Manuel du PAXgene Blood RNA Kit

Manuel du PAXgene Blood RNA Kit Version 2 Le système PAXgene Blood RNA est composé d un tube à prélèvement sanguin (PAXgene Blood RNA tube) et d une trousse de purification d acides nucléiques (PAXgene Blood RNA Kit). Le système a été développé pour le prélèvement, la conservation et le transport d échantillons sanguins, la stabilisation de l ARN intracellulaire dans un tube d échantillon fermé ainsi que l isolation et la purification de l ARN intracellulaire à partir de sang total pour la RT-PCR utilisée dans les tests de diagnostic moléculaire. Les caractéristiques de performance indiquées pour le système PAXgene Blood RNA s appliquent uniquement aux transcrits des gènes fos et IL-1b. L utilisateur est responsable d établir les caractéristiques de performance du système PAXgene Blood RNA relatives aux autres transcrits. Pour utilisation en diagnostic in vitro 762174 1051083FR PreAnalytiX GmbH, Feldbachstrasse, CH-8634 Hombrechtikon Produit par QIAGEN GmbH pour PreAnalytiX R1 1051083FR Avril 2008

Marques déposées : PAXgene, PreAnalytiX (PreAnalytiX GmbH) ; QIAGEN, QIAcube (QIAGEN Group) ; BD Vacutainer, BD Hemogard, Safety-Lok (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, États-Unis) ; Eppendorf (Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH). Les kits PAXgene Blood RNA ne sont pas disponibles dans tous les pays ; nous consulter. Accord de licence limitée En utilisant ce produit, l acheteur ou l utilisateur du kit PAXgene Blood RNA consent aux termes suivants : 1 Le kit PAXgene Blood RNA ne doit qu être utilisé conformément au Manuel du PAXgene Blood RNA Kit et uniquement avec les composants fournis à l intérieur du kit. PreAnalytiX n accorde aucune licence sous sa propriété intellectuelle pour utiliser ou intégrer les composants fournis dans ce kit avec tous autres composants non fournis dans ce kit, à l exception de ce qui est expliqué dans le Manuel du PAXgene Blood RNA Kit, ainsi que d autres protocoles disponibles sur le www.preanalytix.com. 2 Hormis les licences énoncées expressément, PreAnalytiX n offre aucune garantie indiquant que ce kit et/ou son(ses) utilisation(s) ne violent pas les droits de tiers. 3 Ce kit et ses composants sont sous licence pour une utilisation unique ; il ne peut pas être réutilisé, remis à neuf ou revendu. 4 PreAnalytiX rejette notamment toutes autres licences, expresses ou tacites, autres que celle énoncée expressément. 5 L acheteur et l utilisateur du kit consentent à ne pas prendre, ni autoriser quiconque à prendre, de quelconques mesures pouvant entraîner ou faciliter la réalisation d actes interdits par les termes précédents. PreAnalytiX peut faire appliquer des interdictions de cet Accord de licence limitée par tout tribunal et pourra recouvrir tous ses frais de recherche et de justice, y compris les frais d avocats, en cas d action en application de cet Accord de licence limitée ou de tous ses droits de propriété intellectuelle liés au kit et/ou à ses composants. Pour obtenir les termes de licence mis à jour, consulter le www.preanalytix.com. 2005 2008 PreAnalytiX GmbH, tous droits réservés. PreAnalytiX PreAnalytiX GmbH Feldbachstrasse CH 8634 Hombrechtikon Suisse Distributeurs PreAnalytiX Les produits PreAnalytiX sont fabriqués pour PreAnalytiX par QIAGEN ou BD et sont commercialisés par QIAGEN ou BD au nom de PreAnalytiX. Les produits ne peuvent pas être commandés directement chez PreAnalytiX GmbH. Veuillez vous référer à la dernière page pour connaître votre distributeur PreAnalytiX local.

Sommaire Explication des symboles 4 Contenu du kit 5 Conditions de conservation 6 Domaine d utilisation 6 Limites d utilisation 7 Contrôle qualité 7 Assistance technique 7 Informations de sécurité 7 Introduction 10 Le principe PAXgene et son application 10 Prélèvement et stabilisation de l échantillon 10 Purification manuelle des ARN 19 Purification automatisée des ARN 27 Matériel supplémentaire nécessaire 31 Note importante 32 Utilisation du QIAcube 32 Démarrage du QIAcube 32 Installation des protocoles sur le QIAcube 32 Chargement du QIAcube 34 Protocole : Purification manuelle d ARN total à partir de sang total humain prélevé dans les tubes PAXgene Blood RNA (BRT) 41 Protocole : Purification automatique d ARN total à partir de sang total humain prélevé dans les tubes PAXgene Blood RNA (BRT) 48 Résolution des principaux problèmes rencontrés (Troubleshooting) 54 Annexe A : Remarques générales sur la manipulation des ARN 56 Annexe B : Quantification et détermination de la qualité de l ARN total 57 Annexe C : Manipulation des tubes PAXgene Blood RNA 59 Pour commander 60 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008 3

Explication des symboles i <N> Kit contient des réactifs pour <N> tests Lire les informations dans le manuel A utiliser avant Ne pas réutiliser Dispositif destiné au diagnostic in vitro Référence du catalogue Numéro de lot Référence du matériel Composants Nombre Méthode de stérilisation utilisant l irradiation UV Unités Kunitz Limites de température Limite maximale de température Fabricant Note importante? EtOH Noter la date du jour sur le flacon après avoir ajouté l éthanol A l arrivée Ajouter Contient Reconstitué Désoxyribonucléase I Ethanol Thiocyanate de guanidine DNase exempte de RNase Mène à 4 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

Contenu du kit Kit PAXgene Blood RNA (50) Référence n 762174 Nombre de préparations 50 BR 1 Tampon de resuspension 20 ml BR 2 Tampon de fixation* 18 ml BR 3 Tampon de lavage 1* 45 ml BR 4 Tampon de lavage 2 (concentré) 11 ml BR5 Tampon d élution 6 ml RNFW PK PRC PT Eau exempte de RNase (flacon) Protéinase K (couvercle vert) Colonnes PAXgene RNA Spin (rouge) Tubes de traitement (2 ml) 2 x 125 ml 2 x 1,4 ml 5 x 10 6 x 50 Hemogard Bouchons secondaires BD Hemogard 50 MCT RNFD Tubes de microcentrifugation (1,5 ml) DNase l, exempte de RNase (lyophilisée) 3 x 50 1 x 10 1500 unités Kunitz Suite du tableau à la page suivante * N est pas compatible avec des produits désinfectants contenant de l eau de javel (hypochlorite de sodium, NaOCl). Contient un sel de guanidine. Veuillez vous référer à la page 7 pour les informations de sécurité. Le tampon de lavage 2 (BR4) est fourni comme concentré. Avant de l utiliser pour la première fois, ajouter 4 volumes d éthanol (96 à100%, pureté p.a.) dans le flacon comme indiqué sur l étiquette pour obtenir une solution prête à l emploi. Les unités Kunitz sont généralement utilisées pour mesurer l activité enzymatique de la DNase I, voir à la page 43 ou 49 pour leur définition. PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008 5

Kit PAXgene Blood RNA (50) Référence n 762174 Nombre de préparations 50 RDD Tampon de digestion de l ADN (couvercle blanc) 2 x 2 ml DRB PSC Tampon de resuspension de la DNase (tube, couvercle lilas) Colonnes PAXgene Shredder (lilas) Manuel du PAXgene Blood RNA Kit (Version 2) 2 ml 5 x 10 1 Conditions de conservation Les colonnes PAXgene RNA (PRC), les colonnes PAXgene Shredder (PSC), la protéinase K (PK) et les tampons (BR1, BR2, BR3, BR4 et BR5) peuvent être conservés au sec à la température indiquée sur l étiquette du kit. Le RNase-Free DNase Set, qui contient la DNase I (RNFD), le tampon de digestion d ADN (RDD) et le tampon de resuspension d ADN (DRB), est livré à température ambiante. Conserver tous les composants du RNase-Free DNase Set immédiatement à la température indiquée sur l étiquette. Domaine d utilisation Le kit PAXgene Blood RNA a été développé pour la purification d ARN intracellulaire à partir de sang total prélevé dans le tube PAXgene Blood RNA (BRT). Lorsque le kit est utilisé avec le tube PAXgene Blood RNA (BRT), le système permet d obtenir de l ARN intracellulaire purifié, qui peut être utilisé pour les tests de diagnostic moléculaire basés sur la RT PCR. Se référer à la PAXgene Blood RNA Tube Product Circular pour savoir comment utiliser les tubes PAXgene Blood RNA (BRT). Les caractéristiques de performance indiquées pour le système PAXgene Blood RNA s appliquent uniquement aux transcrits des gènes fos et IL-1b. L utilisateur est responsable d établir les caractéristiques de performance du système PAXgene Blood RNA relatives aux autres transcrits. 6 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

Limites d utilisation Le kit PAXgene Blood RNA a été développé pour la purification d ARN intracellulaire à partir de sang total humain (4,8 x 10 6 1,1 x 10 7 leucocytes/ml) pour des applications de diagnostic in vitro. Il n est pas destiné à la purification d ADN génomique ou d acides nucléiques viraux à partir de sang total humain. En raison du nombre limité de transcrits validés pour les spécifications de stabilisation (transcrits de gènes fos et IL1B), les caractéristiques de performance n ont pas été établies pour tous les transcrits. Il revient au personnel du laboratoire de comparer les données fournies par le fabricant avec les leurs et de décider si une validation est nécessaire pour d autres transcrits. Contrôle qualité En accord avec le Quality Management System QIAGEN certifié ISO, chaque lot du kit PAXgene Blood RNA a été testé conformément aux spécifications prédéterminées afin d assurer une qualité constante du produit. Assistance technique Avec son support technique, QIAGEN garantit à ses clients une consultation scientifique de qualité. Des scientifiques en biologie moléculaire expérimentés sont à votre disposition pour vous conseiller et vous aider à utiliser les produits PreAnalytiX. N hésitez pas à les contacter si vous avez des questions sur le kit PAXgene Blood RNA. Pour toute assistance technique ou pour plus d information, contactez le support technique QIAGEN (voir à la page 63). Informations de sécurité Lors de la manipulation de produits chimiques, toujours porter une blouse appropriée, des gants jetables et des lunettes de sécurité. Afin d éviter tout risque de contamination (par exemple avec les virus VIH ou Hépatite B) ou de blessure lorsque vous travaillez avec du matériel biologique et chimique, toujours porter une blouse appropriée, des gants jetables et des lunettes de sécurité. Pour plus d informations, veuillez consulter les fiches de données de sécurité (FDS). Elles sont disponibles sur notre site Internet www.preanalytix.com/rna_msds.asp en format PDF et vous pouvez les consulter ou les imprimer pour ce kit. Le tampon de fixation (BR2) et le tampon de lavage 1 (BR3) contiennent du thiocyanate de guanidine et peuvent former des composés hautement réactifs au contact de l eau de Javel. Au cas où du tampon de fixation (BR2) ou du tampon de lavage 1 (BR3) serait renversé, nettoyer avec un détergent de PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008 7

laboratoire et de l eau. Si le liquide renversé contient des agents à risque infectieux, nettoyer l endroit contaminé d abord avec un détergent et de l eau, puis avec de l hypochlorite de sodium à 1% (v/v). ATTENTION : NE JAMAIS verser de l eau de Javel ou des solutions acides directement dans les déchets liquides de préparation des ARN. La solution de stabilisation d ARN et le mélange sanguin du tube PAXgene Blood RNA (BRT) peuvent être désinfectés avec 1 volume d eau de Javel (hypochlorite de sodium 5%) pour 9 volumes de la solution de stabilisation d ARN ou du mélange sanguin. Les déchets de la préparation de l échantillon, tel que le surnageant des étapes de centrifugation lors de la purification d ARN, doivent être considérés comme potentiellement infectieux. Avant de les éliminer, les autoclaver ou les incinérer pour détruire tout matériel infectieux. Eliminer les déchets selon les normes de sécurité en vigueur dans le laboratoire. Les indications de risque et sécurité (R & S) de la classification CEE sont indiquées ci-dessous pour les composants du kit PAXgene Blood RNA. Se référer à la PAXgene Blood RNA Tube Product Circular pour connaître les informations de sécurité des tubes PAXgene Blood RNA (BRT). Tampon de fixation (BR2) Xn Contient du thiocyanate de guanidine : nocif (Xn). Indications de Risque et Sécurité* : R20/21/22-32, S13-26-36-46 Tampon de lavage 1 (BR3) Contient de l éthanol : inflammable. Indication de Risque* : R10 * R10 : Inflammable ; R20/2 1/22 : Nocif par inhalation, par contact avec la peau et par ingestion ; R32 : Au contact d un acide, dégage un gaz très toxique ; R36/37/38 : Irritant pour les yeux, les voies respiratoires et la peau ; R42/43 : Peut entraîner une sensibilisation par inhalation et par contact avec la peau ; S13 : Conserver à l écart des aliments et boissons, y compris ceux pour animaux ; S22 : Ne pas respirer la poussière ; S23 : Ne pas respirer les aérosols ; S24 : Eviter le contact avec la peau ; S26 : En cas de contact avec les yeux, laver immédiatement et abondamment avec de l eau et consulter un spécialiste ; S36 : Porter un vêtement de protection approprié ; S36/37 : Porter un vêtement de protection et des gants appropriés ; S46 : En cas d ingestion, consulter immédiatement un médecin et lui montrer l emballage ou l étiquette. 8 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

Protéinase K (PK) Xn Contient de la protéinase K (Tritirachium album) : agent sensibilisant, irritant. Indications de risque et sécurité* : R36/37/38-42/43 S23-24-26-36/37. DNase I Xn Contient de la désoxyribonucléase (bovine) : agent sensibilisant. Indications de risque et sécurité* : R42/43, S22-24-26-36/37 Service d informations 24h/24 En cas d urgence, contacter le Service d informations 24h/24 (en français, anglais et allemand) : Centre d information Anti-poison, Mayence, Allemagne Tél : +49-6131-19240 * R10 : Inflammable ; R20/2 1/22 : Nocif par inhalation, par contact avec la peau et par ingestion ; R32 : Au contact d un acide, dégage un gaz très toxique ; R36/37/38 : Irritant pour les yeux, les voies respiratoires et la peau ; R42/43 : Peut entraîner une sensibilisation par inhalation et par contact avec la peau ; S13 : Conserver à l écart des aliments et boissons, y compris ceux pour animaux ; S22 : Ne pas respirer la poussière ; S23 : Ne pas respirer les aérosols ; S24 : Eviter le contact avec la peau ; S26 : En cas de contact avec les yeux, laver immédiatement et abondamment avec de l eau et consulter un spécialiste ; S36 : Porter un vêtement de protection approprié ; S36/37 : Porter un vêtement de protection et des gants appropriés ; S46 : En cas d ingestion, consulter immédiatement un médecin et lui montrer l emballage ou l étiquette. PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008 9

Introduction Le prélèvement de sang total est la première étape de nombreux tests moléculaires analysant l ARN cellulaire. L instabilité du profil d ARN cellulaire in vitro constitue un grand problème. Des études faites par PreAnalytiX ont démontré que le nombre de copies de chaque espèce d ARNm dans le sang total peut varier d un facteur 1000 lors du stockage ou du transport à température ambiante*. Ceci est dû à une dégradation rapide de l ARN et à l induction de l expression de certains gènes après le prélèvement du sang. De telles modifications du profil d expression de l ARN rendent impossible l obtention de résultats fiables lors d études d expression de gènes. Une méthode permettant de stabiliser le profil d expression de l ARN pendant et après la phlébotomie est donc essentielle pour une analyse exacte de l expression de gènes dans le sang total humain. Le principe PAXgene et son application PreAnalytiX a développé un nouveau système qui permet de prélever, stabiliser, conserver et transporter des échantillons de sang total humain, en combinaison avec un protocole rapide et efficace pour l extraction d ARN intracellulaire. Le système requiert l utilisation des tubes PAXgene Blood RNA (BRT ; brevets US 6 602 718 et 6 617 170) pour le prélèvement du sang et la stabilisation d ARN ainsi que la trousse PAXgene Blood RNA pour la purification manuelle ou automatique d ARN. Les protocoles manuel et automatique fournissent des performances substantiellement équivalentes concernant la qualité et le rendement en ARN. Les données relatives aux performances des protocoles manuel (pages 19 26) et automatique (pages 27 30) figurent dans ce manuel. Prélèvement et stabilisation de l échantillon Les tubes PAXgene Blood RNA (BRT) contiennent un réactif spécifique basé sur une technologie brevetée de stabilisation d ARN. Ce réactif protège les molécules d ARN de la dégradation par les RNases et minimise les modifications ex vivo de l expression de gènes. Les tubes PAXgene Blood RNA (BRT) pour le prélèvement de sang total humain assurent la stabilisation d ARN cellulaire jusqu à 3 jours à une température comprise entre 18 et 25 C (Figures 1 et 2, pages 12 et 13) ou jusqu à 5 jours entre 2 et 8 C (Figures 3 et 4, pages 14 et 15). Des données récentes démontrent une stabilisation d ARN cellulaire d au moins 24 mois quand le sang stabilisé est conservé à 20 C ou 70 C. Pour plus d informations sur les études de stabilité à plus long terme, veuillez contacter le support technique QIAGEN. * Rainen, L. et al. (2002) Stabilization of mrna expression in whole blood samples. Clin. Chem. 48, 1883. 10 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

La durée de la stabilisation d ARN peut varier selon le type d ARN cellulaire et l application ultérieure utilisée. En raison du nombre limité de transcrits validés pour les spécifications de stabilisation (transcrits de gènes fos et IL1B), les caractéristiques de performance n ont pas été établies pour tous les transcrits. Il revient au personnel du laboratoire de comparer les données fournies par le fabricant avec les leurs et de décider si une validation est nécessaire pour d autres transcrits. PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008 11

Stabilité de l ARN dans les échantillons sanguins entre 18 et 25 C : FOS Conservation (jours) Conservation (jours) Figure 1 : Le sang a été prélevé en duplicats sur 10 donneurs et conservé entre 18 et 25 C le nombre de jours indiqué jusqu à la purification d ARN total. Le sang a été prélevé et conservé dans les tubes PAXgene Blood RNA (BRT). L ARN total a été purifié à l aide du kit PAXgene Blood RNA. Le sang a été extrait et conservé dans les tubes de prélèvement standard sur EDTA comme anticoagulant. L ARN total a été purifié par une méthode d extraction standard à base d une solution organique avec lavage de l ARN à base de membrane de silice. Les concentrations relatives de transcrits de FOS ont été déterminées par une RT-PCR duplex en temps réel avec l ARNr 18S comme standard interne. Les valeurs de tous les échantillons sont représentées dans un graphique, avec la moyenne des valeurs et leur déviation standard. La ligne pointillée représente l intervalle de précision du test (± 3x la précision totale du test de ± 2,34 C T ). 12 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

Stabilité de l ARN dans les échantillons sanguins entre 18 et 25 C : IL-1b Conservation (jours) Conservation (jours) Figure 2 : Le sang a été prélevé et l ARN purifié comme à la figure 1, après conservation à une température comprise entre 18 et 25 C. Les concentrations relatives de transcrits de IL-1b ont été déterminées par une RT-PCR duplex en temps réel avec de l ARNr 18S comme standard interne. Les valeurs de tous les échantillons sont représentées dans un graphique, avec la moyenne des valeurs et leur déviation standard. La ligne pointillée représente l intervalle de précision du test (± 3x la précision totale du test de ± 1,93 C T ). PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008 13

Stabilité de l ARN dans les échantillons sanguins entre 2 et 8 C : FOS Conservation (jours) Conservation (jours) Figure 3 : Le sang a été prélevé en duplicats sur 10 donneurs et conservé entre 2 et 8 C le nombre de jours indiqué jusqu à la purification de l ARN total. Le sang a été prélevé et conservé dans les tubes PAXgene Blood RNA (BRT). L ARN total a été purifié à l aide du kit PAXgene Blood RNA. Le sang a été extrait et conservé dans les tubes de prélèvement standard sur EDTA comme anticoagulant. L ARN total a été purifié par une méthode d extraction standard à base d une solution organique avec lavage de l ARN à base de membrane de silice. Les concentrations relatives de transcrits de fos ont été déterminées par une RT-PCR duplex en temps réel avec l ARNr 18S comme standard interne. Les valeurs de tous les échantillons sont représentées dans un graphique, avec la moyenne des valeurs et leur déviation standard. La ligne pointillée représente l intervalle de précision du test (± 3x la précision totale du test de ± 2,34 C T ). 14 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

Stabilité de l ARN dans les échantillons sanguins entre 2 et 8 C : IL-1b Conservation (jours) Conservation (jours) Figure 4 : Le sang a été prélevé et l ARN purifié comme à la figure 3, après conservation à une température comprise entre 2 et 8 C. Les concentrations relatives de transcrits de IL-1b ont été déterminées par une RT-PCR duplex en temps réel avec de l ARNr 18S comme standard interne. Les valeurs de tous les échantillons sont représentées dans un graphique, avec la moyenne des valeurs et leur déviation standard. La ligne pointillée représente l intervalle de précision du test (± 3x la précision totale du test de ± 1,93 C T ). PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008 15

Concentration et purification des ARN Le kit PAXgene Blood RNA a été développé pour la purification d ARN total à partir de 2,5 ml de sang total prélevé dans un tube PAXgene Blood RNA (BRT). La procédure est simple et peut être réalisée manuellement ou automatiquement (voir le diagramme). Dans les deux protocoles, la purification commence par une étape de centrifugation en culots d acides nucléiques dans le tube PAXgene Blood RNA (BRT). Le culot est lavé et remis en suspension, puis l ARN est purifié manuellement ou automatiquement. En principe, les deux protocoles suivent les mêmes étapes et utilisent les mêmes composants du kit. 16 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

Le procédé manuel PAXgene Blood RNA Sang Ajouter la protéinase K (PK) et le tampon de fixation (BR2) Incuber Transférer dans la colonne PAXgene Shredder (PSC) Mélanger Transférer le surnageant dans un tube de microcentrifugation Ajouter l éthanol Déposer sur la colonne PAXgene RNA (PRC) Laver le culot Fixer l ARN total Laver Reprendre Digérer l ADN Transférer dans un tube de microcentrifugat ion (MCT) Laver Eluer Chauffer à 65 C ARN prêt à l emploi PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008 17

Le procédé automatique PAXgene Blood RNA Sang Ajouter la protéinase K (PK) et le tampon de fixation (BR2) Incuber Mélanger Transférer dans la colonne PAXgene Shredder (PSC) Ajouter l éthanol à l effluent Laver le culot Transférer dans un tube de traitement (PT) et le charger dans l agitateur QIAcube Reprendre Déposer sur la colonne PAXgene RNA (PRC) Fixer l ARN total Laver Digérer l ADN Laver Complètement automatisé sur le QIAcube Transférer la colonne PAXgene RNA (PRC) Eluer Fermer les couvercles des tubes de microcentrifugation (MCT) et les transférer dans l agitateur QIAcube Chauffer à 95 C ARN prêt à l emploi 18 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

Purification manuelle des ARN En détail, le culot remis en suspension est incubé dans des tampons optimisés avec de la protéinase K (PK) pour digérer les protéines. Une étape de centrifugation additionnelle à travers la colonne PAXgene Shredder (PSC) est réalisée pour homogénéiser le lysat cellulaire et éliminer les restes cellulaires. Le surnageant est transféré dans un nouveau tube de microcentrifugation. De l éthanol est ajouté pour optimiser les conditions de fixation et le lysat est déposé sur une colonne PAXgene RNA (PRC). Au cours d une courte étape de centrifugation, l ARN est fixé à la membrane PAXgene à base de gel de silice, alors que les contaminants résiduels passent au travers. Les résidus de contaminants sont éliminés au cours de plusieurs étapes de lavage. La membrane est incubée avec de la DNase I (RNFD) entre la première et la deuxième étape de lavage pour supprimer toute trace d ADN fixé. Après les étapes de lavage, l ARN est élué dans le tampon d élution (BR5) et dénaturé à la chaleur. L ARN total purifié avec le système PAXgene Blood RNA est d une grande pureté. Avec le protocole manuel, le rapport A 260 /A 280 se situe entre 1,8 et 2,2 et une proportion d ADN génomique 1% (p/p) est présente dans 95% des échantillons. Ces valeurs ont été mesurées par une PCR quantitative en temps réel d une séquence du gène bêta-acétine. Lors d essais de RT- PCR, composés d éluat jusqu à 30% du volume de réaction, aucune inhibition du système n est apparue pour plus de 95% des échantillons. Avec le protocole manuel, la moyenne du temps de préparation d un échantillon (basé sur des données d un lot de 12) est d environ 90 minutes, dont 40 minutes de manipulation. Les rendements en ARN à partir de 2,5 ml de sang total humain d un donneur sain sont 3 μg pour plus de 95% des échantillons traités. Comme le rendement dépend fortement du donneur, les rendements individuels peuvent varier. Pour l analyse d un donneur en particulier, le système PAXgene Blood RNA permet d obtenir des rendements en ARN reproductibles et répétables (voir les figures 5 et 6 aux pages 20 et 21) et des résultats de RT-PCR également reproductibles et répétables (voir les figures 7 et 8 aux pages 24 et 25), de sorte que le système est très adapté aux analyses cliniques et diagnostiques. La reproductibilité et la répétabilité du système PAXgene Blood RNA sont représentées à la figure 5. L influence des différents lots du kit PAXgene Blood RNA ainsi que du personnel de laboratoire effectuant les tests sur la reproductibilité du rendement en ARN et des résultats de la RT- PCR en temps réel a été analysée au cours d études ultérieures. Un pool d échantillons sanguins a fait l objet de ces analyses, et non des échantillons prélevés individuellement dans des tubes PAXgene Blood RNA (BRT). Les résultats ne reflètent donc pas la répétabilité du système entier, qui prend en considération les différences résultat du type de prélèvement sanguin, mais la répétabilité de la préparation d ARN seulement (voir à la figure 6). PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008 19

Purification d ARN reproductible et répétable Rendements en ARN (μg/2,5 ml de sang) Donneur Moyennes du rendement en ARN (μg/2,5 ml de sang) Donneur Figure 5 : Des échantillons sanguins en quatre réplicats provenant de 14 donneurs ont été traités par 3 techniciens (A, B, C). Trois sets d équipement ont été utilisés et chaque technicien a utilisé le même équipement pour la préparation des échantillons. Sont présentées les moyennes et les déviations standard du rendement en ARN par réplicat du même donneur et traité par les différents techniciens. 12 répétitions de la purification d ARN provenant d échantillons de chacun des 14 donneurs ont été traités par 3 techniciens. Sont présentées les moyennes et les déviations standard du rendement en ARN par réplicat du même donneur et par tous les techniciens. Pour tous les échantillons d ARN, les ratios A 260 /A 280 étaient entre 1,8 et 2,2. 20 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

Répétabilité et reproductibilité du rendement en ARN d un pool d échantillons sanguins avec différents techniciens et différents lots du kit PAXgene Blood RNA Rendements en ARN (μg/2,5 ml de sang) Pool de donneurs CV du rendement en ARN (%) Donneur Figure 6 : Des échantillons de 30 donneurs ont été prélevés dans des tubes PAXgene Blood RNA (BRT) (12 tubes par donneur pour un total de 360 tubes). Le contenu de tous les tubes de trois donneurs a été poolé, puis répartis en 36 aliquotes. Ces pools de 36 échantillons de trois donneurs ont été préparés manuellement par trois techniciens. Chaque technicien a utilisé pour l extraction d ARN des kits PAXgene Blood RNA provenant de trois lots différents et effectué 4 réplicats (quadruplicats) à partir de chacun des 10 pools. Rendement d ARN et déviation standard pour chaque combinaison technicien-lot. 4 répétitions de préparation d échantillons sanguins de 10 pools de donneurs ont été traités par trois techniciens (utilisateur A, B et C) avec chacun des trois lots du kit (lot 1, 2 et 3). Sont présentées la moyenne du rendement en ARN (colonnes) et la déviation standard (barres d erreur) par réplicat d échantillon d un même pool de donneurs pour différents techniciens et différents lots de kit. Coefficient de variation (CV) du rendement de l ARN par pool de donneurs pour toutes les combinaisons technicien-lot (utilisateur A, B et C ; lot 1, 2 et 3) calculé à partir de la moyenne des rendements et des déviations standard indiquées à la figure 6A. PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008 21

Tableau 1A. Reproductibilité par lot de kit et pour chaque technicien Pool de donneurs 1 5,1 x 10 6 cellules/ml Pool de donneurs 6 6,5 x 10 6 cellules/ml Combinaison de données Rendement moyen (μg) SD (μg) CV (%) Rendement moyen (μg) SD (μg) CV (%) Lot 1, technicien A 8,03 0,42 5 9,55 0,99 10 Lot 1, technicien B 7,98 1,17 15 9,38 1,94 21 Lot 1, technicien C 7,87 0,45 6 10,71 0,65 6 Lot 2, technicien A 7,32 0,98 13 9,78 1,89 19 Lot 2, technicien B 6,09 1,04 17 9,82 2,83 29 Lot 2, technicien C 6,87 0,31 4 10,37 0,74 7 Lot 3, technicien A 7,04 0,90 13 8,96 0,68 8 Lot 3, technicien B 6,98 1,22 17 7,73 0,97 13 Lot 3, technicien C 8,78 0,89 10 10,59 1,94 18 Tableau 1B. Reproductibilité entre tous les lots du kit par technicien Pool de donneurs 1 5,1 x 10 6 cellules/ml Pool de donneurs 6 6,5 x 10 6 cellules/ml Combinaison de données Rendement moyen (μg) SD (μg) CV (%) Rendement moyen (μg) SD (μg) CV (%) Technicien A, tous les lots 7,46 0,85 11 9,43 1,22 13 Technicien B, tous les lots 7,02 1,31 19 8,98 2,09 23 Technicien C, tous les lots 7,84 0,98 13 10,56 1,15 11 Pool de donneurs 9 8,4 x 10 6 cellules/ml Rendement moyen (μg) SD (μg) CV (%) 7,52 0,41 6 8,82 1,72 19 10,14 1,46 14 6,92 0,27 4 7,20 0,71 10 9,14 1,52 17 8,18 0,76 9 6,41 0,88 14 10,78 0,56 5 Pool de donneurs 9 8,4 x 10 6 cellules/ml Rendement moyen (μg) SD (μg) CV (%) 7,54 0,72 10 7,48 1,50 20 10,02 1,34 13 Pool de donneurs 10 10,2 x 10 6 cellules/ml Rendement moyen (μg) SD (μg) CV (%) 7,96 0,49 6 8,90 0,76 9 10,22 1,29 13 7,63 1,23 16 7,00 0,56 8 11,56 1,21 10 7,85 0,82 10 8,88 2,17 24 10,88 0,37 3 Pool de donneurs 10 10,2 x 10 6 cellules/ml Rendement moyen (μg) 7,81 SD (μg) 0,82 CV (% ) 11 8,26 1,54 19 10,89 1,10 10 22 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

Tableau 1C. Reproductibilité entre tous les techniciens par lot du kit Pool de donneurs 1 5,1 x 10 6 cellules/ml Pool de donneurs 6 6,5 x 10 6 cellules/ml Pool de donneurs 9 8,4 x 10 6 cellules/ml Pool de donneurs 10 10,2 x 10 6 cellules/ml Combinaison de données Rendement moyen (μg) SD (μg) CV (%) Rendement moyen (μg) SD (μg) CV (%) Rendement moyen (μg) SD (μg) CV (%) Rendement moyen (μg) SD (μg) CV (%) Lot 1, tous les techniciens 7,96 0,69 9 9,88 1,34 14 8,83 1,63 19 9,02 1,27 14 Lot 2, tous les techniciens 6,76 0,93 14 9,99 1,84 18 7,75 1,36 18 8,73 2,31 26 Lot 3, tous les techniciens 7,60 1,27 17 9,09 1,71 19 8,46 1,99 24 9,20 1,80 20 Tableau 1D. Reproductibilité entre tous les lots du kit et tous les techniciens Pool de donneurs 1 5,1 x 10 6 cellules/ml Pool de donneurs 6 6,5 x 10 6 cellules/ml Pool de donneurs 9 8,4 x 10 6 cellules/ml Pool de donneurs 10 10,2 x 10 6 cellules/ml Combinaison de données Tous les lots et tous les techniciens Rendement moyen (μg) 7,44 SD (μg) 1,09 CV (%) 15 Rendement moyen (μg) 9,66 SD (μg) 1,65 CV (%) 17 Rendement moyen (μg) 8,35 SD (μg) 1,70 CV (%) 20 Rendement moyen (μg) 8,99 SD (μg) 1,80 CV (%) 20 Analyse détaillée de quatre pools de donneurs. Les pools ont été sélectionnés en fonction du nombre de leucocytes et établissent les valeurs minimale, moyenne et maximale de l intervalle normal du nombre de leucocytes (4,8 x 10 6 1,1 x 10 7 leucocytes/ml). Les nombres de leucocytes ont été déterminés par la valeur moyenne du nombre de leucocytes des trois donneurs de chaque pool. PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008 23

Reproductibilité de la RT-PCR entre les techniciens Technicien Technicien Figure 7 : L ARN purifié au cours de l analyse décrite à la figure 6 a été utilisé lors d essais de RT PCR en temps réel. Les concentrations relatives de transcrits FOS et IL1b ont été déterminées à l aide d une RT PCR duplex en temps réel en utilisant l ARNr 18S comme standard interne. Les valeurs de tous les échantillons sont représentées en fonction des valeurs de l utilisateur 1 (10 pools de donneurs x 3 lots de kit x 4 répétitions = 120 données par gène) incluant la valeur moyenne (trait rouge) et la déviation standard (barres noires). Les lignes pointillées représentent l intervalle de précision du test (± 3 fois la précision totale du test de ± 2,34 C T (FOS) et ± 1,93 C T (IL1b)). 24 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

Reproductibilité de la RT-PCR entre les lots du kit Lot Lot Figure 8 : L ARN purifié au cours de l analyse décrite à la figure 6 a été utilisé lors d essais de RT PCR en temps réel. Les concentrations relatives de transcrits FOS et IL1b ont été déterminées à l aide d une RT PCR duplex en temps réel en utilisant l ARNr 18S comme standard interne. Les valeurs de tous les échantillons sont représentées en fonction des valeurs de lot du kit 1 (10 pools de donneurs x 3 utilisateurs x 4 répétitions = 120 données par gène) incluant la valeur moyenne (trait rouge) et la déviation standard (barres noires). Les lignes pointillées représentent l intervalle de précision du test (± 3 fois la précision totale du test de ± 2,34 C T (FOS) et ± 1,93 C T (IL1b)). PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008 25

Tableau 2. Résumé des résultats de RT-PCR des figures 7 et 8 Système du test Comparaison des données Test FOS/ARNr 18S Test IL1b/ARNr 18S Moyenne ( C T ) ±SD ( C T ) Moyenne ( C T ) ±SD ( C T ) Reproductibilité par technicien et entre tous les lots Tous les techniciens, lot 1 Tous les techniciens, lot 2 Tous les techniciens, lot 3 0,00 0,00 0,00 0,00 0,03 0,48 0,07 0,66 0,21 0,52 0,11 0,71 Reproductibilité par lot et entre tous les techniciens Tous les lots, technicien A 0,00 0,00 0,00 0,00 Tous les lots, technicien B 0,46 0,44 0,06 0,69 Tous les lots, technicien C 0,31 0,60 0,15 0,71 Technicien : technicien de laboratoire, qui effectue l analyse Lot : numéro de lot du kit utilisé SD : déviation standard Sont rapportées les moyennes des valeurs C T (N = 120) et les déviations standard des données représentées aux figures 7 et 8. 26 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

Purification automatisée des ARN La procédure de préparation des échantillons avec le QIAcube est identique à la procédure manuelle, ce qui permet de continuer à utiliser le kit PAXgene Blood RNA pour purifier l ARN de haute qualité. Consulter le QIAcube User Manual et le www.qiagen.com/myqiacube pour de plus amples informations sur le QIAcube. Le protocole de purification automatique de l ARN se décompose en 2 étapes (ou protocoles), «PAXgene Blood RNA Part A» et «PAXgene Blood RNA Part B», avec une courte intervention manuelle entre les 2 parties. Le culot d acide nucléique centrifugé, lavé et remis en suspension (voir «Concentration et purification des ARN», page 16) est transféré du tube PAXgene Blood RNA (BRT) dans le tube de traitement (PT), puis placé sur l agitateur thermique de la table de travail du QIAcube. L opérateur sélectionne et lance le protocole «PAXgene Blood RNA Part A» à partir du menu. Le QIAcube réalise les étapes du protocole jusqu à l élution de l ARN dans le tampon d élution (BR5). Le technicien transfère les tubes de microcentrifugation (MCT) contenant l ARN purifié dans l agitateur thermique du QIAcube, puis sélectionne et lance le protocole «PAXgene Blood RNA Part B» à partir du menu ; la dénaturation par la chaleur est ensuite réalisée par le QIAcube. La moyenne du temps de préparation d un échantillon (basé sur des données d un lot de 12) est de 125 minutes, dont 20 minutes de manipulation. Les rendements en ARN à partir de 2,5 ml de sang total humain d un donneur sain sont 3 μg pour plus de 95% des échantillons traités. La figure 9 présente les rendements en ARN sur un total de 288 échantillons préparés selon le protocole automatique avec 3 lots du kit par 3 techniciens. Dans ces études, comme des échantillons de sang poolés ont été utilisés à la place de tubes PAXgene Blood RNA (BRT), les résultats ne reflètent pas le rendement en ARN attendu des échantillons individuels de chaque prélèvement sanguin. Comme le rendement dépend fortement du donneur, les rendements individuels peuvent varier (figure 9). PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008 27

Rendement en ARN Traitement automatique Rendements en ARN (μg/2,5 ml de sang) Figure 9 : Des échantillons de 48 donneurs ont été prélevés dans des tubes PAXgene Blood RNA (BRT) (6 tubes par donneur pour un total de 288 tubes). Le contenu de tous les tubes de six donneurs ont été poolés, puis répartis en 36 aliquotes. Ces pools de 36 échantillons de six donneurs ont été préparés par trois techniciens (A, B, C). Chaque technicien a utilisé pour l extraction automatique d ARN des kits PAXgene Blood RNA provenant de trois lots différents (1, 2, 3) et a effectué 4 réplicats (quadruplicats) à partir de chacun des 8 pools. Les rendements en ARN de chaque échantillon sont présentés pour chaque combinaison technicien-lot. Lors d essais de RT- PCR, composés d éluat jusqu à 30% du volume de réaction, aucune inhibition du système n est apparue pour plus de 95% des échantillons. Avec le protocole automatique, la contamination croisée entre les échantillons est indétectable par RT-PCR quantitative en temps réel des séquences du bêta-globine et des transcrits de FOS dans les échantillons ARN négatifs (eau) associés aux échantillons ARN positifs (sang total humain) dans le même cycle. L ARN purifié avec le système PAXgene Blood RNA et le protocole automatique est d une grande pureté, comme le montre le manque d inhibition de la RT-PCR (voir ci-dessus) et le rapport A 260 /A 280 situé entre 1,8 et 2,2. Une proportion d ADN génomique 1% (p/p) est présente dans 95% des échantillons. Ces valeurs ont été mesurées par une PCR quantitative en temps réel d une séquence du gène bêta-acétine. Les figures 10 et 11 montrent le rapport A 260 /A 280, ainsi que l ADN génomique relatif de 288 échantillons au total, préparés à l aide du protocole automatique par trois techniciens avec chacun des trois lots du kit. 28 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

Pureté de l ARN (rapport A 260 /A 280 ) Traitement automatique Figure 10 : L ARN a été purifié par 3 techniciens (A, B, C), à l aide de 3 lots différents (1, 2, 3) du kit PAXgene Blood RNA dans l expérience présentée en figure 9. Le rapport A 260 /A 280 de chaque échantillon est illustré pour chaque combinaison technicien-lot. Pureté de l ARN (contamination de l ADN génomique en %) Traitement automatique ADN génomique (p/p) (%) Pureté de l AR N Figure 11 : L ARN a été purifié par 3 techniciens (A, B, C), à l aide de 3 lots différents (1, 2, 3) du kit PAXgene Blood RNA dans l expérience présentée en figure 9. Les quantités d ADN génomique (p/p) de chaque échantillon sont illustrées pour chaque combinaison technicien-lot. PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008 29

Le protocole automatique de purification de l ARN avec le système PAXgene Blood RNA fournit des résultats de RT-PCR reproductibles et répétables, comme illustré en figure 2, de sorte que le système est très adapté aux analyses cliniques et diagnostiques. Reproductibilité de la RT-PRC entre les protocoles automatique et manuel Figure 12 : L ARN a été purifié par 3 techniciens (A, B, C) et 3 lots différents (1, 2, 3) du kit PAXgene Blood RNA avec le protocole automatique dans l expérience présentée en figure 9. En parallèle, l ARN a été purifié à partir des tubes de réplicats correspondants avec le protocole manuel. Les concentrations relatives de transcrits de FOS et de IL1b ont été déterminées à l aide d une RT PCR duplex en temps réel en utilisant l ARNr 18S comme standard interne. Les différences potentielles de taux de transcrits entre l ARN préparé à partir d échantillons sanguins associés à l aide des deux protocoles d extraction (automatique et manuel) ont été calculées par la méthode C T. Chaque valeur C T de toutes les associations d échantillons (4 replicats x 8 pools de donneurs x 3 lots du kit x 3 techniciens = 288 associations pour chaque gène) est tracée sous forme de points isolés. Les moyennes (gros points) et les déviations standard (barres noires) sont affichées pour chaque échantillon. Les lignes pointillées représentent l intervalle de précision du test (± 3 fois la précision totale du test de ± 2,34 C T (FOS) et ± 1,93 C T (IL1b)). 30 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

Matériel supplémentaire nécessaire Lors de la manipulation de produits chimiques, toujours porter une blouse appropriée, des gants jetables et des lunettes de sécurité. Pour plus d informations, consulter les fiches de données de sécurité (FDS) disponibles chez le fabricant du produit. Pour tous les protocoles Tubes PAXgene Blood RNA (BRT, réf. 7642165) Ethanol (96 à 100%, degré de pureté p.a.) Pipettes* (10 μl à 4 ml) Cônes de pipette stériles, exempts de RNase, avec filtre aérosol contre la contamination Cylindre gradué Centrifugeuse* à vitesse variable entre 3000 et 5000 x g équipée d un rotor à angle variable avec des godets oscillants adaptés aux tubes PAXgene Blood RNA (BRT). Mixeur Vortex* Glace broyée Stylo indélébile pour l étiquetage Pour le protocole manuel Microcentrifugeuse* à vitesse variable entre 1000 et 8000 x g avec rotor pour tubes de microcentrifugation de 2 ml Un incubateur agitateur*, pour incubation à 55 C et 65 C à vitesse variable entre 400 et 1400 tr/min (Eppendorf Thermomixer Compact ou équivalent) Pour le protocole automatisé QIAcube* (QIAGEN, réf. 9001292 [110 V], réf. 9001293 [230 V]) Consommables du QIAcube Filtres, 1000 μl (1024) (QIAGEN, réf. 990352) Flacons de réactif, 30 ml (6) (QIAGEN, réf. 990393) Adaptateurs pour rotor (10 x 24) (QIAGEN, réf. 990394) * S assurer que tous les instruments sont vérifiés et calibrés régulièrement selon les recommandations du fabricant. S assurer de bien lire les indications «Remarques générales sur la préparation d ARN» (voir l annexe A à la page 56). Pour mesurer la quantité d éthanol à ajouter au concentré de tampon BR4. PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008 31

Accessoires du QIAcube Portoir pour flacons de réactif (QIAGEN, réf. 990390) Support d adaptateur pour rotor (QIAGEN, réf. 990392) Ciseaux Note importante Utilisation du QIAcube S assurer de bien connaître le fonctionnement du QIAcube. Lire le QIAcube User Manual et toutes autres informations fournies avec le QIAcube, en prêtant notamment attention aux informations de sécurité, avant de lancer les protocoles PAXgene Blood RNA automatiques. Démarrage du QIAcube Fermer la porte du QIAcube et le mettre sous tension à l aide de l interrupteur Marche/Arrêt (voir la figure 13). Un bip retentit et l écran de démarrage apparaît. L appareil réalise des tests d initialisation automatiquement. Installation des protocoles sur le QIAcube Commencer par installer un protocole avant d exécuter le premier cycle de préparation d ARN sur le QIAcube. Installer les protocoles «PAXgene Blood RNA Part A» et «PAXgene Blood RNA Part B». Les protocoles sont disponibles sur le www.qiagen.com/myqiacube. Les télécharger sur la clé USB fournie avec le QIAcube et les transférer sur le QIAcube via le port USB. Le port USB, situé derrière l écran de protection (voir la figure 13), permet de connecter la clé USB (fournie) au QIAcube. Les fichiers de données (par ex. fichiers journaux ou fichiers de rapport) peuvent également être transférés via le port USB du QIAcube vers la clé USB. Le port USB ne doit être utilisé qu avec la clé USB fournie par QIAGEN. Ne pas connecter d autres périphériques à ce port. Ne pas retirer la clé USB pendant le téléchargement de protocoles, le transfert de fichiers de données ou l exécution d un cycle de protocole. Egalement inclus dans le Starter Pack, QIAcube (QIAGEN, réf. 990395). 32 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

Vue de face du QIAcube Figure 13 Ecran tactile Porte Port série RS232 à l arrière de l écran de protection (seuls les spécialistes de maintenance des appareils QIAGEN peuvent l utiliser) Port USB à l arrière de l écran de protection Interrupteur Marche/Arrêt Poubelle PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008 33

Chargement du QIAcube Pour économiser du temps, le chargement peut être réalisé pendant une étape de centrifugation de 10 minutes ou les deux (étapes 3 et 5) dans «Protocol: Automated Purification of Total RNA from Human Whole Blood Collected into PAXgene Blood RNA Tubes (BRT)», page 48. Flacons de réactif Remplir soigneusement 4 flacons avec les réactifs QIAcube répertoriés dans le tableau 3 (remplir les flacons jusqu au niveau de l indicateur). Etiqueter clairement les flacons et les couvercles avec les noms des tampons et les placer où il convient sur le portoir pour flacons de réactif (voir les figures 14 et 15). Avant chaque cycle sur le QIAcube, s assurer que les flacons de réactif sont remplis jusqu au niveau des indicateurs (les volumes restant dans les flacons de tampon du kit d origine doivent servir à remplir les flacons de réactif). Placer le portoir pour réactifs et les flacons remplis sur la table de travail du QIAcube, comme illustré (figures 14 et 15). Veiller à retirer les couvercles des flacons avant de les placer sur la table de travail. Les volumes de tampon fournis dans le kit PAXgene Blood RNA (50) sont suffisants pour un maximum de 7 préparations d ARN sur le QIAcube. Eviter de réaliser plusieurs cycles avec peu d échantillon afin de laisser des volumes de tampons suffisants pour traiter 50 échantillons complets. Tableau 3. Positions sur le portoir pour flacons de réactif Position Réactif 1 Tampon de fixation (BR2) 2 Ethanol à 96-100% 3 Tampon de lavage 1 (BR3) 4 Tampon de lavage 2 (BR4)* 5 (laisser vide) 6 (laisser vide) * Le tampon de lavage 2 (BR4) est fourni comme concentré. Avant de l utiliser pour la première fois, ajouter 4 volumes d éthanol (96 à100%, pureté p.a.) dans le flacon comme indiqué sur l étiquette pour obtenir une solution prête à l emploi. 34 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

Chargement du portoir pour flacons de réactif Position 1 Tampon de fixation (BR2) Position 2 Ethanol à 96-100% Bande d étiquetage Position 3 Tampon de lavage 1 (BR3) Position 4 Tampon de lavage 2 (BR4) Bande d étiquetage Position 5 Position 6 Vide Vide Figure 14 : Schéma des positions et du contenu des flacons sur le portoir pour flacons de réactif. Chargement du portoir dans le QIAcube. PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008 35

Vue de l intérieur du QIAcube Figure 15 Couvercle de la centrifugeuse Centrifugeuse Agitateur Portoir pour flacons de réactif Espaces pour tubes de microcentrifugation Portoirs pour cônes Espaces d élimination pour cônes et colonnes Bras robotisé Capteur de cônes 36 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

Colonnes de centrifugation (PRC, PSC), tubes de microcentrifugation (MCT) et matériau plastique du QIAcube Placer 2 portoirs pour cônes remplis de filtres de 1000 μl dans le QIAcube (voir la figure 15). Remplir à nouveau les portoirs avec des cônes lorsque cela s avère nécessaire. Utiliser uniquement des filtres de 1000 μl destinés à être utilisés avec le QIAcube. Etiqueter les adaptateurs pour rotor et les tubes de microcentrifugation (MCT) pour chaque échantillon à l aide d un stylo indélébile. Ouvrir les colonnes PAXgene Shredder (PSC) à utiliser et couper les couvercles à l aide de ciseaux (voir la figure 16). Pour que la pince robotisée du QIAcube fonctionne correctement, retirer (couper) les couvercles et toutes les parties en plastique la reliant aux colonnes PAXgene Shredder (PSC ; voir la figure 16). Dans le cas contraire, la pince robotisée ne peut pas saisir les colonnes (PSC, PRC) correctement. Charger la colonne PAXgene RNA (PRC), la colonne PAXgene Shredder (PSC, sans couvercle) et le tube de microcentrifugation étiqueté (MCT) dans les positions appropriées dans chaque adaptateur pour rotor étiqueté, comme illustré dans le tableau 4 et la figure 17 (page 38). S assurer que les couvercles de la colonne (PRC) et du tube de microcentrifugation (MCT) sont enfoncés sur toute leur longueur au fond des espaces, sur le bord de l adaptateur pour rotor ; dans le cas contraire, ils seront coupés pendant la centrifugation. Chargement d une colonne PAXgene Shredder (PSC) Couvercle de colonne (PSC) retiré correctement Couvercle de colonne (PSC) retiré incorrectement ; une partie est restée Figure 16 : La colonne PAXgene Shredder (PSC) est chargée dans la position du milieu. Couper le couvercle avant de charger la colonne (PSC). PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008 37

Tableau 4. Matériel de laboratoire dans l adaptateur pour rotor Position Matériel de laboratoire Position du couvercle 1 Colonne PAXgene RNA Spin (rouge, PRC) L1 2 Colonne PAXgene Shredder (lilas, PSC) (couper le couvercle avant de la placer dans l adaptateur pour rotor) 3 Tube de microcentrifugation (MCT)* L3 * Utiliser les tubes de microcentrifugation (1,5 ml, MCT) compris dans le kit PAXgene Blood RNA. Figure 17 : L adaptateur pour rotor possède trois positions de tube (1 à 3) et trois positions de couvercles (L1 à L3). Chargement de la centrifugeuse Charger les adaptateurs pour rotor montés dans les godets de la centrifugeuse, comme illustré dans la figure 18. Si moins de 12 échantillons sont traités, veiller à charger le rotor de la centrifugeuse de manière équilibrée radialement (voir la figure 19). Tous les godets de la centrifugeuse doivent être montés avant de lancer un cycle de protocole, même s il y a moins de 12 échantillons à traiter. Il est impossible de traiter un seul échantillon ou 11 échantillons. Chargement de la centrifugeuse Figure 18 : Charger les adaptateurs pour rotor montés dans les godets de la centrifugeuse. 38 PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008

Chargement de la centrifugeuse et de l agitateur 2 échantillons 3 échantillons 4 échantillons 5 échantillons 6 échantillons 7 échantillons 8 échantillons 9 échantillons 10 échantillons Figure 19 : Les positions de la centrifugeuse et de l agitateur sont illustrées pour le traitement de deux (2) à dix (10) échantillons. Il est impossible de traiter 1 ou 11 échantillons. PAXgene Blood RNA Kit Handbook 04/2008 39