ELISA Human Mannose Binding Lectin ELISA kit REF M1990

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fr I. Introduction La lectine liant le mannose (MBL/Mannose binding lectin), également appelée protéine liant le mannose ou la mannane, est un facteur important de l immunité congénitale. La MBL appartient à la classe des collectines dans la super famille des lectines de type C, dont la fonction s avère être la reconnaissance des pathogènes dans la première ligne de défense chez l hôte pré-immun. La MBL reconnaît les motifs de glucides qui se trouvent à la surface d un grand nombre de micro-organismes pathogènes, y compris les bactéries, les virus, les protozoaires et les champignons (1, 2, 3). La fixation de la MBL à un micro-organisme provoque l'activation de la voie classique du complément, bien avant que des anticorps spécifiques n aient été formés. La MBL possède une structure oligomérique (400-700 kda), composée de protomères contenant trois chaînes peptidiques identiques de 32 kda chacune. Bien que la MBL puisse former différents oligomères, il semble que les dimères et les trimères ne soient pas biologiquement actifs et que le tétramère soit la forme minimale nécessaire pour activer le complément. La chaîne peptidique est formée d'une partie apparentée au collagène et d une partie à la lectine. La partie apparentée à la lectine se lie, par l intermédiaire des domaines de reconnaissance des glucides, à différents groupes de sucres, tels que le mannose, le maltose, la N- acétylglucosamine, la N-acétylgalactosamine, le fucose et le glucose. Cette liaison a une faible affinité (Kd 10-3 ) et il est essentiel que plusieurs parties apparentées à la lectine d'une molécule de MBL participent simultanément à la liaison pour que celle-ci soit fonctionnelle (4). Dans la circulation sanguine, la MBL forme un complexe fonctionnel avec les protéases à sérine MASP (MBL-associated serine protease) 1, 2 et 3, qui deviennent enzymatiquement actives après fixation à un micro-organisme. MASP2 est identique à la C1 estérase dans la voie classique du complément et est capable de cliver le C4 et le C2, ce qui entraîne la formation de C4b2a. Le complexe C4b2a fonctionne comme une C3 convertase et clive le C3 pour former le C3b qui provoque l'opsonisation du microbe (2). De plus, des indications montrent que la MBL se lie directement aux récepteurs de la collectine à la surface des phagocytes et il est suggéré que la MBL se fixe au récepteur C1q des granulocytes, des monocytes et des macrophages neutrophiles. La liaison aux cellules effectrices peut stimuler la production de cytokines pro-inflammatoires. La MBL est une protéine de phase aiguë, synthétisée par les hépatocytes. Immédiatement après la parturition, la concentration plasmatique de la MBL augmente de 1 000 ng/ml pour atteindre au maximum 2 500 ng/ml en quelques semaines, après quoi elle diminue jusqu'à 1 700 ng/ml chez l'adulte. Les concentrations de MBL varient considérablement d une personne à l autre et peuvent augmenter de 20 fois au cours de la phase aiguë. En tant qu élément du système immunitaire congénital, la MBL est importante au cours de la période qui suit la parturition, lorsque les concentrations d anticorps maternels diminuent et que la propre production d IgG doit encore commencer. De plus, la MBL joue un rôle important à tout âge, dans le contact primaire avec les micro-organismes, avant que les concentrations en IgM n augmentent. Importance clinique de la MBL La fréquence de la déficience en MBL est relativement élevée, par comparaison avec d'autres déficiences du système du complément, chez environ 20 à 25 % de la population totale. La déficience en BBL est associée à une augmentation de la réceptivité aux infections, telles que l'otite moyenne, la pneumonite, la gastroentérite, la méningite, l'ostéomyélite et la sepsis. Chez l enfant, une mutation hétérozygote du gène de la MBL double le risque d hospitalisation due à une maladie infectieuse, par rapport aux enfants présentant des taux normaux de MBL. Dans le cas d une mutation homozygote de gène, le risque d infections est même plus élevé et l'évolution de la maladie est plus grave que chez les patients présentant des taux normaux de MBL. Les patients atteints de fibrose cystique présentant une mutation du gène de la MBL sont plus réceptifs aux infections par Pseudomonas aeruginosa ou Burkholderia cepacia et ont une espérance de vie plus courte que les patients souffrant de cette maladie mais ne présentant pas cette mutation. Les patients oncologiques, recevant une chimiothérapie anticancéreuse et développant une neutropénie à la suite de ce traitement, sont plus susceptibles de présenter de longues périodes de fièvre si leur taux plasmatique de MBL est faible. Chez l enfant de moins d un an, atteint de la maladie de Kawasaki, une déficience en MBL est un facteur de risque pour les anévrismes des veines coronaires. Chez les patients VIH positifs, l'évolution vers le SIDA se déroule beaucoup plus rapidement s'ils sont déficients en MBL. La déficience en MBL est associée aux avortements spontanés répétés, probablement à la suite d infections intra-utérines. La déficience en MBL est associée aux maladies auto-immunes, telles que le lupus érythémateux aigu disséminé (LEAD) et la polyarthrite rhumatoïde (PR). La corrélation entre la déficience en MBL et la fréquence des maladies infectieuses et des maladies auto-immunes n a pas seulement entraîné une multiplication des produits diagnostiques de la MBL, mais a aussi démontré le besoin d'applications thérapeutiques pour la MBL purifiée. II. Principe du procédé Le test est de type ELISA, effectué sur plaques de microcupules revêtues de mannane. La MBL présente dans un volume déterminé d échantillon ou d étalon se fixe à la mannane qui revêt les cupules de la plaque de microtitration. Le matériau non fixé est éliminé par lavage. Un anticorps dirigé contre la MBL, conjugué à la peroxydase de raifort (HRP)(anti-MBL humaine/1-hrp), est ensuite ajouté. Après élimination, par lavage, du conjugué HRP non fixé, une solution de substrat est ajoutée aux microcupules. L intensité de la couleur qui se développe est proportionnelle à la quantité de MBL présente dans les échantillons ou les étalons. La réaction enzymatique est arrêtée chimiquement et la densité optique de la couleur est mesurée à 450 nm à l'aide d'un lecteur ELISA. La densité optique des échantillons et des étalons de la courbe d étalonnage permet de déterminer par interpolation la concentration en MBL des échantillons. III. Conservation et stabilité La trousse ELISA MLB doit être conservée entre -18 C et -32 C. Les performances de la trousse sont garanties jusqu'à la date d expiration mentionnée sur l étiquette de la boîte. Les conditions de transport peuvent diverger des conditions de conservation. Ne pas congeler et décongeler plus de trois fois. IV. Composition de la trousse La trousse ELISA MBL contient suffisamment de matériel pour 288 tests (trois plaques de microtitration), y compris étalons, contrôle et blanc. Voir le tableau à la fin de cette notice. La mannane à utiliser comme enduit est purifée à partir de la levure Saccharomyces cerevisiae. L anticorps monoclonal a été purifié, à partir d un milieu de culture tissulaire, par chromatographie sur colonnes (chromatographie par échange d ions et chromatographie d affinité). 2

Les sérums d étalonnage et de contrôle sont des sérums humains. V. Matériel supplémentaire nécessaire Matériel supplémentaire: Eau distillée pour la dilution des tampons de lavage, de dilution et de substrat. Bechers, ballons et éprouvettes nécessaires pour la préparation des réactifs. Dispositifs pour pipetter fournissant des volumes précis. Laveur ELISA ou pissette en plastique de 500 ml pour le lavage automatique ou manuel des barrettes de microcupules. Lecteur ELISA standard pour la mesure de la densité optique à 450 nm. Papier semi-log. Tampons et solutions supplémentaires: Tampon pour le revêtement des microcupules: tampon carbonate-bicarbonate 0,1 M, ph 9,6 Tampons et solutions pour le développement enzymatique de la couleur: Tampon de substrat: Tampon acétate 0,11 M, ph 5,5 Dissoudre 15,0 g d'acétate de sodium (CH3COONa.3H2O) dans 800 ml d eau distillée. Ajuster le ph à 5,5 avec de l acide acétique glacial, ajouter de l eau distillée jusqu à un volume de 1 litre. N ajouter aucun conservateur (p.ex. thiomersal, azide de sodium), car ceci pourrait influencer négativement le développement enzymatique de la couleur. Solution mère de 3,5,3',5'-tétraméthylbenzidine (TMB) : 6 mg/ml TMB dans du diméthylsulfoxyde (DMSO). Dissoudre 30 mg de 3,5,3',5'-tétramèthylbenzidine (TMB) dans 5 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO). Solution mère de peroxyde d hydrogène: Solution à 3 % de H2O2 dans de l eau distillée. Solution d arrêt: Solution de H2SO4 1,8 M dans de l eau distillée. Pour une plaque de microtitration, préparer 12 ml de solution de substrat en mélangeant ensemble : 12 ml de tampon de substrat 200 μl de solution mère de TMB 12 μl de solution mère de H2O2 VI. Manipulation des échantillons de test Les échantillons de sang doivent être prélevés aseptiquement. Le sérum est l échantillon de choix, mais les plasmas anticoagulés à l héparine ou à l EDTA sont également appropriés être utilisés dans ce test. En cas de plasmas, ajouter 10 U/mL d'héparine au tampon de dilution. Les échantillons doivent être aussi frais que possible ou avoir été conservés congelés. VII. Mode opératoire du test Le jour du test, décongeler tous les réactifs, les laisser venir à température ambiante (18-25 C) et les homogénéiser chacun doucement. Éviter la formation de bulles ou de mousse. Le tampon de dilution concentré 5 fois peut être placé au bain-marie à 37 C et mélangé régulièrement. L étalon et le contrôle peuvent être décongelés en les tenant dans la main. Centrifuger tous les flacons avant de les utiliser (1 minute à 3 000 g). Il est recommandé d effectuer le dosage de tous les échantillons, du contrôle et des dilutions de l étalon en double. Voir le tableau 4 de la notice incluse pour une suggestion de plan de la plaque de microtitration. Plaque de microtitration La trousse contient trois plaques de microtitration. En fonction de la quantité d'échantillons à analyser, une ou plusieurs plaques de microtitration doivent être revêtues de mannane le jour précédent le test. La mannane est fournie sous forme 100 fois concentrée avec la trousse. Le tampon de revêtement doit être préparé frais. Par plaque de microtitration, ajouter 120 µl de mannane à 12 ml de tampon de revêtement. Distribuer 100 µl dans chaque microcupule, recouvrir la ou les plaques d'un couvercle et laisser incuber pendant la nuit à température ambiante (18 25 C). Tampons Calculer la quantité de tampon de lavage requise et préparer une solution de travail en diluant le tampon 20 fois dans de l'eau distillée (une microplaque exige environ 300 ml). Le tampon de lavage dilué doit être conservé à 2-8 C et reste stable pendant 1 semaine. Tampon de dilution : calculer la quantité de tampon de dilution requise et préparer une solution de travail en diluant le tampon 5 fois dans de l'eau distillée. Préparation de l étalon et du sérum de contrôle (en double) Pour les concentrations, voir les tableaux 2 et 3 de la notice d'information incluse. Décongeler l étalon et le sérum de contrôle dans la main et en les homogénéisant doucement. Étiqueter quatre tubes, deux pour le sérum de contrôle (en double) et deux pour le point d étalonnage le plus concentré (350 ng/ml, en double). Étalon: Voir le tableau 1 de la notice d information incluse pour la préparation du point d étalonnage le plus concentré. Étiqueter huit tubes, un pour chaque dilution de la courbe d étalonnage (en double) : 140, 56, 22,4 et 9,0 ng/ml. Transférer ensuite 150 µl de tampon de dilution dans chacun de ces tubes. Transférer 100 µl du tube contenant la dilution d étalon la plus concentrée dans le tube étiquetée 140 ng/ml et mélanger bien. Répéter trois fois la dilution en série en ajoutant 100 µl du tube précédent d'étalon dilué dans les tubes étiquetés contenant 150 µl de tampon de dilution. La courbe d étalonnage contiendra 350, 140, 56, 22,4 et 9,0 ng/ml (en double). Utiliser le tampon de dilution comme essai à blanc (0 ng/ml). Sérum de contrôle : Transférer 380 µl de tampon de dilution à concentration de travail dans les tubes réservés au contrôle (en double) et y ajouter 20 µl de sérum de contrôle, puis bien mélanger. 3

Préparation des échantillons Diluer les échantillons à analyser 1:20 dans le tampon de dilution, comme pour le sérum de contrôle. Lorsque les résultats se situent en dehors de la plage des valeurs données (se reporter au Tableau 1 de la notice incluse dans la trousse), le dosage doit être répété avec un échantillon dilué différemment. 1. Premier lavage Aspirer la solution de mannane hors des cupules de la ou des microplaques. Remplir les microcupules (> 300 μl) de tampon de lavage, puis les vider ; répéter trois fois cette procédure. Les microcupules doivent finalement être complètement vides. Le réactif suivant doit être ajouté immédiatement, ne pas laisser les cupules à sec pendant une période de temps prolongée. 2. Première incubation Ajouter 100 µl des solutions diluées d étalonnage, de contrôles et d échantillons dans les microcupules appropriées. Recouvrir la microplaque d un film adhésif, l agiter doucement en la tapotant pendant quelques secondes sur les rebords afin de mélanger le contenu de chaque microcupule. Laisser incuber pendant 1 heure à température ambiante (18-25 C). Juste avant le lavage, préparer le réactif pour l incubation suivante, conformément aux instructions du point 4. 3. Deuxième lavage Aspirer le surnageant hors des cupules et laver la microplaque comme indiqué au point 1. 4. Incubation avec le conjugué anti-mbl humaine-hrp. Diluer le conjugué 1:100. Par microplaque, ajouter 120 µl de conjugué à 12 ml de tampon de dilution. Ajouter 100 µl à chaque microcupule. Recouvrir la microplaque d un film adhésif, l agiter doucement en la tapotant pendant quelques secondes sur les rebords afin de mélanger le contenu de chaque microcupule. Laisser incuber pendant 1 heure à température ambiante (18-25 C). Juste avant le lavage, préparer le réactif TMB-substrat pour l incubation suivante, conformément aux instructions du point V (matériel supplémentaire nécessaire). 5. Troisième lavage Aspirer le surnageant hors des cupules et laver la microplaque comme indiqué au point 1. 6. Incubation avec le TMB-substrat Ajouter 100 µl de solution de TMB-substrat à toutes les microcupules. Agiter doucement en tapotant pendant quelques secondes sur les rebords de la microplaque afin de mélanger le contenu de chaque microcupule. Incuber pendant 30 minutes maximum, à température ambiante (18-25 C) et dans un endroit sombre. Remarque: La vitesse du développement enzymatique de la couleur est influencée par de nombreux facteurs, y compris la température et la qualité du TMB utilisé. 7. Arrêt de la réaction enzymatique Ajouter 100 µl de solution d arrêt à toutes les microcupules. 8. Lecture de la microplaque Lire la microplaque dans un délai de 30 minutes à 450 nm à l aide d un lecteur ELISA. VIII. Résultats et interprétation des données Enregistrer la densité optique à 450 nm dans chaque microcupule et calculer la moyenne des valeurs doubles. Pour chaque échantillon, les doubles ne devront pas diverger de plus de 15 % de la valeur moyenne. Si la divergence est supérieure, le dosage devra être répété. Sur papier semi-logarithmique, représenter graphiquement les valeurs de densité optique obtenues pour les dilutions du sérum d étalonnage (axe des ordonnées) en fonction de la concentration de MBL correspondante en ng/ml (axe des abscisses) et tracer la droite de régression. Le taux de MBL présent dans le sérum de contrôle doit se situer dans la (les) plage(s) de valeurs données dans le tableau 3 de la notice incluse dans la trousse. Sur la courbe d étalonnage, interpoler les valeurs moyennes de densité optique obtenues pour chaque échantillon. Les échantillons qui présentent une densité optique moyenne se trouvant en dehors de la plage des dilutions de la courbe d étalonnage doivent être dilués de façon appropriée. IX. Plages de l essai Consulter le tableau 1 de la notice incluse pour obtenir les plages de valeurs spécifiques à la trousse. X. Valeurs de référence Des mesures effectuées chez un groupe de donneurs de sang normaux et sains aux Pays-Bas (n=244) ont donné les concentrations de MBL suivantes : Centile 10 <0.04 μg/ml Centile 25 0.4 μg/ml Centile 50 1.1 μg/ml Centile 75 2.0 μg/ml Centile 90 3.3 μg/ml Les valeurs de référence étant sujettes à l influence de nombreuses variables qui peuvent être différentes pour chaque population examinée, chaque laboratoire doit établir ses propres valeurs de référence. 4

XI. Caractéristiques spécifiques des performances Reproductibilité Variation intra-essai : deux dilutions différentes d un échantillon ont été mesurées onze fois dans un essai. Variation inter-essai : Dans six à dix essais différents, la quantité de MBL a été mesurée dans trois différents échantillons. Intra-essai Moyenne Variation Dilution 1 (1:10) Dilution 2 (1:50) 1.46 μg/ml 1.53 μg/ml 6.0% 6.1% Inter-essai Moyenne Variation Échantillon 1 Échantillon 2 Échantillon 3 1.52 μg/ml 1.49 μg/ml 1.60 μg/ml Remarque: Les valeurs mentionnées pour les caractéristiques spécifiques de performance du test, représentent des résultats typiques et ne doivent pas être considérées comme des spécifications propres à cette trousse. Sensibilité Le seuil minimum de détection de la trousse est de 9,0 ng/ml et la plage des concentrations mesurables s étend de 9,0 à 350 ng/ml. Remarque : Les valeurs mentionnées pour la sensibilité de l essai, représentent des résultats typiques et ne doivent pas être considérées comme des spécifications propres à cette trousse. Spécificité L absence de réaction croisée avec d autres constituants du plasma ou du sérum est confirmée par le fait que des résultats non distincts de zéro sont obtenus chez des donneurs déficients en MBL mais autrement sains. Valeurs attendues Voir X (Valeurs de référence). XII. Restrictions 1. L'utilisateur doit être entraîné et familiarisé avec les dosages ELISA et les procédures de test. 2. Les échantillons extrêmement hémolytiques ou lipémiques ne doivent pas être utilisés. Les échantillons contenant le facteur rhumatoïde, de fortes concentrations de bilirubine ou d'autres complexes immuns circulants peuvent donner des résultats inattendus. Il convient d'analyser ces échantillons avec une autre méthode. 3. Les échantillons présentant des valeurs hors de la plage doivent être analysés de nouveau en utilisant d'autres dilutions. 4. La découverte d'un taux diminué de MBL ne peut en aucun cas amener à établir un diagnostic définitif, mais doit plutôt être considérée comme l indication d un trouble du système immunitaire, requérant un examen diagnostic plus approfondi. 5. Le sérum de contrôle doit toujours être utilisé afin de vérifier la validité de la courbe d étalonnage. Lorsque le contrôle est hors plage, les résultats du dosage ne sont pas fiables. Le dosage doit être répété. 6. Les réactifs provenant de différents lots ne sont pas interchangeables. 7. Les résidus de réactifs (par exemple un volume mort) ne doivent pas être mélangés avec le contenu de flacons récemment ouverts. 8. Les bouchons et les flacons ne sont pas interchangeables. Les bouchons doivent être replacés sur les flacons correspondants. 9. Bien que le sérum étalon humain et que les sérums de contrôle aient été testés quant à la présence de marqueurs d'agents transmetteurs de maladies spécifiques, conformément aux directives en vigueur de l UE en matière de BPF, et reconnus non réactifs, tous les composants d'origine humaine doivent être considérés comme potentiellement infectieux. 10. Agents de conservation : thimérosa 0,001%. 11. Utiliser un nouveau film plastic pour chaque étape d incubation/fixation de l ELISA afin d éviter une contamination croisée. Ne pas utiliser de film aluminium. 12. Utiliser des embouts de pipettes à usage unique pour chaque transfert afin d éviter une contamination croisée. 13. À chaque fois que la trousse est utilisée, préparer des dilutions fraîches de sérum d étalonnage, de conjugué et de tampons. 14. Ne pas utiliser d autres réactifs et d autres microplaques que ceux fournis avec la trousse. 15. L azide de sodium inactive la peroxydase de raifort (HRP) ; ne pas utiliser de solutions contenant de l azide de sodium et ne pas ajouter d azide de sodium aux tampons fournis. Ne pas utiliser de thimérosal, car cela peut influencer négativement la qualité du développement enzymatique de la couleur. 16. L élimination des déchets doit être effectuée conformément aux réglementations en vigueur dans votre laboratoire. 17. Ne pas laisser les microcupules non recouvertes ou sèches pendant des périodes de temps prolongées entre les étapes d incubation. XIII. Références 1. Turner, M.W. (1996) Immunol Today 17:532-540 2. Gadjeva, M. Thiel, S. Jensenius, J.C. (2001) Curr Opin Immunol 13:74-78 3. Klabunde, J. et al (2002) Parasitol Res 88(2):113-117 4. Thielens, N.M. et al (2001) J Immunol 166:5068-5077 5. Garred, P. (1999) J Clin Invest 104:431-437 7.9% 4.8% 11.2% 5

ELISA Human Mannose Binding Lectin ELISA kit 1 375 μl COAT MANNAN STOCK 1:100 1 500 μl CAL 1 200 μl CONTROL 1 375 μl HRP MOU Ab HUM MBL CONJ 1:100 1 50 ml BUF DIL STOCK 1:5 1 60 ml BUF WASH STOCK 1:20 3 12x8 WELL 10 SEALS 6