 µl Sulfate de zinc 100 µl NaOH à 0,1 mol/l 200 µl Eau distillée 1,5 ml Centrifuger 2 minutes à 13 000g Dosage du lactose et du galactose Dans des semi-microcuves pour spectophotomètre, introduire : témoin réactif contrôle lactose D galactose Tampon citrate ph 4,6 + NAD + 100 100 100 100 b-galactosidase (µl) 25 25 25 Surnageant (µl) 25 250 Solution contrôle de lactose à 2 g.l -1 (µl) 25 Agiter et incuber 10 minutes à 37 C Tampon phosphate (µl) 500 500 500 500 Eau distillée (µl) D galactose déshydrogénase (µl) 850 825 825 625 Agiter et attendre 2 minutes. Lire les absorbances A 1 à 340 nm 25 25 25 25 Agiter et incuber 15 minutes à 37 C. Lire les absorbances A 2 à 340 nm Donnée : Coefficient d absorbance spécifique molaire NADH à 340 nm = 630 m 2.mol -1 - Page 9 sur 9 -