SYNTHÈSE J Pharm Clin 2010 ; 29 (1) : 5-30 La toxoplasmose congénitale en France en 2009 Congenital toxoplasmosis in France, state of the art in 2009 STÉPHANIE DAVENEL 1, JEANNE GALAINE 1,BÉATRICE GUELET 1, SABINE MARTEIL 1, FLORENCE ROBERT-GANGNEUX 2 1 Faculté de pharmacie, Université Rennes 1, France 2 Laboratoire de parasitologie-mycologie, Faculté de médecine et CHU de Rennes, Université Rennes 1, France <florence.robert-gangneux@univ-rennes1.fr> doi: 10.1684/jpc.2010.0136 Résumé. La France appartient aux pays à forte séroprévalence pour la toxoplasmose, ce qui a conduit à la mise en place d une politique de prévention de la toxoplasmose congénitale il y a une trentaine d années. Les connaissances sur ce parasite protozoaire, Toxoplasma gondii, ont fortement progressé depuis la découverte de son cycle zoonotique en 1967. Nous dressons ici le bilan des actualitésépidémiologiques, cliniques, diagnostiques et thérapeutiques sur cette parasitose mondialement répandue, en nous intéressant plus particulièrement à la femme enceinte et son fœtus. Mots clés :toxoplasmose congénitale, diagnostic, traitement, facteurs de risque Abstract. The seroprevalence of Toxoplasma gondii infection in France is one of the highest in the world and led the Ministry of Health to set up a politics of prevention of congenital toxoplasmosis in the late 1970 s. Knowledge on this protozoan parasite has considerably grown since the last thirty years, in particular since the discovery of its whole life cycle in 1967. In this paper, we review recent data on epidemiology, clinics, diagnosis and therapy of toxoplasmosis in pregnant women and their offspring. Key words: congenital toxoplasmosis, diagnosis, antibody, therapy, risk factors Toxoplasma gondii est un protozoaire ubiquitaire, infectant 10 à 60 % des adultes dans les pays industrialisés. La toxoplasmose est bénigne chez l immunocompétent mais peut donner des formes graves chez l immunodéprimé. De plus, quand l infection est acquise pour la première fois au cours de la grossesse, la transmission transplacentaire du parasite survient dans environ 30 % des cas, pouvant alors être responsable de mort in utero ou de lésions parfois sévères chez l enfant, principalement cérébrales et oculaires. On estime que la toxoplasmose congénitale concerne aujourd hui environ 300 à 400 enfants par an, en France. Le programme français de prévention de la toxoplasmose congénitale est un modèle unique au monde. Il repose sur le dépistage sérologique de toutes les femmes enceintes et le suivi mensuel des femmes enceintes séronégatives, ainsi que sur des recommandations hygiéno-diététiques pour éviter une contamination. Nous faisons ici une revue des données récentes sur cette parasitose, d un point de vue épidémiologique, clinique, diagnostique et thérapeutique. L agent pathogène Historique Le parasite est décrit pour la première fois en 1908 à l Institut Pasteur de Tunis par deux médecins français, * Correspondance et tirés à part : F. Robert-Gangneux Charles Nicolle et Louis Herbert Manceaux, chez un rongeur sauvage d Afrique du Nord, le Ctenodactylus gondii [69] (figure 1). Ils isolent un protozoaire (sous sa forme tachyzoite) dans les tissus de ce rongeur, de forme arquée qu ils nomment Toxoxplasma gondii ; toxoplasma venant des noms grecs toxon (arc) et plasma (forme). Au même moment, l italien Alfonso Splendore trouve ce même parasite après la mort des lapins de son laboratoire à Sao Paulo au Brésil [89]. Nicolle et Manceaux présentent ainsi le genre Toxoplasma et Toxoplasma gondii devient l espèce type du genre. Par la suite, ce parasite sera isolé chez de nombreuses autres espèces animales, et à chaque fois, une nouvelle espèce est proposée et nommée d après l espèce hôte chez qui elle avait été détectée. Ce n est qu en 1939 que Sabin apporte la preuve que ces différentes espèces ne sont en fait qu une seule, Toxoplasma gondii, mais qu il en existe plusieurs souches différentes. En 1923, l ophtalmologiste tchèque Josef Jankù décrit pour la première fois un cas de toxoplasmose humaine ; il s agissait d une toxoplasmose congénitale chez un enfant atteint d une choriorétinite. En 1939, la toxoplasmose est reconnue comme une maladie congénitale par Wolf, face à un cas d encéphalite chez un enfant. En 1948, Sabin et Feldman mettent au point le premier test sérologique, le Dye Test, permettant le diagnostic sérologique de la maladie et qui a permis de révéler l importance de la prévalence de la toxoplasmose humaine. J Pharm Clin, vol. 29, n o 1, janvier-février-mars 2010 5
S. Davenel, et al. 6 Figure 1. Ctenodactylus gondii (Wilhelma zoo, Stuttgart, Allemagne). En 1969, Hutchison et Frenkel permettent une description complète du cycle de ce parasite, qui est de type coccidien [39, 52]. Morphologie et biologie Toxoplasma gondii est un protozoaire appartenant au phylum des Apicomplexa, à la classe des Sporozoaires et à la famille des Coccidies. Il est responsable d une infection très répandue dans le règne animal, chez tous les animaux homéothermes, y compris l homme. C est un parasite intracellulaire obligatoire. Au cours de son cycle, le toxoplasme se présente sous trois formes évolutives : la forme végétative, le kyste et l oocyste [30]. Forme végétative Encore appelée trophozoïte ou tachyzoïte, elle a une forme d arc et mesure 5 à 10 μm de long sur 1 à 3 μm de large. Une extrémité est plus arrondie que l autre, le pôle postérieur près duquel est généralement situé le noyau. L extrémité antérieure présente un complexe apical permettant la mobilité du parasite et sa pénétration dans les cellules. Les formes végétatives sont toujours endocellulaires. Elles se développent et se multiplient dans les cellules de tous les animaux à sang chaud et échappent à l action des processus de digestion cellulaire par des mécanismes encore mal connus. Les trophozoïtes se reproduisent par multiplication asexuée. C est le stade sous lequel le toxoplasme se multiplie lors des phases actives de l infection. Après plusieurs cycles de réplication, la cellule hôte éclate et les tachyzoïtes libérés peuvent envahir de nouvelles cellules. Kyste Structure sphérique ou ovoïde intracellulaire, mesurant 5 à 100 μm, résultant de la réponse immunitaire de l hôte. Entourés par une membrane épaisse et résistante, les kystes contiennent plusieurs centaines à plusieurs milliers de bradyzoïtes (forme végétative à bas niveau métabolique, évolution du tachyzoïte). Ces particularités structurales et métaboliques rendent le kyste et les bradyzoïtes inaccessibles aux traitements anti-toxoplasmiques actuels [31]. Les kystes sont des formes de résistance qui persistent pendant toute la vie de l hôte et permettent la propagation ultérieure du parasite par carnivorisme. Les kystes sont particulièrement abondants dans les tissus pauvres en anticorps (tissu nerveux et musculaire), ce qui explique en partie certaines des manifestations des toxoplasmoses congénitales et de l immunodéprimé. De plus, ils produisent des antigènes qui traversent la membrane kystique et entretiennent l immunité. Cette immunité est de type cellulaire, impliquant des lymphocytes T, notamment CD8+ et des cytokines, telles que l interféron gamma (IFN-γ). Chez le sujet immunocompétent, l immunité est protectrice et prévient en principe toute réinfection. Oocyste Structure ovoïde issue d une multiplication sexuée dans les cellules épithéliales intestinales du chat et autres félidés, c est une forme de résistance et de contamination. Les oocystes non sporulés sont émis dans les fèces du chat. Après maturation, il contient deux sporocystes renfermant chacun quatre sporozoïtes [87]. Cycle parasitaire [40, 52] Le rôle du chat a été mis en évidence en 1967 par Frenkel, et le cycle complet de la toxoplasmose n a été élucidé que quelques années plus tard par Hutchison. L hôte définitif du parasite est donc principalement le chat, mais d autres félidés peuvent aussi être concernés sur certains continents (jaguar, cougar, lynx). Le chat représente le principal réservoir du toxoplasme. Les hôtes intermédiaires sont tous les animaux homéothermes ou à sang chaud : mammifères (dont l homme), oiseaux et rongeurs. Le cycle comporte d une part, une multiplication asexuée, qui a lieu dans différents tissus chez les hôtes intermédiaires et, d autre part, une multiplication sexuée, qui s effectue dans l épithélium digestif de l hôte définitif (figure 2). Les hôtes intermédiaires abritent les kystes intra-tissulaires contenant des centaines, voire des milliers de bradyzoïtes. Les Félidés se contaminent en chassant les hôtes intermédiaires et en ingérant, ainsi, les kystes contenus dans leurs proies. Les formes végétatives libérées par les kystes pénètrent dans les cellules de l intestin grêle du chat, où elles se reproduisent par multiplication asexuée (schizogonie). Apparaissent ensuite dans les cellules intestinales, des éléments sexués males ou femelles, appelés gamétocytes. La fécondation ou gamogonie aboutit à la formation d un œuf appelé oocyste non sporulé (non infectieux), qui est rejeté dans le milieu extérieur, dans les fèces du félidé. Dans le milieu extérieur, ces oocystes deviennent infestants en 2 à 5 jours, après un processus de maturation appelé sporogonie. Ce dernier permet la formation de sporozoïtes. Les oocystes sporulés (matures) peuvent rester quiescents pendant plus d un an sur le sol (humide, de préférence) et rendent possible la contamination d un nouvel hôte intermédiaire. Chez l hôte intermédiaire, après ingestion des oocystes, la paroi de ces derniers se rompt dans l intestin et libère ainsi des sporozoïtes qui vont pénétrer dans les cellules épithéliales intestinales et se transformer en tachyzoïtes. Ces derniers vont disséminer rapidement dans tous les organes par l intermédiaire des monocytes/macrophages sanguins et lymphatiques. Après cette phase de parasitémie, J Pharm Clin, vol. 29, n o 1, janvier-février-mars 2010
La toxoplasmose congénitale en France Contamination orale de l'hd (rongeurs, oiseaux infectés) Hôte définitif (HD) Cannibalisme Ooystes émis dans les fèces de chat Contamination orale des HI (végétaux, crudités, fruits) Infection chronique (enkystement) Hôtes Intermédiaires (HI) (homme, mammifères, oiseaux) Infection aiguë (dissémination) les parasites s enkystent dans les tissus, en particulier ceux à l abri des défenses immunitaires comme les tissus nerveux et musculaire. Ces kystes constituent une nouvelle source de contamination soit de l hôte définitif, soit d un hôte intermédiaire carnivore ou omnivore, qui hébergera à son tour des kystes toxoplasmiques quiescents. Il faut ajouter à cela, une possibilité de passage transplacentaire des tachyzoïtes et un risque d infection fœtale, au cours de la phase de parasitémie maternelle. Epidémiologie kystes (muscles, œil) Figure 2. Schéma du cycle de Toxoplasma gondii. Modes de contamination La contamination de l homme s effectue selon trois modalités principales. Transmission par absorption d oocystes Cette contamination est essentiellement indirecte par consommation de fruits et légumes crus mal lavés ou d eau de boisson contaminée. De plus, des oocystes peuvent être ingérés, après un contact avec le sol (jardinage) ou les animaux, si l hygiène des mains est insuffisante. Les jeunes enfants peuvent se contaminer en ingérant accidentellement de la terre contaminée [8, 57]. Transmission par des kystes La contamination se fait par consommation de viandes fumées, saumurées ou insuffisamment cuites contenant des kystes tissulaires [8, 11, 14, 18, 57]. Les kystes n étant détruits que par une cuisson de la viande à 65 C [29]. D autre part, des toxoplasmes enkystés dans un greffon provenant d un donneur immun peuvent être à l origine d une primo-infection chez un receveur non immunisé [17, 45, 88, 99]. Dans cette situation, les greffes cardiaques présentent un risque de transmission majeur et nécessitent une chimioprophylaxie. Transmission par les tachyzoïtes Le tachyzoïte est une forme fragile, détruite dans le milieu extérieur et par le suc gastrique. C est l agent de tachyzoïtes (sang) transmission transplacentaire la transmission transplacentaire, responsable de la toxoplasmose congénitale [77]. D autre part, si le donneur est en phase de parasitémie, le tachyzoïte peut être transmis par transfusion. Ces cas sont néanmoins exceptionnels du fait de la brièveté de la parasitémie. Résistance et sensibilité des différents stades de Toxoplasma Gondii Sensibilité à la température Les oocystes La majorité des oocystes sporulent en 2 à 5 jours à une température ambiante de 15-25 C, on peut donc dire que les denrées alimentaires sont souillées par des oocystes sporulés. Les oocystes sont viables après une congélation à - 21 C pendant 28 jours [41, 86]. À + 4 C, les oocystes restent viables pendant au moins 54 mois et restent infectieux pendant 18 mois [31]. Les oocystes sporulés peuve survivre plusieurs jours à 35 C [28]. Les kystes - Les kystes persistent pendant plusieurs jours dans la viande infectée, jusqu à une température de - 20 C. - Les kystes peuvent survivre après 3 minutes à 64 C [29]. On préconise alors une température d au moins 65 C sur l épaisseur de la viande pour tuer les kystes. Les tachyzoïtes Les tachyzoïtes survivent à 4 C dans le lait pendant au moins une semaine [101], mais ils sont détruits par la pasteurisation [92]. Sensibilité au NaCl Les oocystes peuvent sporuler dans une eau à 1,5 et 3,2 % de salinité, à température ambiante. Les tachyzoïtes sont infectants dans les liquides biologiques (NaCl 0,9 %). J Pharm Clin, vol. 29, n o 1, janvier-février-mars 2010 7
S. Davenel, et al. 8 Sensibilité aux micro-ondes La cuisson de la viande contenant des kystes au four à micro-ondes ne permet pas d éliminer totalement le parasite, probablement en raison de l hétérogénéité de la température atteinte au sein de la pièce de viande [63]. Il n existe pas de données sur les autres formes. Sensibilité à la dessiccation Les tachyzoïtes sont les formes les plus sensibles à la dessiccation, mais les oocystes le sont également. Une suspension d oocystes de toxoplasmes laissée à sécher complètement pendant 24 heures perd son pouvoir infectieux [28]. Aucune expérience n a été réalisée sur des denrées alimentaires. Au total les données sur la résistance des différents stades parasitaires du toxoplasme sont assez limitées, cependant on peut retenir que : les kystes sont tués à une température de 67 C et par une congélation à - 20 C, ils restent infectants après plusieurs semaines à 4 C; les oocystes sporulés sont tués à une température de 60 C pendant 1 minute, mais la congélation ne permet pas de les inactiver, de même que l eau de javel, ils sont très résistants aux produits désinfectants ; les tachyzoïtes sont plus fragiles, ils sont détruits par l eau pure mais peuvent persister plusieurs jours dans les liquides physiologiques comme le lait. Sources d infection pour l homme Environnement Les oocystes émis dans les fèces de félidés sont disséminés dans l environnement par le vent, l eau, les vers de terre et les arthropodes. Ils peuvent persister plusieurs mois à température ambiante, et ce d autant mieux que les chats enfouissent leurs excréments dans la terre. Ils peuvent ainsi contaminer tous les fruits et végétaux poussant au ras du sol. La présence des oocystes dans les eaux de surface, de loisirs ou d eau de mer est suspectée mais aucune étude sanitaire ne les a mis en évidence. Une seule publication fait état de la mise en évidence d ADN toxoplasmique dans les eaux [96]. En 1997, des cas groupés de toxoplasmose acquise au Canada ont été décrits comme étant liés à la contamination du réseau de distribution d eau potable par des oocystes [12]. En effet, en Amérique du Nord, l eau potable est essentiellement alimentée par les eaux de surface des grands lacs, dont les systèmes de filtration sont potentiellement débordés lors de fortes pluies. Denrées alimentaires Viande et abats Les kystes sont présents dans la viande et plusieurs études sur les facteurs de risque de la toxoplasmose indiquent que la consommation de viande mal cuite est le principal facteur de risque [8]. Lait cru Les tachyzoïtes de T. gondii ont été retrouvés dans le lait de plusieurs hôtes intermédiaires (brebis, chèvre et vache), mais pas chez l homme. Des cas liés à l ingestion de lait de chèvre non pasteurisé ont été décrits [85]. Végétaux La contamination par des végétaux contaminés est fortement suspectée par : l existence d infections chez les végétariens, même si, dans ce cas, le rôle de l eau est aussi évoqué [48] ; le fait que la consommation de crudités soit identifiée comme un facteur de risque [8] ; expérimentalement l adhésion et la survie des oocystes sur les fruits ont été démontrés [61]. Coquillages et crustacés La présence d oocystes dans les produits de la mer est suspectée par l observation d une séropositivité des otaries dans la baie de San Francisco, de l ordre de 50 % [32]. De plus, des oocystes survivent plusieurs jours dans des huîtres infestées expérimentalement [62]. Cependant, aucune étude n a été réalisée sur des coquillages prélevés en milieu naturel ou commercialisés. Les facteurs de risque en France (à partir d une étude cas-témoins en France en 1995 [7]) Afin de mieux prendre en charge la prévention de la toxoplasmose chez les femmes enceintes, l étude des facteurs de risque est primordiale, c est pourquoi une étude cas-témoins a été réalisée au cours du premier trimestre de 1995. La population incluse était celle des femmes enceintes non immunisées contre la toxoplasmose dans la moitié nord de la France et bénéficiant d une sérologie mensuelle dans le cadre de leur suivi. Une séroconversion toxoplasmique a été définie comme suit : sérologie négative en IgG et IgM au cours de la grossesse suivie d au moins deux sérologies positives en IgG, associées à la présence d IgM spécifiques. Pour chaque séroconversion, des données ont été recueillies sur le mois précédent la date estimée de contamination, dont : les caractéristiques sociodémographiques ; les activités quotidiennes ; les habitudes alimentaires ; les vecteurs d information des recommandations préventives et la vérification de la connaissance d au moins 2 mesures préventives Cas et témoins ont été comparés par le calcul des odds ratio et de leur intervalle de confiance à 95 %. L analyse des résultats a retenu 3 facteurs de risque : la viande de mouton ou de bœuf consommée mal cuite (OR = 3,7 ; IC = 1,7-8,2) ; l hygiène incorrecte pour le lavage des mains et les instruments de cuisine (OR = 1,5 ; IC = 1,7-11,7) ; la consommation fréquente de crudités en dehors du domicile (OR = 4,1 ; IC = 1,9-9). La consommation de viande peu cuite a le rôle le plus important dans la survenue d une contamination. La congélation de la viande à une température inférieure à - 20 C pourrait réduire le risque associé à la consommation de viande peu cuite. Actuellement une cuisson suffisante, c est-à-dire 65 C dans toute l épaisseur de la viande est à préconiser. Il n a pas été trouvé de lien significatif entre le contact avec un chat domestique et la survenue d une séroconversion ; pourtant c est lui qui est à l origine de la dispersion des oocystes dans la terre qui vont contaminer les fruits et J Pharm Clin, vol. 29, n o 1, janvier-février-mars 2010
La toxoplasmose congénitale en France légumes. Il est probable que le rôle du chat domestique, habituellement nourri de croquettes et potentiellement moins exposé à la toxoplasmose, est moins important que celui des chats vivant à l extérieur du foyer et chassant pour se nourrir. La séroprévalence de la toxoplasmose en France Depuis la mise en place du dépistage systématique de la toxoplasmose en France dans le cadre du certificat prénuptial en 1978, puis des examens prénataux en 1985, de nombreuses études de séroprévalence ont été publiées en France. Ces études sont difficilement comparables entre elles pour des raisons techniques (sensibilité, seuils de positivité différents d une méthode à l autre) et par l attractivité différente des maternités. Deux études nationales ont été réalisées avec une centralisation des tests dans un laboratoire unique (échantillon de femmes âgées entre 15 et 45 ans, en 1982-1983). Ces études bien que pas réellement représentatives, ont eu l intérêt de confirmer l existence de disparités régionales [72, 73]. La seule étude nationale ne comportant pas de biais de sélection dans l échantillonnage est celle réalisée au cours de l Enquête Nationale Périnatale 1995 sur 13 459 femmes ayant accouché pendant la semaine du 30/01/95 au 05/02/95 [5]. Les limites de cette étude sont dues à la variabilité des paramètres techniques (technique et seuil de positivité), les sérologies étant réalisées par des laboratoires différents. Dans cette étude, la séroprévalence globale de 54,3 % est apparue liée à : l âge : elle passe de 43 % chez les jeunes de 14-19 ans à 66 % chez les femmes enceintes âgées de plus de 40 ans. Elle augmente donc avec l âge ; la région : la prévalence varie de 38 % à 68 % selon les régions, avec une valeur médiane régionale à 54,3 %. Les conditions climatiques sont un facteur explicatif de ces disparités régionales. En effet, les oocystes sont très résistants dans le milieu extérieur, mais leur sporulation est favorisée par la chaleur et l humidité. En conséquence, on peut s attendre à ce que la toxoplasmose soit plus fréquente dans les régions à climat tempéré ou chaud et humide que dans les régions à climat froid et sec. En France, les différentes enquêtes nationales ont révélé une grande hétérogénéité géographique de la séroprévalence. Les données françaises enregistrées en 1995 montrent que les plus faibles prévalences (environ 38 %) concernent les régions montagneuses à climat hivernal froid (Est, Vosges, Jura, Massif Central et Alpes) alors que dans les régions tempérées et régions chaudes et humides, les prévalences dépassent 55 % (Méditerranée, Sud-ouest et Nord-ouest) (figure 3). la nationalité : chez les femmes françaises la séroprévalence est supérieure à celle des femmes d autres nationalités. Ainsi, dans l Enquête Nationale Périnatale de 1995 elle est de 55,6 % pour les femmes de nationalité française contre 51,2 % pour les femmes originaires d Afrique du Nord vivant en France ; la catégorie socioprofessionnelle : la séroprévalence augmente chez les femmes ayant un niveau d études supérieures ou une catégorie socioprofessionnelle élevée, ou dont le conjoint a une catégorie socioprofessionnelle élevée ; la consommation de viande de mouton : l analyse des données de prévalence montre une corrélation positive entre la consommation régionale de viande de mouton et la prévalence de la toxoplasmose. Le mouton fait partie des animaux ayant une prévalence élevée située autour de 30 %. En prenant les mêmes découpages géographiques, on constate que les zones où la séroprévalence humaine de la toxoplasmose est élevée sont celles où la consommation de viande ovine est la plus importante (figure 4). Cette étude a été renouvelée lors de l Enquête Nationale Périnatale 2003 avec la même méthodologie. La séroprévalence n était alors plus que de 43,8 % en moyenne, pour la même tranche d âge (15-45 ans). Globalement, les disparités en fonction des zones géographiques se superposaient par rapport à l étude de 1995 [54] ; les 2 zones géographiques où la prévalence était la % 15-45 45-55 55-65 > 70 Figure 3. Séroprévalence de la toxoplasmose chez les femmes enceintes selon la région d habitation (France, 1995). Rapport de l Afssa, www.afssa.fr [2]. Achat 67-69 70-99 100-129 130-182 79 127 111 67 74 98 75 182 182 Figure 4. Indice d achat de viande ovine par personne par région en 2003 [54]. J Pharm Clin, vol. 29, n o 1, janvier-février-mars 2010 9
S. Davenel, et al. 10 plus élevée étaient la région parisienne et le Sud Ouest, et celles où la prévalence était la moins élevée l Est, le Centre Est et l Ouest (figure 3). La baisse de la prévalence entre 1995 et 2003 varie selon la nationalité. La diminution de la prévalence chez les femmes d Afrique du Nord vivant en France n est que de 6 % contre 21 % pour les femmes de nationalité française. Il faut cependant noter que les habitudes alimentaires, malgré une adaptation des habitudes culinaires des expatriés à celles du pays d accueil, diffèrent selon les pays. Les Maghrébins installés en France consomment moins de viande en général, mais plus de viande de mouton et moins de produits laitiers que les Français [50]. La séroprévalence a régulièrement diminué en France depuis 1960. Dans les premières études réalisées par Desmonts en région parisienne dans les années 1960, la séroprévalence était de 84 % [23]. Dans la première étude nationale réalisée en 1982, la séroprévalence est de 66 %, dans l étude d Ancelle de 1995 elle est de 54 % et enfin elle est de 43,8 % en 2003. La diminution de la prévalence entre 1995 et 2003 est comprise entre 17,4 % pour les femmes âgées de 20 ans et 13,1 % pour les femmes âgées de 40 ans. La baisse a été plus marquée chez les moins de 30 ans. L interaction entre l année de l étude et l âge pourrait être le reflet d une évolution différente du risque de contracter la toxoplasmose dans le temps, avec une plus forte diminution du risque chez les plus jeunes. Divers facteurs peuvent également participer à cette baisse de séroprévalence : des facteurs techniques comme le changement de la méthode utilisée ou une modification dans l interprétation des résultats. Mais l influence de ces facteurs techniques est limitée ; le changement de l alimentation des chats (conserves ou croquettes), qui peut avoir réduit le niveau d infestation des chats, surtout en milieu urbain ; la modification des habitudes alimentaires chez l homme, avec notamment la consommation plus répandue de viande congelée ou la baisse de la consommation de viande saignante ; la chute de l auto-approvisionnement en viande ovine depuis une vingtaine d années (http://www.vienne. chambagri.fr/reperes/filieres/viandeovine.htm) ; le maintien de l approvisionnement en viande ovine auprès de pays à faible endémicité comme le Royaume- Uni (La filière Ovine Caprine en France, www.officeelevage.fr) ; le contrôle de la toxoplasmose chez l animal [1, 15] qui contribue à la baisse de la prévalence chez l animal, donc à une baisse de l exposition pour l homme. La toxoplasmose est une zoonose cosmopolite et sa prévalence varie notamment en fonction de l environnement et des habitudes alimentaires. Dans les pays développés, la contamination est essentiellement liée à la consommation de viandes infectées. La prévalence est faible, en général inférieure à 25 % dans les pays où la viande est consommée bien cuite : Royaume-Uni [4], Scandinavie [74] et Amérique du Nord [56]. En France et en Allemagne, les chiffres sont plus élevés, 40 à 60 %, du fait de la consommation fréquente de viandes saignantes ou fumées. En Asie du sud-est et au Japon, la prévalence est très faible, inférieure à 10 % [70], et de l ordre de 20 à 30 %, dans le sous-continent indien et au Proche Orient. Dans les pays tropicaux d Afrique et d Amérique [27, 47], la contamination est plutôt liée à l absorption d oocystes. La prévalence est faible dans les zones où le climat est chaud et sec, peu favorable à la survie des oocystes sur le sol. En revanche, elle est élevée dans les régions humides, parfois supérieure à 60 %. L incidence de la toxoplasmose en France En 2003, le taux d incidence pour 1 000 femmes enceintes a été estimé à 7,2 pour les femmes âgées de 20 ans, 6,1 pour les femmes âgées de 30 ans et 6,3 pour les femmes âgées de 40 ans [9]. Ce taux d incidence varie selon les régions géographiques et l âge. Toutefois, si les femmes enceintes séronégatives suivent les recommandations de prévention, l incidence de la toxoplasmose lors de la grossesse devrait être plus faible que l incidence estimée. Le taux d incidence a diminué entre 1995 et 2003 de 17,6 % chez les femmes âgées de 20 ans et de 8,3 % chez les femmes de 40 ans. La décroissance du taux d incidence au cours de cette période a donc été d autant plus importante que les femmes étaient jeunes. Le taux d incidence estimé chez les femmes de 40 ans était moins élevé que chez les femmes de 30 ans entre 1995 et 1998, puis cette situation s est inversée. La baisse du taux d incidence est observée dans toutes les régions, cependant cette baisse est variable : entre 20 % et 36 %. Un CNR pour la toxoplasmose Le Centre National de Référence de la Toxoplasmose a été nommé en janvier 2006 en réponse à l appel d offres lancé par l Institut de Veille Sanitaire (InVS) relatif à la création de nouveaux centres de référence dédiés à cette pathologie. Les principaux objectifs sont une meilleure connaissance épidémiologique de cette maladie en France et une évaluation des pratiques de diagnostic pour tendre à une meilleure standardisation de la prise en charge des patients. Pour répondre à ces objectifs, le CNR s est structuré autour de quatre Pôles d activités. Ainsi le laboratoire coordonnateur (Pôle Épidémiologie) assisté de trois laboratoires associés (Pôle Souches, Pôle Sérologie, Pôle Biologie moléculaire), a entrepris depuis sa création, différentes actions répondant bien aux missions qui lui ont été confiées. Le CNR de la Toxoplasmose s appuie sur un réseau de laboratoires spécialisés fortement impliqués dans le diagnostic, l épidémiologie et le traitement de la toxoplasmose. Pour répondre à un objectif d évaluation de la pertinence de la politique de prévention de la toxoplasmose congénitale mis en place depuis 1978 par les autorités, le CNR de la Toxoplasmose en collaboration avec l InVS a instauré un système national de surveillance basé sur une notification des cas de toxoplasmose congénitale (via le site Web du CNR ou via des fiches de notification). Celui-ci repose sur une collaboration de tous les acteurs du réseau «Toxosurv», soit 48 laboratoires, qui notifient les cas diagnostiqués depuis 2007. L analyse des résultats permettra de suivre les tendances de l infection et notamment d estimer la prévalence de la toxoplasmose congénitale en France. On pourra ainsi contribuer dans les années à venir à la réévaluation de la politique de prévention instaurée en France depuis 1978 (à la demande de l HAS, rapport à paraître). J Pharm Clin, vol. 29, n o 1, janvier-février-mars 2010
La toxoplasmose congénitale en France Le CNR assure également la collecte des souches responsables de toxoplasmose, isolées dans les laboratoires de diagnostic anténatal, en vue de leur caractérisation génotypique et de leur cryoconservation. En développant et évaluant les techniques de diagnostic sérologique et moléculaire, le CNR contribue aux missions de conseil et d aide aux laboratoires français en charge de ce diagnostic. Un objectif important est de finaliser des guides d interprétation des résultats et de proposer des positions de consensus quant aux techniques à mettre en œuvre pour réaliser un diagnostic optimum et fiable. Enfin, le site internet du CNR est un outil important dans la diffusion des informations relatives à cette affection (www.chu-reims.fr) [20]. Physiopathologie Chez la femme enceinte La contamination digestive chez l homme se fait par ingestion de kystes ou d oocystes, ceux-ci libèrent respectivement des bradyzoïtes et sporozoïtes qui pénètrent dans les cellules de l épithélium intestinal et se transforment en tachyzoïtes, formes d invasion et de dissémination. Cette phase initiale courte est asymptomatique. Les tachyzoïtes sont capables d envahir tout type de cellules, ce qui explique la large diffusion dans l organisme. La pénétration est un processus actif au cours duquel le parasite libère de nombreuses molécules présentes dans des compartiments spécifiques de stockage (micronèmes, rhoptries, et granules denses) [30]. Après une phase de multiplication, les tachyzoïtes diffusent dans la circulation sanguine et lymphatique, via les phagocytes mononucléés et peuvent ainsi gagner tous les tissus. Sous l influence de certains facteurs encore mal connus (réponse immunitaire de l hôte, nature de la cellule envahie.), les tachyzoïtes vont réprimer certains gènes et se différencier en bradyzoïtes, de morphologie très proche, mais à multiplication ralentie. Le stade final est atteint lorsque le kyste est entouré d une paroi résistante dont la composition est mal connue, mais dérive de la membrane cellulaire initiale [35]. Les kystes restent à l état latent chez l hôte en particulier dans les sites pauvres en anticorps : muscles, cerveau, œil. En cas d immunodépression, la réactivation des bradyzoïtes des kystes est possible ; ils reprennent des cycles de division et se transforment en tachyzoïtes. Les tachyzoïtes libérés, vont créer localement un foyer d inflammation et de nécrose puis potentiellement disséminer dans tout l organisme. Dans le placenta et chez le fœtus Lors de l infection maternelle, il y a colonisation du placenta par les tachyzoïtes lors de la phase de dissémination. L environnement immunitaire tolérogène lié à l état de grossesse, ainsi que des facteurs encore mal connus, peuvent conduire à un passage transplacentaire et une infection congénitale du fœtus, en moyenne dans 30 % des cas. Le toxoplasme va diffuser et atteindre différents tissus comme le foie, le cerveau, l œil, le poumon, la rate, le cœur, et diffuser dans le liquide amniotique, au niveau duquel sera effectué le diagnostic anténatal. Les dégâts seront d autant plus importants que le stade de la grossesse est jeune. L atteinte de ces tissus associe des foyers de nécrose et d inflammation autour des kystes rompus, l atteinte cérébrale peut comporter une nécrose autour de l aqueduc de Sylvius, associant vascularite, thrombose et calcifications qui seront responsables d hydrocéphalie par obstruction de l aqueduc de Sylvius [42, 77]. La réponse immunitaire au cours de la grossesse et chez le fœtus L infection par les parasites active les macrophages et cellules dendritiques qui libèrent du TNF-α et de l IL-12, ceux-ci stimulent la production d IFN-γ par les cellules NK (Natural Killer) et à une différentiation lymphocytaire orientée vers une réponse de type Th1. Cette production de cytokines contribue à limiter la multiplication des tachyzoïtes et conduit à l enkystement. L immunité à long terme est dépendante du maintien de immunité cellulaire T. De plus, l infection génère une réponse humorale impliquant les IgG, IgA, IgM, IgE. Les IgG persistent toute la vie et sont témoins d une immunité acquise, qui est en principe protectrice contre une réinfection. Chez la femme enceinte, les modifications hormonales favorisent les réponses immunologiques de type Th2 ce qui pourrait augmenter la sensibilité à l infection, par diminution de la production d IFN-γ, d IL-2 et de TNF-α et augmentation de la synthèse d IL-10. À l opposé l importance de la réponse Th1 avec production de cytokines proinflammatoires (IL-2 et IFN-γ), contrebalançant les effets de la réponse Th2 liée à la gestation, pourrait être à l origine des avortements lors de toxoplasmose en début de grossesse, un excès de production d IFN-γ et une augmentation d activité NK étant par ailleurs connus comme des facteurs associés à l éclampsie et aux fausses couches. Chez le fœtus, l immaturité du système immunitaire favorise l infection toxoplasmique. Les cellules NK sont présentes à partir de la 6 e semaine de gestation mais leur activité est diminuée de 50 % par rapport à celle des adultes, les macrophages sont présents à partir de la 4 e semaine mais la production d IL-12 à la naissance est plus faible que chez les adultes avec une diminution de production d IFN-γ et de l induction de la réponse Th1 [22, 66]. Au cours du 1 er trimestre de grossesse, les cellules immunitaires ne reconnaissent pas les antigènes toxoplasmiques, ce qui induit une tolérance vis-à-vis de ces antigènes, et pourrait expliquer les réactivations périodiques à l origine des épisodes de choriorétinites au cours de la vie [49, 100]. Facteurs de virulence Les génotypes responsables de toxoplasmose congénitale En France, le réseau organisé autour du CNR Toxoplasmose permet de recueillir les souches responsables de toxoplasmose congénitale ou de toxoplasmose grave hors contexte de grossesse, et de les typer. Le typage des souches repose sur des techniques de PCR et de séquençage de certains gènes (MLST ou Multilocus Sequence Typing) [3] et d analyse iso-enzymatique [21]. Trois génotypes à diffusion clonale sont connus dans le monde (génotypes I, II et III), et leur répartition géographique n est pas homogène. Le génotype II est de loin le plus fréquemment isolé en France (Rapports d activité du CNR, 2007, 2008 [20]), il est aussi le moins virulent pour l homme, J Pharm Clin, vol. 29, n o 1, janvier-février-mars 2010 11
S. Davenel, et al. et le plus souvent associé à des toxoplasmoses infracliniques. Des génotypes recombinants (I/II, I/III, II/III) sont également retrouvés, mais beaucoup plus rarement ; ils sont généralement associés à des toxoplasmoses symptomatiques ou graves. Il existe enfin des génotypes dits «atypiques», qui sont inclassables dans les génotypes classiques, et sont probablement issus de recombinaisons multiples. Lorsqu ils sont isolés chez l homme, ils sont toujours associés à des toxoplasmoses graves [3]. Rôle du terrain génétique L infection toxoplasmique est à la fois dépendante de l immunité et du terrain génétique de l hôte. Il a été montré sur des cohortes nord-américaines, que certains allèles du CMH de type II étaient plutôt protecteurs (HLA-DQ1) ou favorisant (HLA-DQ3) la survenue de toxoplasmose sévère [64]. Des polymorphismes de certains gènes, comme ABCA4 (ATP binding cassette) et COL2A1 (coll II) ont été récemment décrits comme étant associés à des atteintes oculaires et cérébrales dans la toxoplasmose congénitale [55]. Risque de transmission materno-fœtale et gravité de la toxoplasmose congénitale La toxoplasmose congénitale résulte de la contamination du fœtus au cours de la grossesse, lors de la phase de parasitémie [77]. En France, la fréquence de la toxoplasmose congénitale est estimée à 1 cas pour 1 000 naissances, ce qui représenterait environ 600 cas annuels. La circonstance la plus habituelle est la survenue d une primo-infection chez la femme enceinte, mais la transmission peut également se produire lors d une récurrence parasitémique chez la femme enceinte immunodéprimée. Le risque de passage de la barrière placentaire augmente au cours de la grossesse, mais en parallèle, les conséquences sont d autant plus graves pour le fœtus, que celui-ci est jeune et que son système immunitaire est incomplet [33]. Le risque de transmission materno-fœtale est globalement de 30 % : inférieur à 10 % au 1 er trimestre, mais les complications fœtales sont souvent gravissimes (mort in utero, encéphalo-méningo-myélite conduisant souvent à une hydrocéphalie et macrocéphalie, microphtalmie ). Ces formes graves sont actuellement rarement observées en Risque % 100 Risque de signes cliniques en cas de transmission fœtale France chez des bébés nés vivants, du fait des modalités de dépistage et de prise en charge des séroconversions ; 10 à 40 % au 2 e trimestre, donnant un tableau de toxoplasmose généralisée plus ou moins grave (retard psychomoteur, choriorétinite, convulsions, hépatosplénomégalie, éruption généralisée ) ; supérieur à 50 % au 3 e trimestre, mais les lésions sont de moins en moins graves, car le fœtus est déjà bien développé. Il en résulte des cas de toxoplasmose congénitale latente, qui concerne 80 % des cas de toxoplasmose congénitale en France. Ces enfants naissent souvent sans symptômes, mais ont un risque de déclarer plus ou moins tardivement des manifestations oculaires de toxoplasmose (choriorétinites) au cours de leur vie. Le dépistage des femmes enceintes vise à instaurer rapidement un traitement afin de réduire le risque de transmission, tandis que le dépistage des fœtus et nouveau-nés permet d instaurer un traitement précoce des bébés, afin d éviter au maximum la survenue de séquelles tardives (figure 5). Manifestations cliniques Chez la femme enceinte L expression de la toxoplasmose est différente selon l état immunitaire du patient et la souche de parasite en cause. Chez la femme enceinte immunocompétente elle est asymptomatique dans 80 % des cas [26, 33]. Les formes symptomatiques associent fièvre, adénopathies, et asthénie qui peut durer quelques jours ou quelques semaines et qui va disparaître spontanément. Chez le fœtus La contamination du fœtus résulte du passage transplacentaire du toxoplasme lors de l infection maternelle. Le risque de transmission augmente avec l âge de la grossesse mais àl inverse les atteintes du fœtus diminuent au cours de la grossesse. En général la toxoplasmose congénitale se manifeste par la triade : rétinochoroïdite, hydrocéphalie, calcifications intra-crâniennes. Elle peut aussi atteindre d autres organes. De plus les lésions évoluent de manière imprévisible, et peuvent réapparaître plus tard chez l enfant. Risque global d'atteinte fœtale (transmission + symptomatologie) Risque de transmission fœtale 80 60 40 20 0 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 Semaines d'aménorrhée 12 Figure 5. Risque de transmission fœtale durant la grossesse (d après [33]) J Pharm Clin, vol. 29, n o 1, janvier-février-mars 2010
La toxoplasmose congénitale en France Il existe une classification des signes cliniques proposée par Desmonts, selon 4 types d atteintes différentes : 1. l atteinte neurologique avec hydrocéphalie, microcéphalie, microphtalmie avec ou sans rétinochoroïdite. Ces signes peuvent être diagnostiqués à la naissance ou plus tard ; l hydrocéphalie peut être observée avec un développement moteur normal en début de vie. L échographie permet d identifier deux types de lésions : des dilatations ventriculaires et des hyperdensités intracrâniennes correspondant aux calcifications (figure 6) ; 2. l atteinte généralisée sévère avec exanthème maculo-papulaire, purpura, pneumonie, ictère, hépatosplénomégalie, accompagnée ou non d atteinte oculaire ou neurologique ; 3. l atteinte modérée avec hépato-splénomégalie et ictère, avec ou sans thrombocytopénie. Le diagnostic de l infection toxoplasmique se fait souvent plus tard lors d apparition de rétinochoroïdite ; 4. l atteinte infra-clinique : pas de symptômes ou atteinte oculaire différée dont la gravité dépend de la localisation par rapport à la macula et qui peut se manifester plus tard au cours de la vie. Données actuelles pour la France La figure 7 montre les cas issus des données recueillies par le CNR en 2008 [20] : En 2008, 263 cas de toxoplasmose congénitale ont été déclarés en France conduisant à une interruption de grossesse dans 15 cas (11 interruptions de grossesse pour raison médicale et 4 morts fœtales in utero) ; 229 enfants sont nés dont 4 présentent une atteinte sévère IMG 11 Interruptions grossesse 15 Morts fœtales 4 Cas de toxoplasmose congénitale 263 Issues inconnues 19 Forme sévère 1 hydrocéphalie + CIC* Figure 6. Toxoplasmose cérébrale (Imagerie par Résonance Magnétique) issue du cédérom Anofel (http://www.cdanofel.fr/ bdc-anofel.html) [6]. de la maladie, 20 une atteinte modérée et 205 enfants sont asymptomatiques à la naissance. Ainsi, la létalité liée à la toxoplasmose congénitale est de 6 % (15/244 cas suivis) et la morbidité globale représente 9,8 % (24/244 cas suivis de toxoplasmoses congénitales). La plupart des enfants contaminés pendant la grossesse sont donc asymptomatiques et les formes d atteintes Formes modérées 20 205/229 = 89,5 % FORMES ASYMPTOMATIQUES Naissances 229 (205 asymptomatiques) Formes sévères 4 10 anomalies échographiques 2 dilatations ventriculaires + CIC* 5 dilatations ventriculaires 2 CIC* 1 anomalie autre 1 anomalie échographique 1 dilatation ventriculaire 3 échographies normales ou non faite 13 CIC* 1 CIC* + choriorétinite périphérique unilatérale 3 CIC* + forme clinique diverse 3 formes cliniques diverses 1 hydrocéphalie + CIC* 1 hydrocéphalie + CIC* + hépatosplénomégalie + forme clinique diverse 1 hydrocéphalie + forme clinique diverse 1 choriorétinite maculaire + forme clinique diverse 1 échographie normale * CIC = calcification intracrânienne; IMG = interruption médicale de grossesse Figure 7. Cas de toxoplasmose congénitale en France en 2008. Rapport d activité du CNR [20]. J Pharm Clin, vol. 29, n o 1, janvier-février-mars 2010 13
S. Davenel, et al. 14 sévères sont plus rares. Cependant il ne faut pas négliger le risque d interruptions de grossesse sans diagnostic posé (donc non déclarés) et l apparition de lésions tardives, qui peuvent être plus ou moins invalidantes. Ce recueil est donc à considérer comme étant probablement le reflet de l épidémiologie de la toxoplasmose en France, mais le nombre de cas est probablement sous-estimé, du fait du système de surveillance, qui repose sur la notification volontaire des cas, d une part, et l absence d obligation de dépistage postnatal des enfants d autre part. Diagnostic de la toxoplasmose congénitale Principes généraux du diagnostic Le diagnostic de l infection toxoplasmique est réalisé chez les femmes dont on veut connaître l état de l immunité avant ou au cours de la grossesse et chez les nouveau-nés en cas de suspicion de toxoplasmose congénitale. Il est aussi pratiqué dans d autres circonstances que la grossesse chez des sujets présentant des signes cliniques évocateurs de la maladie pour les différencier d autres affections (choriorétinite chez le sidéen, etc.). Il se pose également chez des sujets immunodéprimés, notamment atteints de sida et transplantés, cependant ces deux dernières indications ne seront pas traitées dans l étude qui suit. Suivant le contexte clinique, le diagnostic biologique de la toxoplasmose repose sur l isolement du parasite ou de l ADN parasitaire et/ou sur la mise en évidence des anticorps spécifiques. Le diagnostic chez l immunocompétent est avant tout sérologique tandis que chez l immunodéprimé, il est principalement parasitologique. Dans la plupart des cas, la sérologie représente la base du dépistage et du diagnostic de la toxoplasmose. Cependant la recherche du parasite ou d ADN parasitaire est indispensable sur le liquide amniotique, le placenta ou le sang de cordon lors d un dépistage de toxoplasmose congénitale. Diagnostic parasitologique Examen direct La recherche de tachyzoïtes ou de kystes sur frottis ou appositions est possible après coloration au May Grunwald-Giemsa (MGG) ou par immunofluorescence à l aide d anticorps monoclonaux, mais la détection des parasites est difficile s ils sont peu nombreux. Cette technique est surtout utilisée sur des prélèvements de patients immunodéprimés (LBA, ganglions, moelle osseuse, biopsies diverses). Isolement du toxoplasme par inoculation à la souris Cette technique fut la première utilisée pour le diagnostic parasitologique et demeure aujourd hui une technique de référence pour isoler les toxoplasmes viables. Après inoculation des prélèvements pathologiques, les souris infectées développent rarement des signes cliniques. Des contrôles sérologiques sont effectués chez la souris 4 à 6 semaines plus tard. En cas de positivité, les kystes sont recherchés au niveau du cerveau. La sensibilité de cette technique, proche de 60 % est moins bonne que celle de la PCR. Sa spécificité est excellente puisqu elle est de 100 % [34]. Son désavantage majeur réside dans le délai de la réponse, en moyenne 5 semaines, qui ne pourrait être réduit qu au prix d une perte de sensibilité importante. L inoculation à la souris permet néanmoins d isoler les souches et de les conserver pour des études ultérieures de virulence et de typage. Cependant, cette méthode est limitée par le besoin d une quantité suffisante de prélèvement biologique et la disponibilité d un laboratoire utilisant des animaux, ce qui requiert une autorisation spécifique par la Direction des Services Vétérinaires. Culture cellulaire La culture du parasite est facile et peut être réalisée en routine sur de nombreux systèmes cellulaires utilisés également pour la virologie. En pratique, les cultures de fibroblastes (type MRC5 ou HF) sont souvent utilisées. Après 3 à 5 jours de culture, la croissance parasitaire est visualisée par révélation immunoenzymatique ou par immunofluorescence. Cette technique n est jamais utilisée seule pour le diagnostic et sa sensibilité est souvent médiocre hors contexte d immunodépression [80]. Son intérêt réside dans l isolement possible de la souche de toxoplasme incriminée pour des études ultérieures de typage. Biologie moléculaire : PCR Des progrès considérables en matière de diagnostic de la toxoplasmose ont été faits avec la PCR (Polymerase Chain Reaction) et elle est applicable sur tous types de prélèvements (sang, liquide amniotique, LCR, LBA, etc.). Plusieurs gènes cibles ont été utilisés pour la détection d ADN de T. gondii. Les principales régions cibles sont la séquence répétée B1 (gène répété 35 fois dans le génome de T. gondii) ou le gène codant pour la sousunité 18S de l ADN ribosomal (gène répété 110 fois), et plus récemment la séquence REP529, répétée 200 à 300 fois dans le génome, ce qui augmente largement sa sensibilité. La mise au point de la technique de PCR doit être effectuée dans chaque laboratoire, en l absence de kit spécialisé pour ce diagnostic. La contamination par des produits d amplification antérieurs est maintenant un écueil bien maîtrisé par les laboratoires de référence qui utilisent une décontamination préalable par l uracyl-dna-glycosylase. La présence d inhibiteurs de la Taq polymérase, à l origine de faux négatifs, est plus difficile à circonvenir. Une nouvelle approche, la PCR en temps réel, permet de suivre instantanément la quantité d amplicons générés au cours du temps sans manipulation post-amplification, ce qui réduit la contamination décrite précédemment et réduit le délai de réponse. Comparée aux techniques conventionnelles, cette technique moléculaire est la seule où la présence d un seul parasite dans le liquide biologique soit théoriquement suffisante pour positiver directement la réaction, après un temps d analyse de six heures. La sensibilité de la PCR en temps réel est nettement supérieure à l inoculation à la souris et permet la quantification de l ADN présent dans les échantillons par comparaison avec une gamme étalon [19]. Les résultats posent malheureusement des problèmes de reproductibilité pour les valeurs faibles. Les applications de la PCR pour le diagnostic d une infection toxoplasmique concernent le diagnostic anténatal et le diagnostic de toxoplasmose chez les patients immunodéprimés. En revanche, elle n a pas d indication dans le cadre de la toxoplasmose chez le patient immunocompétent. J Pharm Clin, vol. 29, n o 1, janvier-février-mars 2010