Centre de Référence sur l Huître. Bilan 2012

Centre de Référence sur l Huître Bilan 2012

Sommaire Présentation du Centre de Référence sur l Huître Programme GIGAVIR FRE BioMEA Université de caen Basse Normandie Cadre général 1. Etude transcriptomique des phénomènes de surmortalités sur estran 2. Compréhension du phénomène infectieux en milieu contrôlé 3. Perspectives et projets 2013 Programme ASIL IFREMER LER-N Port en Bessin Cadre général Phase 1: Peut on évaluer l efficacité des méthodes de diagnostic du statut sanitaire des lots (lors de leur réception)? Phase 2: Peut on définir les périodes au cours desquelles s effectue la contagion? Phase 3: Peut on moduler la résistance des lots, lors de leur réintroduction sur les zones d élevage traditionnelles, par les pratiques zootechniques? Bilan général du programme ASIL Programme Portbail Laboratoire Départemental Frank Duncombe Objectifs Protocoles Résultats et discussion Bilan Bilan général Programme «Etudes des mortalités en 1ère et 2ème année pendant et après isolement en bassin ou en site sanctuaire. CFPPA Coutances Cadre général Etat des lieux Objectifs Protocole Résultat et discussion Bilan de l étude Bilan général des opérations d isolement Perspectives Observatoire d agents infectieux de l huître sur les cheptels ostréicoles basnormands (2012) Comité Régional de la Conchyliculture Normandie Mer du Nord Contexte matériels et méthodes Résultats et discussion Conclusion

Programme GIGAVIR Aude Jouaux (IGR), Christophe Lelong (MCU-HDR), Michel Mathieu (Pr) FRE3484 BioMEA CNRS INEE, Université de Caen - Basse Normandie Partenaires : SMEL : Jean Louis Blin CFPPA : Michel Le Guillois LFD : Maryline Houssin

Cadre général : Le programme GIGAVIR repose sur une collaboration entre l unité de recherche Université de Caen Basse Normandie - CNRS INEE FRE3484 BioMEA «Biologie des Mollusques marines et Ecosystèmes Associés» (ex UMR PE2M) dirigée par le Pr Pascal Sourdaine et le Laboratoire Frank Duncombe (LFD). L objectif est la mise en place d un axe de recherche sur les surmortalités du naissain dont les travaux s inscrivent dans le cadre du Centre de Référence sur l Huître (CRH). Depuis Août 2012, ce programme est entré dans une seconde phase (GIGAVIR2), financé à 50% par le CRBN et à 25% par les Conseils Généraux du Calvados et de la Manche. Face aux surmortalités du naissain, la nécessité de mettre en place une démarche de sélection génétique visant à obtenir des souches résistantes a été considérée comme prioritaire. Deux projets menés par des écloseries privées sont en cours et ont pour objectif la production de naissain triploïde offrant des capacités de survie améliorée. Un autre programme de sélection (SCORE) mené par le CNC suite à un appel à projet lancé par le Ministère de l Agriculture en juin 2011 vise en complément à permettre la reconstitution de bancs de géniteurs pour le captage naturel avec des souches présentant également ce caractère de résistance à l OsHV-1. En parallèle à cette démarche, il est impératif d apporter aux professionnels des données objectives pour conduire à une réflexion sur les pratiques culturales. En effet, les surmortalités actuelles liées au virus OsHV-1, la présence généralisée de Vibrio, l émergence de nouvelles pathologies sont des signes évidents d une grande fragilité des cheptels en élevage. La mise à disposition de souches résistantes à l OsHV-1 sans remise en cause des pratiques actuelles conduira inéluctablement à de nouveaux problèmes dans les années à venir. L efficacité de ces plans de sélection nécessite de comprendre les relations entre les hôtes et leur pathogène mais aussi de déterminer ce qui distingue les huîtres résistantes des huîtres sensibles. Ainsi les orientations principales du programme GIGAVIR sont i) de fournir des outils pour valider les pratiques culturales ou compléter des procédures de qualification du naissain et ii) d identifier des marqueurs génétiques pour une «sélection assistée».

1. ETUDE TRANSCRIPTOMIQUE DES PHENOMENES DE SURMORTALITES SUR ESTRAN Les événements de surmortalités virales du naissain et des juvéniles (1 ère et 2 nde années d élevage respectivement) présentent une même dynamique chaque année. Observés en premier en Corse à l Étang de Diane, ils progressent vers l Étang de Thau, puis à Arcachon, et remontent la côte Atlantique pour atteindre en dernier celle de la Manche. Cette progression et les différents relevés, semblent lier ces surmortalités à l élévation de la température de l eau au-dessus de 19 C. Pour permettre d enrayer ce phénomène, il est primordial de déterminer l origine de ce phénomène infectieux et les modes de contamination des huîtres par le virus, pour prendre à terme des mesures zoosanitaires et orienter les professionnels vers des pratiques culturales adaptées. a- Rappel L an dernier du naissain qualifié de naïf après une analyse en individuel sur 120 naissains (prévalence de 2.5% d OsHV-1 à des niveaux inférieurs à 1000UG/50mg de chaire) et un comportement sans mortalités ni montée de charge virale en challenge thermique (test biologique consistant à placer des animaux dans un contexte favorable d expression de la mortalité). Une partie de cet échantillon était restée maintenue en bassin isolé à Blainville sur mer à la CABANOR du CFPPA, une autre avait été placée sur la concession expérimentale de Cricqueville en Bessin (14) et enfin un dernier lot a été mis en élevage à Blainville sur mer sur la zone des parcs ostréicoles. La mesure de la charge virale suivie régulièrement au cours de l expérimentation montrait de fortes charges virales uniquement en site ostréicole lors des périodes de mortalités. Des surmortalités n ont été observées que sur le lot élevé en zone conchylicole (figure 1). Figure 1 : Schéma représentant l organisation de l expérimentation menée pour obtenir des animaux dans des contextes de contamination tranchés. Le même lot d individus qualifié de naïf a été suivi dans différents scénari soit en bassin à terre ou en zone sanctuaire soit en zone ostréicole. Afin d appréhender les relations entre l huître Crassostrea gigas et le virus OsHV-1, nous avons privilégié une approche au niveau génomique. En effet, les progrès récents obtenus dans le cadre du séquençage du génome de l huître nous ouvrent l accès aux techniques de microarrays ou puces à ADN. Cette technique permet la comparaison du niveau d expression de tout le génome pour des animaux différents (ex. : adultes vs naissain, 2n vs 3n) ou soumis à des traitements différents (ex. : présence vs absence de virus, ). Nous disposons aujourd hui de 31 918 séquences uniques (EST) disposées sur une lame de verre et qui couvrent environ 80% du génome de l huître. Le plateau PROTEOGEN de la SF ICORE dispose des équipements nécessaires pour l analyse des puces à ADN. Les microarrays ont d ores et déjà été initiées au laboratoire pour explorer la spécificité de chaque tissu de l huître, mais aussi les caractéristiques de chaque stade de gamétogenèse des diploïdes (Dheilly et al., 2011 et 2012). Lors de la vague de surmortalité rencontrée en 2011, nous avons pu effectuer un échantillonnage d huîtres sur estran afin de comparer les niveaux d expression des gènes de l huître dans deux situations contrastées : exposées ou non exposées à une surmortalité.

Les animaux étudiés par puce à ADN sont issus d un même lot de naissain «naïf» provenant d écloserie élevé soit sur parc ostréicole exposé à la contamination virale à Blainville sur mer (47% de mortalités) soit dans un site «sanctuaire», à Cricqueville en Bessin ou en bassin à la Cabanor (4,5% de mortalités). Les ARN de ces animaux ont été extraits puis marqués à la cyanine 3 avant d être hybridés sur lames de microarray. Après scannage des lames, plusieurs analyses ont été réalisées pour discriminer des gènes différentiellement exprimés chez les animaux exposés ou non à des surmortalités. b- Identification de gènes régulés lors d un épisode infectieux Ces travaux nous avaient permis d identifier des gènes régulés lors d un épisode infectieux. Brièvement, la comparaison entre les animaux infectés et sains a permis d obtenir à partir d un test ANOVA composé de 2 groupes d animaux infectés et 2 groupes d animaux sains, une liste de 249 séquences différentiellement exprimés (figure 2). Tout d abord sur la figure 2, on remarque que les animaux sains (CAB et CRIC) et les animaux infectés (BL et i) se regroupent entre eux. Ces 249 séquences s organisent entre elles et sont surexprimées en vert ou bien sous exprimées en rouge chez le naissain d huître infectés comparés au naissain sain. Il y aussi un petit nombre de séquences qui évoluent en fonction du milieu d élevage des animaux comme on peut le voir dans le premier groupe de 7 séquences sur la figure 2. Figure 2 : Résultats obtenus lors de l ANOVA à 4 groupes présentant les gènes différentiellement exprimés entre le naissain contaminé et le naissain non contaminé. La partie gauche représente l expression selon un dégradé de couleur vert pour sous exprimé et rouge pour surexprimé. Les graphiques représentent le graduel d expression de séquences identifiés dans les différents cas de figures. Seulement 51% des 249 séquences étaient annotées mais ces annotations ont été complétées à partir des données récentes du génome de l huître (Zhang et al. 2012). Cette première liste a donc était

réduite à une liste de 128 gènes. Les fonctions de ces gènes ont été recherchées par gène ontologie et ont permis de classer ces gènes entre eux à partir de cette analyse (Figure 3). La majeure partie des gènes identifiés correspondent à des gènes dérégulés de la cellule hôte, 68% des gènes. Vingt-six pourcents correspondent à des moyens de défense contre les pathogènes et certains sont directement impliqués dans des réponses aux virus. Enfin certains gènes sont des éléments appartenant au système nerveux et pourraient représentés un moyen de persistance comme c est le cas chez d autres herpès-virus. Figure 3 : Regroupement des gènes identifiés par fonction à partir d une analyse par gène ontologie. L annotation de ces gènes et la comparaison de ces deux listes nous ont conduit à la sélection d une liste restreinte de gènes d intérêt potentiels. Sur les 128 gènes, certains sont malheureusement de fonction inconnue et un tri a donc été réalisé afin de choisir les gènes les plus pertinents c est à dire ceux déjà connus pour être impliqués dans des réponses à des pathogènes. La validation de ces résultats de microarray a été réalisée par qpcr sur des marqueurs potentiels associés à l infection virale. Un scénario hypothétique a pu être déterminé avec 4 étapes clés : la reconnaissance et l entrée du virus dans la cellule hôte, le cycle de vie du virus, le détournement de la machinerie cellulaire de l hôte et les effets sur la cellule hôte (figure 4). Les gènes figurant dans la liste des 128 gènes sont encore en cours d étude pour préciser leur implication dans les différentes phases de l infection virale afin d affiner le scénario de l épisode infectieux. Figure 4 : Schéma hypothétique du mécanisme d infection virale associant les premiers marqueurs géniques identifiés dans ces travaux.

La première phase concerne l entrée du virus dans la cellule hôte, certains gènes seraient impliqués dans cette étape. Par exemple, RAC1 est un inhibiteur de l entrée du virus dans les cellules, dans notre cas ce gène est inhibé et favoriserait l entrée du virus dans les cellules (Petermann et al. 2009). Certains gènes sont impliqués dans la régulation du cycle de vie du virus comme le gène RABAC qui permet l inhibition du cycle de vie des herpes virus (Compton et Behrend, 2006). Le gène PRDM5 et ses miarn sont impliqués dans la latence des herpès virus et constitue un point clé de la réplication virale et de l entrée du virus en phase lytique (Roizman et al. 2011et Roizman 2011). La sous-expression de ces 2 gènes suggère un changement en faveur de la phase lytique du cycle de vie du virus. Lors de l infection virale un détournement de la machinerie cellulaire de l hôte s opère, les 3 gènes nommés DRAP1, APBA2, Nup54 sont sous-exprimés chez les animaux infectés et traduisent une baisse des activités de la cellule hôte (Kahle et al. 2009 ; Okamoto et Sudhof, 1997). Très récemment des travaux ont montré que Nup54 est également impliqué dans le transport des ARN viraux (Nakano et Watanabe, 2012). Au niveau des effets sur la cellule hôte, le cycle cellulaire et l apoptose semblent affectés les 3 gènes DRG2, GroupL1 and Cbx1 montrent que les proliférations et la croissance cellulaire sont réduites et que l apoptose diminue chez les naissains infectés (Ishikawa et al. 2005 ; Hohfled et Jentsch, 1997 ; Melcher et al. 2000). Ce scénario doit intégrer les autres gènes identifiés, ainsi une analyse exhaustive de la liste des 128 gènes a été d ores et déjà initiée pour essayer de compléter ce schéma. Des expériences en milieu contrôlé permettront de cibler les différentes étapes et d établir la cinétique de leur expression lors de l infection virale. c- Bilan Les gènes identifiés comme marqueurs potentiels d une infection virale par l herpès virus montrent que les animaux infectés connaissent une baisse d activité dans de grandes fonctions biologiques se traduisant par un état physiologique affaibli. Chez les animaux infectés, l entrée dans les cellules et le passage du virus en phase lytique de son cycle de vie sont facilités. Cette étude constitue la première étape afin de comprendre la réponse physiologique de l huître au pathogène en milieu naturel, un article scientifique sur ce sujet et sera prochainement soumis. Jouaux Aude, Lafont Maxime, Blin Jean-Louis, Houssin Maryline, Mathieu Michel, Lelong Christophe. Physiological change under OsHV-1 contamination in Pacific oyster Crassostrea gigas through massive mortality events on fields. In prep d- Perspectives A ce stade, il est nécessaire d analyser le phénomène infectieux en pouvant suivre sa cinétique pour comprendre la mise en place de cette réponse physiologique et les étapes clés de la contamination comme les voies d entrée du virus dans l huître. Ces travaux sont aussi indispensables afin de déterminer la fin d un phénomène infectieux et le statut des animaux survivants. D autres techniques ont également été appliquées dans le cadre d une collaboration avec des chercheurs internationaux et à l acquisition récente du séquenceur NGS sur la plateforme SESAME CLC Baclesse de la SFR ICORE (voir partie suivante). Très peu de données concernent les voies d entrée du virus dans son hôte et sa localisation préférentielle dans les tissus de l hôte. La localisation du virus dans les différents tissus de l hôte sera entreprise au cours d un événement infectieux en milieu contrôlé à différents temps post inoculation. Ces travaux seront entrepris dans le cadre du stage de master 2 de M Maxime LAFONT. 2. COMPREHENSION DU PHENOMENE INFECTIEUX EN MILIEU CONTROLE Les infections expérimentales nécessitent de maintenir des animaux dans de bonnes conditions physiologiques dans une structure de type laboratoire dédié à ce type d expérimentation. Cette première étape a été réalisée dans les locaux de l Université mis à disposition pour le CRH. a- Mise en place d un système d élevage d huître creuse pour la pathologie expérimentale

Ces expérimentations ont fait l objet d une étude de master 1 intitulé «Mise en place d un système d élevage d huîtres creuses Crassostrea gigas pour la pathologie expérimentale». Une stagiaire de master 1 ère année (M1) Mme Mélanie Lepoittevin a été accueillie durant son stage afin de valider le fonctionnement de cette structure et d optimiser les conditions d élevage d huître en fonction des paramètres physicochimiques et trophiques. De plus, des infections expérimentales ont été conduites en parallèle afin de maîtriser cette étape de reproduction d un phénomène de surmortalité en milieu contrôlé en routine. Les résultats de cette étude ont permis de valider la structure pour le maintien des huîtres mais aussi des infections expérimentales dans de bonnes conditions physiologiques. Ces travaux sont les préliminaires nécessaires à la création d un dispositif de pathologie expérimentale dans le CRH, ainsi des collaborations entre les membres du CRH ou avec d autres chercheurs comportant des expérimentations de ce type pourront être effectuées au sein de cette structure. Ce dispositif d infrastructure d élevage est nécessaire aux travaux de pathologie mais aussi pour ceux de génomique puisqu il n existe aucune structure équivalente en région pour mener ce type d expérimentations. Ces expérimentations en milieu contrôlé sont la clé pour comprendre un épisode infectieux puisque l on maîtrise le phénomène du début à la fin. Cet outil est précieux pour essayer de décrire un phénomène infectieux et comprendre les mécanismes mis en jeu lors d une infection virale. b- Collaboration avec la chaire d excellence BioMEA Dans le cadre de la chaire d excellence financée par le CRBN et les fonds Européens FEDER, des expériences sur les mortalités ont également été initiées avec les chercheurs accueillis. Une doctorante chinoise invitée dans le cadre de cette chaire d excellence a été reçue à l université pour collaborer à ce programme et développer des techniques complémentaires à celles actuellement maîtrisées. Il s agit pour cette étude d un suivi de la cinétique d infection du virus dans son hôte via la technique du séquençage à haut débit d ARN «RNA Seq» qui consiste à séquencer tous les produits d expression des gènes à un moment donné. Des contaminations expérimentales ont été menées par injection de solution filtrée à 0.22µm contenant du virus dans des juvéniles d huîtres creuses. Le suivi de la charge virale et des mortalités a été suivi au cours de cette étude (figure 5). Figure 5 : Les taux de mortalités sont représentés par les courbes et les niveaux de charges virales par des barres. Ces résultats montrent qu il est possible d induire des mortalités en milieu contrôlé comme dans les travaux de Schikorski et al. publiés en 2011. Les mortalités observées dès les premiers jours et qui se stabilisent ensuite sont associées à de fortes charges virales OsHV-1(Figure 5).

Des échantillons ont été prélevés au cours de l infection (T0, 6h, 12h, J1, J3 et J5). Des banques d ARN ont été réalisées à partir des ARN transcrits présents dans les animaux prélevées. Les ARN présents dans ces échantillons ont été séquencés. Ces banques ont ensuite été étudiées sur le séquenceur GAIIx Illumina de la plateforme SESAME. Les clusters obtenus représentent les gènes les plus exprimés. Cette étude permet de suivre la réponse de l huître au virus au cours d un épisode infectieux. Les données ont conduit à l identification de gènes candidats, dont la validation par qpcr est en cours. Certains de ces gènes sont également retrouvés dans la liste des 128 gènes présentés en première partie et permettent de renforcer le scénario proposé mais aussi de le compléter. Ces travaux sont toujours en cours d étude et permettront de mieux comprendre le mode d infection du virus en milieu contrôlé. Cette étude fera l objet d une publication scientifique en collaboration avec les chercheurs de l Université Rutgers et de l institut océanographique de Qingdao. 3. Perspectives et projets 2013 Les perspectives du projet GIGAVIR sont de poursuivre les expérimentations décrites ici et en particulier en milieu contrôlé afin d avoir accès à l épisode infectieux dans sa globalité. a- Recherche et validation de marqueurs génétiques associés à l infection Lors de ces expériences, un certain nombre de gènes marqueurs associés à l infection ont été identifiés. Il convient de valider parmi ces gènes ceux qui présentent un réel intérêt. Dans ce but, des infections contrôlées vont être entreprises au sein du CRH sur des larves ou du naissain pour permettre la validation de ces marqueurs et identifier les réseaux de gènes impliqués dans la cinétique de réponse au virus. Ainsi, un stagiaire de master 2 sera accueilli pour assurer les infections in vitro, tester des gènes candidats et éventuellement d en identifier d autres. Les listes de gènes initialement obtenues soit par microarray soit par RNAseq (collaboration avec l Université Rutgers) vont également faire l objet d une étude bibliographique plus approfondie pour mieux comprendre les voies de signalisation impliquées dans la reconnaissance du virus, son cycle de vie ou son action dans la cellule hôte. Un partenariat avec le LFD est également prévu et consiste en un transfert de technologie portant sur les microarrays et en particulier sur la réponse de l huître aux différents variants (thèse de Claire Martenot). Dans ce cadre, une puce à ADN contenant à la fois le génome de l huître et celui du virus va être développée au laboratoire afin d étudier le dialogue entre l hôte et son pathogène au cours d une infection virale en milieu contrôlé mais aussi sur estran. b- Régulation de l interaction fine hôte pathogène (mirna) Des résultats récents ont montré qu un grand nombre de régulations impliquent de petites molécules d acides nucléiques baptisées miarn. Ces molécules interfèrent avec l ADN et modulent l expression de gènes d intérêt. En 2013, un projet de séquençage des miarn chez l huître sera piloté par Christophe Lelong sur le séquenceur nouvelle génération de la SFR ICORE. Un projet de séquençage de miarn mené en parallèle entre animaux sains et infectés va être entrepris afin d essayer d identifier des miarn spécifiques de l interaction hôte-pathogène comme il en existe chez d autres modèles. En effet, certaines de ces molécules sont impliquées dans les changements dans le cycle de vie de virus pour le maintien en phase de latence. Bibliographie Burge, C. A., Friedman, C. S., 2011. Quantifying ostreid herpesvirus (OsHV-1) genome copies and expression during transmission. Microbial ecology, 1-9. Compton, S.L., Behrend, E.N. 2006. PRAF1: a Golgi complex transmembrane protein that interacts with viruses. Biochemistry Cell Biology, 84:940-948. Dheilly, N. M., Lelong, L., Huvet, A., Favrel, P., 2011. Development of a Pacific oyster (Crassostrea gigas) 31 918-feature microarray: Identification of reference genes and tissue-enriched expression patterns. BMC Genomics 12, 468 1-16. Dheilly, N. M., Lelong, L., Huvet, A., Kellner, K., Dubos, M.P., Rivière, G., Boudry, P., Favrel, P., 2012. Gametogenesis in the Pacific Oyster Crassostrea gigas : A microarrays-based analysis identifies sex and stage specific genes. Plos ONE 7 (5) 1-15 BMC Genomics 12, 468. Hohfled, J., Jentsch, S. 1997 GrpE-like regulation of the Hsc70 chaperone by the anti-apoptotic protein BAG-1. EMBO Journal, 16:6209-6216. Ishikawa, K., Azuma, S., Ikawa, S., Semba, K., Inoue, J.I. 2005. Identification of DRG family regulatory proteins (DFRPs): specific regulation of DRG1 and DRG2. Genes to Cells, 10:139-150.

Kahle, J., Piaia, E., Neimanis, S., Meisterernst, M., Doenecke, D. 2009. Regulation of nuclear import and export of negative cofactor 2. Journal of Biology Chemistry, 284(14):9382-93. Melcher, M., Schmid, M., Aagaard, L., Selenko, P., Laible, G., Jenuwein, T. 2000. Structure-function analysis of SUV39H1 reveals a dominant role in heterochromatin organization, chromosome segregation, and mitotic progression. Mol Cell Biol 20(10):3728-41. Nakano, K, Watanabe, T., 2012. HTLV-1 Rex: the courier of viral messages making use of the host vehicle. Frontiers in microbiology 3:3-13. Okamoto, M., Sudhof, T.C. 1997. Mints, Munc18-interactiong protein in synaptic vesicle exocytosis. The Journal of Biological Chemistry, 272:31459-31464. Petermann, P.,Haase, I., Knebel-Mörsdorf, D. 2009 Impact of Rac1 and Cdc42 Signaling during Early Herpes Simplex Virus Type 1 Infection of Keratinocytes. Journal of Virology 9759-9772 Roizman, B., Zhou, G., Du, T. 2011. Checkpoints in productive and latent infections with herpes simplex virus 1: conceptualization of the issues. Journal of Neurovirology, 17:512-7. Roizman, B. 2011. The checkpoints of viral gene expression in productive and latent infection: the role of the HADC/CoREST- LSD1/REST repressor complex. Journal of Virology, 85(5):7474-82. Schikorski, D., Faury, N., Pepin, J.F., Saulnier, D., Tourbiez, D., Renault, T. 2011a. Experimental ostreid herpesvirus 1 infection of the Pacific oyster Crassostrea gigas: Kinetics of virus DNA detection by q-pcr in seawater and in oyster samples. Virus Research, 155:28 34. Schikorski, D., Renault, T., Saulnier, D., Faury, N., Moreau, P., Pépin, J.F. 2011b. Experimental infection of Pacific oyster Crassostrea gigas spat by ostreid herpesvirus 1: demonstration of oyster spat susceptibility. Veterinary Research, 42:27.

Zhang, G., Fang, X., Guo, X. et al. 2012 The oyster genome reveals stress adaptation and complexity of shell formation. Nature 490: 49-54.

Programme ASIL J. Normand 1, A. Jouaux 2, J.L. Blin 3, M. Treille 4, B. Petton 5, C. Lazard 1, S. Parrad 1, C. Mary 1, B. Simon 1, T. Gauquelin 3, V. Lefebvre 3, S. Pétinay 3, N. Laisney 3, N. Daguier 4, D. Esperet 4 1 Ifremer LERN, Station de Port-en-Bessin, Avenue Général de Gaulle, 14520 Port-en-Bessin 2 FRE BIOMEA, IFR146 ICORE FRE 3484 BioMEA CNRS INEE, Université de Caen Basse Normandie, Esplanade de la paix 14032 Caen Cedex 3 Synergie Mer et Littoral, Centre Expérimental de Blainville, Zone conchylicole, 50560 Blainville-sur-Mer 4 Laboratoire Départemental d Analyses de la Manche, 1352 av. de Paris, 50008 St Lô Cedex 5 Laboratoire de Physiologie des Invertébrés UMR 6539 Ifremer LEMAR, Station expérimentale d Argenton, 29840 Landunvez.

Programme ASIL J. Normand 1, A. Jouaux 2, J.L. Blin 3, M. Treille 4, B. Petton 5, C. Lazard 1, S. Parrad 1, C. Mary 1, B. Simon 1, T. Gauquelin 3, V. Lefebvre 3, S. Pétinay 3, N. Laisney 3, N. Daguier 4, D. Esperet 4 1 Ifremer LERN, Station de Port-en-Bessin, Avenue Général de Gaulle, 14520 Port-en-Bessin 2 FRE BIOMEA, IFR146 ICORE FRE 3484 BioMEA CNRS INEE, Université de Caen Basse Normandie, Esplanade de la paix 14032 Caen Cedex 3 Synergie Mer et Littoral, Centre Expérimental de Blainville, Zone conchylicole, 50560 Blainville-sur-Mer 4 Laboratoire Départemental d Analyses de la Manche, 1352 av. de Paris, 50008 St Lô Cedex 5 Laboratoire de Physiologie des Invertébrés UMR 6539 Ifremer LEMAR, Station expérimentale d Argenton, 29840 Landunvez. Cadre général L implication prioritaire d un ou de plusieurs agents pathogènes dans le déclenchement des surmortalités de naissains d huître creuse est rendue évidente par le caractère contagieux du phénomène et fait donc aujourd hui l objet d un large consensus. Trivialement, un tel postulat implique également que des individus naïfs isolés des pathogènes impliqués n ont aucune chance de déclarer la maladie. Une mesure de gestion zootechnique de l épizootie reposant sur l isolement des lots a donc été proposée très tôt. Elle consisterait à élever des lots de naissains, identifiés comme «naïfs» vis-à-vis des agents infectieux incriminés dans les surmortalités, sur de nouvelles zones d élevages isolées et encore indemnes de pathogènes. Une telle mesure semble particulièrement adaptée au contexte de la Basse-Normandie, où la profession a fait preuve d un grand volontarisme dans la mise en place de mesures de gestions des transferts dès 2010 et où la rareté des stocks sauvages permet de s affranchir d une origine potentielle de contamination (difficilement évitable dans les autres secteurs ostréicoles français). La mise en application de cette mesure dans le contexte d élevage actuel impose toutefois plusieurs contraintes. 1 ) Les outils de diagnostic disponibles doivent permettre d identifier avec certitude les lots porteurs d une infection virale latente afin d éviter de contaminer ces zones sanctuaires avec des individus «porteurs» non-détectés. 2 ) Il paraît difficilement envisageable de délocaliser la totalité des cheptels actuellement en élevage sur de telles zones sanctuaires pour des raisons évidentes d occupation de l espace. Une solution commode consisterait à ce que ces zones soient plutôt destinées à une sauvegarde temporaire des lots avant réintroduction sur les secteurs ostréicoles habituellement exploités. Un tel schéma zootechnique ne s avèrerait alors efficace qu à condition que les cheptels aient vu leur résistance améliorée pendant la période d isolement mais surtout lors de leur réintroduction en contexte infectieux (cf rapport CRH 2011). 3 ) Enfin, il est probable que certaines périodes de l année soient plus propices à la réintroduction, dans la mesure où la maladie suit une dynamique saisonnière. La mise en évidence des périodes pendant lesquelles le risque de contagion des lots naïfs est le plus fort pourrait ainsi permettre d améliorer l efficacité des mesures d isolement temporaire des lots, ou celle des mesures de restriction d immersion. Ce projet de recherche s articule donc en 3 parties, visant chacune à répondre à une question posée pour l optimisation de mesures de gestion des surmortalités de naissain par le diagnostic du statut des lots (porteurs ou non-porteurs d une infection latente) et l isolement (Figure 1). Pris ensemble, les résultats devraient permettre d appréhender l efficacité d un tel protocole alliant certification et isolement pour son application en production.

Figure 1 : Représentation schématique d un protocole d élevage alliant certification et isolement pour la gestion des surmortalités, mise en perspective avec les questions traitées dans le projet ASIL. Phase 1 : Peut-on évaluer l efficacité des méthodes de diagnostic du statut sanitaire des lots (lors de leur réception)? Introduction Une mesure de gestion de l épidémie pourrait consister à trier les lots mis en élevage en fonction de leur statut sanitaire vis-à-vis des pathogènes impliqués dans les surmortalités, afin d éviter autant que possible l entrée de ces agents infectieux sur les secteurs ostréicoles. Un tel scénario de gestion nécessiterait alors la mise en œuvre de tests diagnostiques sûrs pour qualifier le statut sanitaire des lots à leur entrée sur les zones d élevage, pendant la période hivernale. Plus généralement, l identification des parcours d élevage conduisant à l infection de certains lots constitue évidemment un élément majeur pour la compréhension des dynamiques infectieuses. Les travaux entrepris depuis 2008 sur le sujet ont permis le développement de 2 types de méthodes de diagnostic. Le premier type de méthodes permet d estimer le degré d infection par l OsHV-1 des individus testés, grâce à des méthodes moléculaires ciblant le génome viral (Pépin et al., 2008). Les développements récents de ces outils ont abouti à la mise au point d une technique de PCR quantitative basée sur la chimie Taqman et dont les seuils de détection ont pu être abaissés par rapport à la méthode précédente (Martenot et al., 2010). Le second type de méthodes de diagnostic est basé sur une technique de conditionnement zootechnique qui permet l induction de la virulence des pathogènes impliqués chez les lots porteurs, en l absence de tout phénomène de contagion. Ce protocole, développé par l équipe du Laboratoire de Physiologie des Invertébrés UMR 6539 Ifremer LEMAR (Petton et Pernet, in prep) consiste à placer les individus pendant 1 mois dans des conditions d élevage simulant les conditions environnementales propices au développement de la pathologie (température élevée et nourriture ad libitum). Cet outil diagnostique a été adapté et mis en œuvre au centre d expérimentation du SMEL après avoir été calibré en 2011, en collaboration avec l équipe de la station expérimentale Ifremer d Argenton. Ainsi, disposant désormais en Normandie d outils moléculaires de plus grande sensibilité et de l outil de conditionnement zootechnique, il était envisageable d en comparer les résultats afin de tester leur efficacité pour évaluer le statut sanitaire de lots de naissain d huîtres. La présente étude visait donc à utiliser de façon concomitante ces différentes méthodes de diagnostic sur un nombre aussi élevé que possible de lots de naissain de diverses origines pour en comparer les résultats. Les expérimentations devaient également permettre de tester l effet de différents parcours zootechniques sur le statut sanitaire des lots.

Méthode Figure 2 : Schéma du protocole expérimental La méthodologie adoptée a consisté dans un premier temps à renseigner différents indicateurs du parcours zootechniques pour 11 lots de naissain (Figure 2). La prévalence initiale en individus porteurs du virus OsHV-1 dans le lot a ensuite été estimée par une première PCR quantitative réalisée sur 96 individus afin d avoir une idée précise de la prévalence (proportion d individus porteurs dans la population expérimentale) et de la charge virale des individus porteurs (nb. de copies de génome viral par unité de tissus d huître). Pour chacun des lots, 3 souséchantillons de 200 individus ont ensuite été isolés, et soumis au conditionnement zootechnique décrit ci-dessus. 3 semaines après le début du conditionnement, 3 pools de 5 individus survivants ont été constitués pour chacun des bacs, et une recherche d ADN viral a été effectuée en utilisant la même méthode de PCR quantitative. La proportion d échantillons dans lesquels la présence de l OsHV-1 a été avérée a permis d estimer une probabilité de détection de l OsHV-1 à l issue du conditionnement. Enfin, la probabilité de mortalité dans les bacs a été estimée par dénombrement des individus vivants et morts à l issue de cette phase de testage. L analyse des résultats a d abord consisté à comparer les résultats des différentes méthodes 2 à 2. La seconde étape de l analyse a consisté à tester l effet des différents paramètres zootechniques sur le statut sanitaire du lot caractérisé par les 3 méthodes de diagnostic.

Résultats Indicateurs du parcours zootechnique des lots Lot Origine Ploïdie Passé sur l'estran Passé sur l'estran pendant la période des mortalités Masse moyenne initiale (g) 1 captage 2n oui oui 0,362 2 écloserie 3n oui oui 0,699 3 écloserie 3n non non 0,639 4 captage 2n oui oui 0,192 5 écloserie 2n non non 0,172 6 écloserie 2n oui oui 0,213 7 écloserie 3n oui non 0,504 8 captage 2n oui oui 0,098 9 écloserie 2n oui non 0,309 10 captage 2n oui oui 0,141 11 captage 2n oui oui 0,306 Tableau 1 : Données de caractérisation du parcours zootechnique précoce des lots Parmi les 11 lots testés dans le cadre de cette étude, 6 étaient issus de production d écloserie, et 5 étaient des lots de captage naturel (Tableau 1). Parmi ceux-ci, le lot 10 a été mutualisé dans le cadre de différentes actions du CRH parmi lesquelles l Observatoire d agents infectieux de l huître sur les cheptels ostréicoles bas-normands (Savary M., dans ce rapport). Sur les 6 lots d écloserie, 3 d entre eux étaient constitués d individus triploïdes et 3 lots étaient diploïdes (Tableau 1). Par ailleurs, 4 lots (2 lots 2n et 2 lots 3n) parmi ces 6 lots n avaient pas été élevés sur l estran pendant la période de mortalité. Parmi ces 4 lots, 2 lots (1 lot 2n et 1 lot 3n) n avaient jamais été en contact avec l estran, puisqu ils avaient été obtenus directement à leur sortie des installations d élevage à terre. Comparaison des résultats des différents indicateurs du statut sanitaire des lots Relation entre prévalence initiale et probabilité de mortalité dans les bacs de testage D un côté, certains lots présentant une forte prévalence initiale ont effectivement montré des taux de mortalité importants (comme les lots 1, 4 et 6) (Figure 3). Parallèlement, aucune mortalité significative n a été déclenchée lors du conditionnement chez les 3 lots détectés comme complètement indemnes d individus porteurs du virus (lots 3, 5 et 9). La probabilité de mortalité dans les bacs de testage apparaît toutefois relativement indépendante de la proportion d individus détectés comme porteur de l OsHV-1 lors de la réception des lots (Pr > 0,05) (Figure 3). Ainsi, le lot 11, qui présentait à sa réception une forte proportion d individus porteurs du virus (quoiqu à des charges virales très faibles), a montré dans le même temps des mortalités très faibles dans les bacs de conditionnement. Le lot 8 présentait également une prévalence initiale très faible mais avec une forte charge virale, et a montré des mortalités très importantes lors de la phase de conditionnement zootechnique.

Relation entre taux de mortalité dans les bacs de conditionnement et probabilité de détection de l OsHV-1 à l issue du conditionnement La relation entre l intensité des mortalités dans les bacs et la probabilité de détection de l OsHV-1 à l issue du conditionnement apparaît significative (Pr < 0,01) (Figure 3). La relation apparaît clairement positive, avec une probabilité de détection du virus nettement accrue dans les bacs où la mortalité s est exprimée le plus fortement. Le bac 1 du lot 10 vient apporter une parfaite illustration de cette relation, avec de très fortes mortalités (> 80%) associées à la détection de l OsHV-1 dans les 3 échantillons constitués (Figure 3). La relation est également appuyée par l absence de détection du virus herpès de l huître dans les échantillons issus des bacs présentant de faibles mortalités (lot 3 bacs 2 et 3 ; lot 7 bac 1 ; lot 9 bacs 1, 2 et 3 et lot 11 bacs 1, 2, et 3) (Figure 3). Il faut toutefois noter que cette relation admet un nombre non négligeable d exceptions. Certains bacs présentent en effet de très faibles mortalités associées à une forte probabilité de détection de l OsHV-1 (lot 3 bac 1 ; lot 4 bac 2 ; lot 5 bac 1) (Figure 3). Dans ce cas toutefois, il faut remarquer que les charges virales mesurées restent relativement faibles, de l ordre de quelques centaines à quelques milliers de copies de génome viral pour 50 mg de tissus. Ceci suggère que les indicateurs de l infection virale à l issue du conditionnement devraient intégrer à la fois la prévalence, mais également la charge virale individuelle pour décrire au mieux la dynamique infectieuse. Le faible effort d échantillonnage à l issue du conditionnement, couplé à une très forte variabilité des charges virales entre échantillons, n a toutefois pas permis de mettre en œuvre cette approche ici. A contrario, certains bacs montrent dans le même temps de fortes mortalités associées à de faibles probabilités de détection du virus à l issue du conditionnement (lot 8 bac 1) (Figure 3). Plusieurs hypothèses peuvent être formulées pour expliquer un tel phénomène, parmi lesquelles : - un effet de la dynamique d infection virale propre au lot considéré, traduisant un effet d abattement de la charge virale chez les individus en cours de guérison et l élimination des individus les plus porteurs par mortalité différentielle ; - l implication d un ou plusieurs pathogènes non-identifiés dans le déclenchement de l épisode infectieux dans les bacs de testage.

Figure 3 : Prévalence initiale estimée (A), taux de mortalité dans les bacs de testage (B) et nombre d échantillons (sur 3) dans lesquels l OsHV-1 a été détecté à l issue du conditionnement zootechnique (C). Relation entre prévalence initiale et probabilité de détection de l OsHV-1 à l issue du conditionnement La relation entre la prévalence initiale estimée à la réception des lots et la probabilité de détection du virus à l issue du conditionnement est clairement non-significative (Pr > 0,05) (Figure 3). Ainsi, de fortes valeurs de prévalence mesurées lors de la réception du lot ne débouchent pas forcément sur une forte probabilité de détection de l OsHV-1 dans les échantillons constitués à l issue du conditionnement zootechnique. On constate ainsi une absence totale de détection dans certains bacs, pourtant issus de lots qui présentaient initialement une forte proportion d individus infectés par le virus (lot 4 bac 1 et lot 11 bacs 1, 2 et 3) (Figure 3). A l inverse, des lots apparemment indemnes du virus lors de leur réception ont montré une forte probabilité de détection de l OsHV-1 dans plusieurs bacs à l issue du conditionnement (lot 3 bac 1 ; lot 5 bacs 1, 2 et 3) (Figure 3). Là encore, les charges virales individuelles mesurées dans ce cas à l issue du conditionnement restent relativement faibles, de l ordre de quelques centaines à quelques milliers de copies de génome viral pour 50 mg de tissus. L augmentation modérée de la charge virale dans

ces lots à l issue du conditionnement traduit probablement une infection en cours, quoique relativement peu active. Effet des différents paramètres zootechniques sur le statut sanitaire du lot caractérisé par les 3 méthodes de diagnostic Var = Prévalence Mortalité dans Proba. de détection de l OsHV-1 à l issue du initiale les bacs conditionnement zootechnique Pr > Khi² Pr > Khi² Pr > Khi² Origine <.0001 0,0091 0,8771 Ploïdie <.0001 0,0108 0,8265 Estran <.0001 0,0099 0,7405 Estran_été <.0001 <.0001 0,0409 Tableau 2 : Valeurs de probabilité associées aux test de Khi2, pour les modèles logit(π) = µ + a*[variable x] ; avec π = π prévalence_initiale, puis π = π mortalité ou π = π probabilité de détection de l OsHV-1 à l issue du conditionnement zootechnique et Variable x = Origine ; Ploïdie ; Estran ; Estran été. Les paramètres zootechniques montrent tous un lien fort avec la probabilité de détection du virus dans le lot lors de sa réception, et la probabilité de mortalité dans les bacs de testage (Pr toutes inférieures à 0,05) (Tableau 2), quoique leur fort degré d imbrication implique que certains estimateurs des rapports de risque sont confondus, ou redondants les uns par rapport aux autres. Les analyses univariées montrent que le risque de révéler une infection lors de la mesure de la prévalence initiale, ou lors du conditionnement zootechnique est accru : - chez le naissain issu de captage comparé au naissain produit en écloserie d écloserie, - chez les lots diploïdes plutôt que triploïdes, - chez les lots élevés sur l estran comparativement aux lots isolés dans des installations à terre, - chez les lots élevés sur l estran pendant la période de mortalité, comparativement aux lots isolés dans des installations à terre à cette période. Si l on considère la probabilité de détection de l OsHV-1 estimée à l issue du conditionnement zootechnique, le seul effet détecté comme significatif est celui de l élevage sur l estran pendant la période de mortalité (Pr < 0,05) (Tableau 2), qui coïncide avec une occurrence nettement accrue des individus infectés par le virus.

Figure 4 : Effet des paramètres du parcours zootechnique sur la prévalence initiale estimée (A), les taux de mortalité dans les bacs de testage (B) et le nombre d échantillons (sur 3) dans lesquels l OsHV-1 a été détecté à l issue du conditionnement zootechnique (C). Discussion La principale différence entre notre expérimentation, et les travaux menés antérieurement sur le sujet, tenait dans la mise en œuvre d un effort d échantillonnage accru et l emploi d une technique d analyse par qpcr décrite comme particulièrement sensible (Martenot et al, 2010) pour l estimation de la contamination des lots lors de leur réception. En dépit de ces légères différences de protocole, les résultats présentés ici sont tous très concordants avec les résultats des travaux menés en 2010 par l équipe du Laboratoire de Physiologie des Invertébrés UMR 6539 Ifremer LEMAR (Petton et Pernet, in prep). La comparaison des résultats de prévalence initiale et de probabilité de mortalité dans les bacs de testage suggère que l absence de détection du virus lors de la réception du lot pourrait constituer, dans nos conditions expérimentales, une garantie que le lot échappe aux mortalités au cours du conditionnement zootechnique. A l inverse, de fortes valeurs de prévalence d individus infectés par l OsHV-1 lors de la réception du lot ne semblent pas déboucher de façon systématique

sur l induction de mortalités significatives lors de la phase de conditionnement si les charges mesurées au départ sont faibles. L expression des mortalités dans les bacs coïncide également avec une augmentation de la probabilité de détection du virus chez les individus survivants, sans que cette association soit systématique. La comparaison des résultats de prévalence initiale dans les lots, et de détection de l OsHV- 1 dans les bacs à l issue du conditionnement zootechnique laisse à penser que : 1 ) l absence de détection du virus lors de la réception du lot ne constitue pas une garantie que le lot soit effectivement indemne d individus porteurs de l OsHV-1, et ce en dépit d un fort effort d échantillonnage (96 individus, traités séparément) consacré à l estimation de la prévalence initiale. Les lots 3 et 5 présentaient ainsi une prévalence apparemment nulle lors de leur réception, mais ont révélé une infection latente au cours du conditionnement zootechnique sans déclarer pour autant de mortalité. 2 ) le conditionnement zootechnique ne garantie pas la révélation d une infection virale latente détectée lors de la réception du lot, puisque le lot 11 qui présentait une forte prévalence lors de sa réception n a pas exprimé les symptômes de l infection par le virus par la suite. L effet des paramètres zootechniques sur la variation des indicateurs du statut sanitaire des lots est globalement concordant, quelle que soit la méthode de diagnostic utilisée. Les rapports de risque indiquent clairement que les facteurs discriminant le plus fortement les lots pour les différents indicateurs sont les paramètres zootechniques «Estran» et «Estran_été», le second étant imbriqué dans le premier. Ces paramètres sont tous 2 imbriqués dans le paramètre «Origine», dans la mesure où les lots issus de captage naturel ont nécessairement été en contact avec l estran à une période où les mortalités se produisent. Par ailleurs, 2 des 3 lots triploïdes testés au cours de notre étude ont été préservés dans des installations d élevage à terre pendant la période des mortalités. Il est alors naturel que la réduction du risque conférée par l isolement à terre pendant la période estivale se confonde ici en partie avec l effet du paramètre «Ploïdie». Une analyse parcimonieuse des résultats aboutie finalement à la conclusion que le passage des lots sur l estran, et ce particulièrement pendant la période de mortalité, constitue le facteur de risque d infection le plus probable. Ce parcours zootechnique (suivi par 7 lots sur les 11 considérés) se traduit dans notre étude par une augmentation très forte de la prévalence initiale, de la mortalité dans les bacs, et de la probabilité de détection du virus dans les échantillons à l issue du conditionnement zootechnique. Une telle conclusion devrait d ailleurs apparaître triviale dans la mesure où des lots indemnes de pathogènes et isolés des foyers de contagion dans des installations d élevage à terre ne présentent pas les symptômes associés à la maladie, comme cela a été mis en évidence au cours de travaux antérieurs (Bilan CRH, 2011), ou plus récents (Le Guillois M., dans ce rapport). Nous pensons que ces résultats encouragent aujourd hui à travailler sur l effet des paramètres zootechniques précoces (avant la mise en élevage des lots) qui pourraient expliquer une part de la variabilité des taux de survie inter-lots, constatée sur le terrain. Le projet EVILS (Etude de la Variabilité Inter-Lots pour la Survie), porté par le LERN et mené dans le cadre du CRH en 2013 focalise sur la question des facteurs impliqués dans cette variance, et devrait apporter les premiers éléments de réponse à ces questions.

Bilan de la phase 1: Nos résultats suggèrent que 1) l estimation de la prévalence lors de la réception des lots par qpcr, 2) l estimation de la probabilité de survie à l issue du conditionnement zootechnique et 3) l estimation de la probabilité de détection de l OsHV-1 par qpcr à l issue du conditionnement constituent des méthodes permettant chacune d approcher la qualification du statut sanitaire des cheptels. La phase 1 du projet ASIL montre également une relative divergence des résultats entre ces méthodes. Il apparaît notamment que le conditionnement zootechnique permet la révélation d infections virales latentes, non-détectées initialement. La mise en œuvre du conditionnement zootechnique et de la détection par qpcr au sein d une même procédure de diagnostic constitue probablement le protocole le plus efficace pour détecter une éventuelle contamination du lot par le virus herpès de l huître. Appliqué au scénario d élevage basé sur le diagnostic et l isolement tel qu il est proposé dans les projet Portbail 2 porté par le LFD (Houssin M., dans ce rapport), un tel protocole devrait permettre de diminuer sensiblement la quantité d individus porteurs d une infection virale latente introduits sur les zones d élevage. L utilisation de lots n ayant jamais été mis en contact avec l estran pendant la période de mortalité estivale devrait également réduire de façon très significative la probabilité d apparition de la maladie s ils sont déployés dans les zones indemnes de mortalité. Les résultats montrent toutefois que, même dans ce cas, les probabilités d infection par l OsHV-1 ne sont pas nulles. Des individus infectés par le virus sont d ailleurs observés à l issue du conditionnement zootechnique y compris dans les lots 3 et 5, qui n ont pourtant jamais été en contact avec le milieu naturel. Le fait qu aucune de ces méthodes ne permette de garantir le statut sanitaire des lots reste d une importance capitale pour l application, en situation de production, du scénario envisagé. Du fait du caractère hautement contagieux de la maladie, on peut craindre que l introduction accidentelle d un petit nombre d individus porteurs de l infection puisse suffire à contaminer toute une zone, ou une installation d élevage à terre. Seules des expérimentations à plus grande échelle, comme celles qui sont entreprises dans les projets Portbail 1 et 2 (Houssin M., dans ce rapport), permettront d évaluer la faisabilité de l application d une telle procédure dans les entreprises ostréicoles, et d estimer les bénéfices potentiels obtenus alors.

Phase 2 : Peut-on définir les périodes au cours desquelles s effectue la contagion? Introduction Alors que la phase 1 d ASIL s intéressait à la qualification du statut des lots de naissain visà-vis du virus OsHV-1, la phase 2 du projet proposait une étude expérimentale des facteurs induisant la contagion des cheptels de naissain identifiés comme «naïfs». L identification de ces facteurs s avère en effet cruciale pour optimiser les procédures d élevage visant à réduire le risque de contagion de ces lots. L hypothèse d une cause infectieuse aux surmortalités de naissain implique en effet que la contagion des lots indemnes de pathogène s effectue par leur mise en contact avec les agents infectieux impliqués. Il est ainsi admis que les mortalités observées sur les secteurs ostréicoles sont accompagnées par la libération d un grand nombre de particules infectieuses qui contribuent à propager la maladie vers les individus jusque-là indemnes. Les périodes pendant lesquelles la mortalité s exprime sur les secteurs ostréicoles coïncident donc très probablement avec un risque d infection maximum. Toutefois, la question d une éventuelle contagion des cheptels «naïfs» avant l apparition des mortalités sur le secteur considéré restait posée. Pour répondre à cette question, il a été proposé d immerger un lot de naissain qualifié de «naïf» dans 3 sites et de régulièrement évaluer son statut sanitaire avant que le phénomène de mortalité ne se propage sur les secteurs d étude. Matériel et méthode Lot de naissain Le naissain utilisé dans cette expérimentation est un lot d huîtres diploïdes issu d écloserie, sortant directement de nurserie. Ce lot a été mutualisé dans le cadre des actions du CRH pour 2012. Le statut sanitaire de ce lot vis-à-vis de l OsHV-1 a été préalablement étudié selon le protocole mis en place dans le cadre de la phase 1 du programme ASIL, à savoir application de deux méthodes diagnostiques: - Analyse individuelle en qpcr méthode Taqman (Martenot et al., 2010) de 96 individus dès la réception du lot. Cette analyse a été réalisée par le laboratoire BioMEA de l université de Caen. Photo 1 : Robot d extraction pour analyse qpcr du virus OsHV- 1 (crédit photo : BioMEA)

- Application du conditionnement zootechnique décrit au chapitre précédent (Petton et Pernet, in prep) sur un sous- échantillon du lot. Ces challenges étaient réalisés au centre d expérimentation du SMEL. - Photo 2 : Naissain en challenge thermique (crédit photo : SMEL) Aucun signe d infection virale latente n a pu être mis en évidence à l issue de ces 2 opérations de qualification (Tableau 3). Le lot de naissain a donc été considéré comme «naïf» vis- à- vis de l OsHV- 1. Tableau 3 : résultat du contrôle du statut sanitaire du lot de naissain Sites d élevage (Figure 5) Trois sites ont été retenus pour accueillir ces lots expérimentaux : - Deux sites d élevage ostréicoles (Blainville pour la côte Ouest Cotentin et St Vaast pour la côte Est Cotentin) impactés par le phénomène de mortalité. - Un site isolé (site expérimental du CRH) à Cricqueville en Bessin dans le Calvados. Figure 5 : Localisation des stations de suivi

Plan d échantillonnage La mise à l eau des poches expérimentales a été réalisée le 7 février 2012. Deux pochesréplicats de naissain ont été déposées sur chaque site. Elles contenaient chacune environ 2 250 individus par poche (charge considérée comme classique). Jusqu au 20 juin, et tous les 15 jours (à chaque marée), un contrôle a été effectué afin de s assurer de la présence ou de l absence de mortalité sur la population expérimentale gardée en élevage sur l estran. Un sous-échantillon a été ensuite prélevé dans chacune des poches, et dans chaque site pour mettre en œuvre les deux outils de qualification du statut sanitaire (analyse qpcr et conditionnement zootechnique). Cet échantillonnage a été réalisé jusqu à ce que les méthodes d analyses permettent de révéler une infection virale latente chez le lot, ou que les mortalités se déclarent sur les cheptels à l entour. Figure 6 : Schéma du plan d échantillonnage Indicateurs suivis - OsHV-1 Concernant la détection du virus OsHV-1, deux pools de 5 individus ont été échantillonnés à chaque date pour analyse. Ces analyses ont été réalisées au laboratoire départemental d analyses de la Manche (qpcr Taqman). Elles ont permis de confirmer le cas échéant la présence ou non du virus pour chaque date d observation chez les naissains sortant directement de l estran. - Taux de mortalité et présence de l OsHV-1 à l issu du conditionnement zootechnique Le second indicateur de suivi est la mortalité observée après un mois de challenge thermique. Ainsi, pour chaque date 2 réplicats de 200 individus ont été constitués et soumis au conditionnement zootechnique décrit dans le chapitre précédent. A l issue des ces challenges, une analyse de contrôle a été réalisée en qpcr Taqman pour confirmer en cas de mortalité la présence d OsHV-1 (sur 1 pool de 5 individus par bac de conditionnement). - Croissance sur estran La croissance des huîtres de chaque site est évaluée sur la base de l échantillonnage réalisé à chaque marée. Ainsi, un sous échantillon de 30 individus (15 par poche réplica) pesés en individuel (15 individus de chaque poche réplica) permet d obtenir pour chaque date le poids moyen observé sur chacun des sites. Paramètres complémentaires

Enfin, pour compléter les informations concernant cette expérimentation, des données supplémentaires sont acquises. En ce qui concerne l observation du phénomène de mortalité dans les secteurs abritant la présente expérimentation, des données de taux de mortalité sont relevés dans le cadre du suivi dynamique de la mortalité et des pathogènes mis en place par le SMEL pour les stations de Blainville et St Vaast. Le cheptel utilisé dans ce cadre est le même (2n écloserie lot CRH 2012) et les poches de ce suivi sont sur les mêmes concessions. En ce qui concerne Cricqueville en Bessin, les informations de mortalité sont issues des observations du laboratoire BioMEA qui travaille sur ses propres lots expérimentaux mis en élevage sur cette station. D une manière générale, pour évaluer a posteriori les dates d apparition du phénomène de mortalité dans les écosystèmes ostréicoles bas-normands, nous disposons de la base de données centralisant les déclarations faites par les professionnels aux DDTM (Outil du groupe de vigilance bas-normand). D autre part, l instrumentalisation des stations de suivi de Blainville et St Vaast dans le cadre des réseaux de suivi ostréicoles, permet d acquérir des données environnementales comme la température des masses d eau des sites expérimentaux et la concentration en chlorophylle a. Résultats Site de Blainville (Tableau 4) Du 7 février au 21 mai aucune charge virale n a été détectée sur le naissain. Aucune mortalité à l issue des challenges thermiques n a pu être observée non plus. Le lot de naissain a conservé son statut de lot «naïf» exempt de virus jusqu à cette date incluse. De très fortes charges virales (de l ordre de 1.10 9 UG/50 mg en moyenne) ont été détectées 120 jours après la mise à l eau (4 juin). Les 2 échantillons analysés étaient positifs. A cette date, la mortalité observée sur estran était nulle. Le taux de mortalité moyen de l échantillon d huîtres sorties d estran à cette même date (4 juin) et mises en conditionnement thermique a été de 63% + / - 16% (I.C.95). Le virus a été détecté sur les huîtres survivantes de ce challenge avec une charge virale estimée à 4.10 3 UG/50mg. A la marée suivante (le 20 juin soit 135 jours après la mise à l eau) un taux de mortalité instantanée de 63% + / - 2% (I.C.95) a été observé sur estran. Site de St Vaast (Tableau 4) Sur ce site, aucune charge virale n a pu être observée par qpcr sur les échantillons prélevés durant toute la durée de l expérimentation. Par ailleurs, aucune mortalité anormale n a été observée à l issue du conditionnement zootechnique. Ces résultats suggèrent que le lot de naissain n a pas été contaminé entre le 7 février au 20 juin. Sur estran, aucune hausse de mortalité n a été observée dans le cheptel expérimental pendant cette période.

Site de Cricqueville en Bessin (Tableau 4) A Cricqueville, aucune charge virale n a été détectée en qpcr entre le 7 février au 20 juin, sur les individus traités directement après leur prélèvement dans le cheptel expérimental conservé sur l estran. La mortalité sur estran est restée nulle jusqu à cette date. Par contre, à l issue du dernier challenge thermique (échantillonnage du 20 juin, 135 jours après la mise à l eau), un taux de mortalité de 38% + / - 19% (I.C.95) a été relevé. La charge virale moyenne observée sur les huîtres survivantes était de 2.10 4 UG/50mg indiquant que le virus OsHV- 1 était associé à ces mortalités. Tableau 4 : Charges virales moyenne du lot observées sur le naissain implanté à Blainville, St Vaast et Cricqueville (UG/50 mg), Taux de mortalité moyen relevé à l issue du challenge thermique (% avec I.C.95) et taux de mortalité observés sur estran (% avec I.C.95) Suivi de croissance inter site (Figure 7) : Un différentiel de croissance net est observé entre Blainville et les deux autres stations. En effet, le poids moyen relevé sur cette station est très nettement supérieur à partir du 5 avril, le différentiel de poids étant encore plus marqué après le 4 mai. Les poids moyens observés sur St Vaast et Cricqueville restent très proches sur toute la durée de l expérimentation. A la fin du suivi (20 juin), le poids moyen mesuré à Blainville est de 3 g + / - 0,41 g (I.C.95) contre 2 g + / - 0,17 g (I.C.95) à Cricqueville et 1,8 g + / - 0,14 g (I.C.95) à St Vaast.

Figure 7 : Evolution du poids moyen des lots mis en élevage à Blainville (bleu), St Vaast (vert) et Cricqueville (rouge) (Barre d erreur I.C.95) Contexte environnemental Température des masses d eau : (Figure 8) De février à début mars, les températures des masses d eau de Blainville et St Vaast étaient similaires passant de 4 C à 8 C environ. Sur la période printanière jusque mi mai, les températures relevées à Blainville ont été supérieures à celle de St Vaast avec un différentiel moyen de 1,3 C + / - 0,1 C (I.C.95). Sur cette période la hausse de température a été progressive. Une hausse de température a pu être observée à partir du 19 et 20 mai sur les deux côtes avec une augmentation de 4,8 C pour Blainville, l eau passant de 12,6 C à 17,4 C et une augmentation de 3,2 C pour St Vaast, l eau passant de 11,7 C à 14,9 C. Ce phénomène de réchauffement important des masses d eau a été observé à la même période sur les deux sites mais la température de la masse d eau à Blainville à ce moment là était de 2,5 C supérieure à celle de St Vaast. Après le pic de température du 2 juin, les masses d eau sont restées autour de 16 C environ à Blainville alors qu à St Vaast celles-ci se situaient plutôt autour de 14 C jusqu à la mi-juin. Entre cette date et la fin du mois de juin, un réchauffement a été constaté sur ce site. Durant cette dernière période de l expérimentation, la température des masses d eau sur Blainville étaient systématiquement supérieures à celles de St Vaast d environ 2 C. Fin juin, elles atteignaient 18 C à Blainville alors qu à St Vaast, la température relevée était d environ 16 C.

Figure 8 : Evolution de la température des masses d eau pour le site de Blainville et St Vaast. Concentration en chlorophylle a : (Figure 9) Le suivi des concentrations en chlorophylle a réalisé par le SMEL dans le cadre du réseau HYDRONOR a révélé sur Blainville un pic du stock chlorophyllien début mars d une grande intensité (16 µg/l), un record historique sur cette côte depuis le début du suivi en 2000. Jusque début mai, la concentration en chlorophylle a reste légèrement supérieure sur la côte Ouest par rapport à la côte Est. Puis un bloom modéré est observé sur St Vaast début juin (> 5µg/L). Figure 9 : Evolution de la concentration en chlorophylle a à Blainville (trait bleu) et St Vaast (trait rouge). Discussion Sur le site de Blainville, la contamination du lot «naïf» n a été constatée qu à la date du 4 juin soit 120 jours après la mise à l eau. Cette contamination a d abord été mise en évidence par la révélation d une charge virale importante dans les échantillons traités en qpcr directement après le prélèvement, puis par la révélation de mortalités importantes associées à la présence d OsHV-1 à l issue du conditionnement zootechnique. La quantification de la charge virale individuelle lors du

prélèvement semblait importante puisque les échantillons analysés étaient tous positifs et que la charge virale moyenne était très élevée. Malgré cela à cette date, aucune mortalité n avait encore touché ce lot sur estran. Celle-ci a été observée à la marée suivante, confirmant les résultats obtenus en challenge thermique. Les déclarations de mortalité centralisées par les DDTM sur le secteur allant de Coutainville (au sud) à Gouville (au nord) montrent que les tous premiers constats ont été réalisés à partir de fin avril et en mai. Le phénomène de mortalité est donc apparu sur ce secteur ostréicole à cette période. La première quinzaine de juin coïncide avec une augmentation significative du nombre de déclarations de lots touchés par une mortalité anormale. En effet, sur 164 déclarations effectuées entre fin avril et fin août, 79% de ces déclarations concernaient des mortalités constatées par les professionnels en juin (Figure 10). Pour cette période, 63% des déclarations concernaient des constats réalisés plus particulièrement au cours de la première quinzaine de juin. Ces résultats suggèrent que la contagion du lot «naïf» utilisé dans notre expérimentation n a pas coïncidé avec le début de l expression des mortalités sur la zone, mais plutôt avec la propagation à grande échelle du phénomène de mortalité sur le site de Blainville. Figure 10 : Proportion de déclarations professionnelles entre avril et août indiquant la période de constat de mortalité sur le terrain (source : Base de donnée du groupe de vigilance bas-normand) pour le secteur de Coutainville à Gouville. Par ailleurs, il faut remarquer que des huîtres porteuses d une infection virale latente cohabitaient sur la concession expérimentale avec le lot sentinelle étudié ici, et ce, dès la fin de l hiver. Il s agissait en l occurrence d un lot de naissain identifié comme porteur asymptomatique dans le cadre de la phase1 du programme ASIL (exemple du lot de captage mutualisé dans le cadre de l observatoire du CRC-N et du suivi interrégional des centres techniques) et d huîtres de classes d âges supérieures (de demi-élevage en l occurrence). Il semble donc que la proximité d huîtres porteuses asymptomatiques ne suffise pas à provoquer la contamination des lots «naïfs», hors période de mortalité. Un décalage temporel de l apparition du phénomène de mortalité a ainsi pu être observé entre la côte Ouest et la côte Est (comme le montre les déclarations de mortalités relevées pour le secteur de Saint-Vaast). En effet, les premières observations de cas de mortalité sur St Vaast ont été réalisées à partir du mois de juillet. La propagation tardive des surmortalités sur la zone explique probablement pourquoi le lot «naïf» est resté indemne jusque fin juin. Des travaux précédents ont permis de mettre en évidence l implication de la température comme médiateur du passage de la phase d infection latente à celle d infection productive. Le décalage temporel des mortalités entre le secteur de Blainville et celui de Saint-Vaast évoqué ici est

certainement la conséquence du décalage thermique entre les masses d eau de la côte Ouest et Est décrit précédemment (Figure 8). La contamination du lot expérimental sur le site isolé de Cricqueville, révélée uniquement le 20 juin par l outil de challenge thermique, a pu être expliquée par l introduction sur ce site, d un lot de captage à partir de mai (comm. Pers. BioMEA). En effet ce lot avait été considéré comme non porteur du virus OsHV-1 sur la base d un diagnostique effectué par la méthode de diagnostic moléculaire (Martenot et al 2010) et avait donc pu être implanté sur le site isolé. Or, ce dernier lot s est avéré être porteur lors d un conditionnement en challenge thermique effectué par la suite pour vérification. Ce diagnostic précoce a été confirmé par le constat, sur le terrain, fin juin, d une forte charge virale chez les huîtres de ce lot. Le lot incriminé a donc été retiré du site, ainsi que les animaux présents à proximité. L hypothèse retenue est donc que ce lot de captage a certainement pu contaminer le lot «naïf» alors qu il commençait à manifester les signes d une infection virale productive. Il faut également constater que cette contamination a pu être révélée par la méthode de conditionnement zootechnique alors que le diagnostic par l outil moléculaire indiquait une absence de charge virale dans les échantillons traités en qpcr directement après le prélèvement. Ces résultats ne mettent pas en péril le statut de zone isolée de Cricqueville mais indiquent clairement que même à petite échelle (une concession, quelques poches), une contamination est toujours à craindre dans le cas de l introduction de lot porteur en période à risque. Enfin, le suivi de croissance a permis d identifier que la contamination du lot expérimental à Blainville s est déroulée alors que celui-ci était en pleine croissance. Ce résultat ne devrait pas être interprété comme un élément suggérant un lien entre croissance et apparition (ou intensité) des mortalités car sur le site de St Vaast fin juin, la croissance des huîtres suivait le même rythme que celle observée à Blainville un mois plus tôt sans que l on n observe dans le même temps de contamination du lot naïf, la période à risque n étant pas encore ouverte sur la côte Est.

Bilan de la phase 2 Dans les écosystèmes ostréicoles de Basse Normandie, la contamination par le virus d un lot non porteur a été détectée lorsque le phénomène de mortalité s est propagé sur les secteurs, à partir de lots de naissains porteurs déclarant la maladie virale. Ainsi, malgré la présence de lots porteurs dans les écosystèmes (naissains et classes d élevage supérieures), il semble qu il n y ait pas eu de transmission de la maladie entre la fin de l hiver et la fin du printemps. Ces résultats sont tout à fait similaires à ceux obtenus dans les secteurs de Bretagne Nord par l IFREMER (Petton et Pernet, in prep). Ainsi, s il est possible d obtenir des lots de naissain «naïfs» vis-à-vis de l OsHV-1, nos résultats suggèrent fortement que la moindre introduction de lots porteurs à proximité, entraîne la contamination des lots naïfs par le virus lorsque les conditions environnementales deviennent propices à l expression des mortalités. Ces résultats rejoignent ceux obtenus lors des expérimentations des années précédentes visant à tester la pratique de l isolement de lot (Smel, 2010 et 2011). Cette expérimentation suggère également que l isolement des lots de naissain «naïfs» pendant la période d expression des mortalités sur les secteurs devrait se traduire par un risque d infection très diminué pour ces cheptels. Phase 3 : Peut-on moduler la résistance des lots, lors de leur réintroduction sur les zones d élevage traditionnelles, par les pratiques zootechniques? Introduction Dans le contexte épidémique actuel, l isolement de lots certifiés naïfs dans des zones d élevage sanctuaires, ou des installations d élevage à terre, isolées des sources de contamination extérieures, pourrait constituer une solution d évitement de la contagion (Bilan CRH 2011). Il paraît toutefois difficilement envisageable d effectuer la totalité du cycle d élevage sur ces zones sanctuaires, qui devraient plutôt être dévolues à une sauvegarde temporaire des lots avant réintroduction sur les secteurs ostréicoles habituellement exploités. Dans ce cas, ces lots seraient de nouveaux exposés aux pathogènes après leur réintroduction, quoiqu à un âge et une taille supérieure. Un tel schéma zootechnique ne s avèrerait alors efficace qu à condition que les cheptels aient vu leur résistance améliorée pendant la période d isolement ; autrement dit, qu ils aient acquis une certaine résistance liée à l âge, à la taille, et/ou aux pratiques culturales mises en œuvre par les éleveurs. Deux facteurs d élevage paraissent facilement manipulables dans un tel parcours zootechnique. Premièrement, l accès à la nourriture des individus peut être modulé en choisissant des zones sanctuaires ou des installations d élevage, assurant un accès à la nourriture plus ou moins important. Deuxièmement, la constitution par criblage de sous-groupes d individus divergents pour la taille à partir d un cheptel initial constitue une opération couramment employée par les ostréiculteurs. Dans la mesure où certaines études menées antérieurement ont mis en évidence un effet positif de la taille sur la probabilité de survie des huîtres (Blin JL., 2011) (Le Guillois M., 2011), la sélection des individus les plus gros du lot pourrait également permettre de moduler l intensité des mortalités lors de la réintroduction des cheptels sur les secteurs d élevage traditionnels. La Phase 3 du projet ASIL visait à donc à étudier prioritairement l effet de la taille, de la croissance et de l accès à la nourriture pendant la phase d isolement sur la probabilité de survie des lots lors de leur réintroduction sur l estran, chez des individus isolés en première année d élevage.

La première expérimentation (Exp. 1) focalisait sur les effets de la taille et du conditionnement trophique sur la résistance tandis que la seconde expérimentation (Exp. 2) proposait un protocole de testage de la relation entre croissance individuelle et probabilité individuelle de survie. Méthode Exp. 1 : En début d année 2011, un lot de naissain caractérisé comme peu contaminé (3/120 individus positifs OsHV-1) par les méthodes moléculaires de diagnostic a été mis en élevage en 2011 sur le site isolé d Omonville (Figure 11). Ces huîtres ont ensuite été ramenées sur le secteur d élevage de Blainville où elles ont passé l automne. A la fin du mois de Novembre 2011, les individus ont été séparés en 3 classes de tailles (> 4 cm ; 4 cm < taille < 12 mm ; 12 mm < taille < 9 mm) par tamisage. Figure 11 : Représentation schématique des traitements expérimentaux de l expérimentation 1. Pour chacun des groupes ainsi constitués, l effectif (n 1500) a été séparé en deux parts égales avant de subir un conditionnement zootechnique assurant un accès différentiel à la ressource trophique, dans les installations expérimentales du SMEL. La première moitié de l effectif a ainsi bénéficié d un régime alimentaire assurant un apport trophique ad libitum (régime «Eutrophe») tandis que la seconde moitié ne profitait que d un apport extrêmement réduit en phytoplancton (régime «Oligotrophe»). Les 2 conditionnements ont été maintenus pendant un mois et demi (Figure 11). Cette phase de conditionnement trophique s est achevée à la mi-février 2012. Pour chacun des 6 traitements, 300 individus ont été alors répartis dans 6 poches-réplicats à raison de 50 individus par poche. Les poches ont ensuite été placées sur la concession expérimentale du SMEL situées dans la zone ostréicole de Blainville-sur-mer. Afin d assurer l homogénéité des conditions d élevage, la position des poches sur les tables a été déterminée par tirage aléatoire. Les poches ont été maintenues sur l estran entre février et octobre 2012, en assurant une manutention régulière. Une estimation des taux de survie par poche a finalement été conduite au mois d octobre, par dénombrement des individus vivants et morts par poche.

Exp. 2 : Le matériel biologique utilisé pour cette expérimentation est constitué de 250 individus prélevés dans le cheptel initial élevé en 2011 à Omonville la Rogue (nord Cotentin en eau profonde). Au mois de mars 2012, ces huîtres ont été fixées sur des plaques de contreplaqué qui ont été placées sur le secteur de Blainville (Figure 12). Ces individus ont fait l objet d un suivi longitudinal de la croissance et de la survie entre avril et août 2012, grâce à une technique couplant prise de photographies numériques et analyse d image. Figure 12 : Photographie numérique d une plaque de suivi, la miniature en haut à droite montre la même plaque, après traitement par analyse d image. Les bords externes des huîtres vivantes y apparaissent alors soulignés en jaune, les huîtres mortes sont indiquées par une croix rouge.

Résultats Exp. 1 : Tableau 5 : Résultats des tests de significativité associés au modèle logit(π mortalité ) = µ + a*taille + b*régime + c*taille x Régime ; avec π mortalité = probabilité de mortalité. Source DDL Khi² Pr > Khi² Taille 2 5,22 0,0734 Régime 1 5,24 0,0221 Taille x Régime 2 5,92 0,0517 Figure 13 : Graphique des moyennes et des erreurs-standards des taux de mortalité par traitement, et résultats des tests post-hoc (Khi²) de comparaison des groupes 2 à 2. Deux lettres différentes indiquent une différenciation détectée comme significative entre 2 groupes. Les résultats de l expérimentation 1 montrent clairement un effet de la taille et du régime de conditionnement trophique sur la probabilité de mortalité (Tableau 5 ; Figure 13). Pris ensemble, l interaction entre les effets de la taille et du régime apparaît en limite de significativité (Pr = 0,05) comme l effet de la taille (Pr = 0,07) (Tableau 5). L effet du régime apparaît par contre significatif (Pr < 0,05), avec une probabilité de mortalité nettement diminuée chez les individus soumis au conditionnement trophique «Eutrophe» comparé aux huîtres soumises au conditionnement «Oligotrophe» (Tableau 5) (Figure 13). Dans le détail, les tests post-hoc montrent une différenciation significative au sein du régime «Oligotrophe» entre les individus des 3 classes de taille (Figure 13) : les plus fortes probabilités de mortalité sont observées pour les huîtres de la classe de taille «Petite», elles surpassent significativement les probabilités de mortalité estimées pour les huîtres de la classe de taille «Moyenne» elles-mêmes significativement supérieures à celles observées pour les huîtres de la classe de taille «Grosse». Dans tous les cas, le différentiel inter-groupes reste modéré, avec des taux de mortalités moyens de 47% chez les huîtres de la classe de taille «Grosse» et 54% chez les huîtres de la classe de taille «Petite» (Figure 13).

Chez les huîtres soumises au régime de conditionnement trophique «Eutrophe», les tests post-hoc ne montrent aucune différence significative des probabilités de mortalité entre huîtres des classes de taille «Moyenne» et «Petite» (Figure 7), avec un taux de mortalité moyen de 40%. Les huîtres de la classe de taille «Grosse» soumises à ce régime de conditionnement trophique montrent quant à elles une amélioration très significative de leur probabilité de survie, pour un taux de mortalité moyen d à peine 15% (Figure 7). Exp. 2 : Figure 14 : Probabilité de mortalité par classe de croissance, pour 7 périodes d observation comprises entre mars et juillet 2012. Les résultats de l expérimentation 2 suggèrent une relation variable, globalement peu significative, entre croissance et probabilité individuelle de survie. Pour les périodes d observation comprises entre le 2 mars et 6 avril (Périodes 1 et 2) la probabilité de mortalité semblait légèrement accrue chez les huîtres présentant les meilleures croissances, quoique la tendance apparaisse nonsignificative (Figure 14). Pour la période d observation comprise entre le 6 avril et le 4 mai (Période 3), l effet de la croissance sur la mortalité apparaît très significatif (Pr < 0,001) (Figure 14). A cette période, les mortalités ont affecté uniquement les individus présentant les croissances les plus faibles. Les périodes d observation comprises entre le 4 mai et le 20 juin (Périodes 4 et 5) ont coïncidé avec des mortalités importantes dans les cheptels en élevage à l entour. Pour ce qui concerne les huîtres utilisées pour cette expérimentation, le phénomène s est également traduit par la mort de 19% de l effectif en testage. Ces mortalités semblent avoir affecté l ensemble des individus, indépendamment de leur croissance (Figure 14). Pour la période d observation comprise entre le 20 juin et le 3 juillet (Période 6), la probabilité de mortalité était, là encore, très nettement accrue chez les individus présentant les croissances les plus faibles (Pr < 0,05) (Figure 14). Enfin, les mortalités observées entre le 3 et le 23 juillet semblent avoir affecté de façon homogène les individus indépendamment de leur croissance (Figure 14).

Discussion Les résultats de la première expérimentation suggèrent que la résistance des individus de demi-élevage au phénomène infectieux s avère d autant plus forte qu ils sont de forte taille, indépendamment de leur âge. Ce résultat vient s ajouter à ceux de précédents travaux qui suggéraient une relation positive entre taille et résistance chez les individus de moins d un an (Le Guillois M., 2011) et chez les individus de ½ élevage (Blin JL., 2011). Le fort effet du conditionnement trophique, et son interaction marquée avec la taille des individus n avait, à notre connaissance, jamais été observé au cours des études précédentes. Il s est traduit par une diminution moyenne de la probabilité de mortalité de 19% chez les individus élevés dans un milieu riche en nourriture, le différentiel des taux de mortalité atteignant 31% si l on considère uniquement les individus de la classe de taille «Grosse». Ces résultats suggèrent donc qu un accès différentiel à la nourriture en période hivernale peut avoir de profondes implications pour le déterminisme de la survie chez les individus de 18 mois et plus. Les résultats de la seconde expérimentation semblent montrer que la probabilité de mortalité est globalement accrue chez les individus présentant les croissances les plus faibles, hors période de mortalité massive dans les élevages à l entour. Il est toutefois frappant de constater qu à l apex du phénomène de mortalité, aucune relation n est observée entre la croissance des individus et leur probabilité de survie. Ce résultat suggère que la virulence de l épisode de mortalité n a pas permis l expression de la relation croissance-survie observée avant, et après le pic de mortalité. Les résultats d ASIL suggèrent qu une sélection sur la taille par tamisage aura un effet relativement modéré sur l amélioration de la survie. L effet du conditionnement trophique, et son impact à long terme sur le budget énergétique des individus, semble nettement plus marqué pour le déterminisme de la survie. Ces résultats sont sans doute à rapprocher de ceux obtenus au cours d une étude récente et qui suggéraient une relation positive entre le niveau de réserve des individu et leur capacité à résister à l infection virale (Pernet et al., 2012). Il semble donc que les huîtres présentant les réserves énergétiques importantes (et, subséquemment, les meilleures croissances) bénéficient d une réponse physiologique d autant plus efficace aux stress environnementaux (incluant les infections).

Bilan de la phase 3 Les résultats suggèrent très fortement l existence d une composante physiologique impliquée dans la résistance à l épizootie. La relation positive observée entre taille et survie avait déjà été mise en évidence au cours de travaux précédents (Bilan CRH, 2011). Un accès accru à la nourriture en période hivernale semble également susceptible d améliorer très significativement la survie des individus de demi-élevage, lors de leur mise en contact avec les agents pathogènes impliqués dans les phénomènes de surmortalité. Enfin, la croissance individuelle est évidemment corrélée à la taille à la mise à l eau, et au niveau de réserve énergétique, mais ne semble pas constituer un paramètre très impliqué dans la variation des taux de survie pendant l épisode infectieux. Les protocoles basés sur l isolement des huîtres dans les sites les plus productifs possibles devraient donc permettre une amélioration sensible de la survie lors de la réintroduction des individus de demi-élevage sur les secteurs ostréicoles traditionnels. De même, l introduction préférentielle des cheptels présentant la plus forte taille possible paraît constituer un moyen efficace pour améliorer la survie.

Bilan général du projet ASIL Le projet ASIL visait à répondre à 3 questions cruciales pour envisager un scénario de gestion des surmortalités de naissain basé sur la certification du statut sanitaire des lots et l isolement des lots indemnes de pathogènes. 1 ) Peut-on évaluer l efficacité des méthodes de diagnostic du statut sanitaire des lots (lors de leur réception)? A la lumière des résultats obtenus, il semble que le couplage des outils de diagnostic (qpcr et conditionnement zootechnique) permette de détecter efficacement les lots présentant une infection latente par les pathogènes impliqués dans les surmortalités. La sensibilité des outils disponibles à l heure actuelle ne permet toutefois pas de garantir que tous les lots porteurs soient effectivement identifiés par cette méthode. Pratiquement, la mise en œuvre des procédures de diagnostic et l utilisation de lots n ayant jamais été élevés sur l estran pendant la période de surmortalité constituent 2 solutions pour limiter le risque d introduction des agents infectieux dans les zones et installations d élevage jusque-là indemnes. 2 ) Peut-on définir les périodes au cours desquelles s effectue la contagion? Les résultats de la phase 2 du projet suggèrent que la contamination des lots indemnes s effectue sur l estran, lorsque les conditions de l environnement (qui dépendent du site) induisent l expression de la maladie et de la mortalité chez les lots à l entour. Le fait qu aucune contagion ne soit observée hors période de mortalité, alors que de nombreuses huîtres porteuses des pathogènes se trouvent en élevage à proximité, constitue un élément encourageant pour l application en situation de production d un scénario d élevage basé sur l isolement des lots. L étude des sources de contagion telle qu elle a été menée dans le projet GIGAVIR (Jouaux A. et al., 2011) et sera poursuivie dans le projet JUPITER (porté par le SMEL en 2013) devrait permettre de confirmer le caractère «non-contagieux» de l environnement d élevage hors période de mortalité. Si ce point est confirmé, l isolement des lots indemnes pourrait alors être réduit à une mesure de confinement transitoire, limitée à la période d expression des mortalités sur les secteurs ostréicoles. 3 ) Peut-on moduler la résistance des lots, lors de leur réintroduction sur les zones d élevage traditionnelles, par les pratiques zootechniques? Nos résultats suggèrent que les pratiques zootechniques employées pendant la période d isolement des lots permettent ensuite d influer fortement sur la survie de ces mêmes lots lors de leur réintroduction ultérieure sur les zones d élevage. Des pratiques d élevage favorisant l accès à la nourriture (élevage à faible densité par poche, dans les secteurs les plus productifs possibles, ), et le choix préférentiel d individus les plus gros possibles devraient permettre un gain très significatif de survie ; à l issue de la deuxième année d élevage. Références citées Bilan 2011 des travaux du Centre de Référence sur l Huître, 93 pp. Blin JL., 2011. Impact des pratiques culturales sur l optimisation de la survie du naissain d huître Crassostrea gigas. Bilan 2011 des travaux du Centre de Référence sur l Huître, 93 pp.

Houssin M., Martenot C., 2011. Suivi des mortalités des naissains et étude des mécanismes d infectiosité du virus OsHV-1. Bilan 2011 des travaux du Centre de Référence sur l Huître, 93 pp. Jouaux A., Lelong C., Mathieu M. 2011. Programme GIGAVIR. Bilan 2011 des travaux du Centre de Référence sur l Huître, 93 pp. Le Guillois M., 2011. Evolution de la mortalité du naissain d écloserie diploïde entre 1993 et 2009. Bilan 2011 des travaux du Centre de Référence sur l Huître, 93 pp. Martenot C., Oden E., Travaillé E., Malas JP., Houssin M., 2012. Comparison of two real-time PCR methods for detection of otreid herpesvirus 1 in the Pacific oyster Crassostrea gigas. Journal of Virological Methods 170: 86-89. Pernet F., Barret J., Le Gall P., Corporeau C., Dégremon L., Lagarde F., Pépin JF., Keck N., 2012. Mass mortalities of Pacific oysters Crassostrea gigas reflect infectious diseases and vary with farming practices in the Mediterranean Thau lagoon, France. Aquaculture Environment Interactions, 2:215-237. Petton B., Pernet F., in prep. Synthèse des expériences menées sur le déterminisme des mortalités d huîtres creuses Crassostrea gigas à Argenton entre 2010 et 2012. Samain JF., Dégremont L., Soletchnik P., Haure J., Bédier E., Ropert M., Moal J., Huvet A., Bacca H., Van Wormhoudt A., Delaporte M., Costil K., Pouvreau S., Lambert C., Boulo V., Soudant P., Nicolas JL., Le Roux F., Renault T., Gagnaire B., Géret F., Boutet I., Burgeot T., Boudry P., 2007. Genetically based resistance to summer mortality in the Pacific oyster (Crassostrea gigas) and its relationship with physiological, immunological characteristics and infection process. Aquaculture, 268: 227-243.

Programme Portbail Coordinateur : Maryline Houssin (maryline.houssin@calvados.fr) Partenaire : LFD, Smel, CRC Normandie

Objectifs La meilleure connaissance des mécanismes d actions des pathogènes et en particulier de l herpès virus OsHV1 en lien avec les variations de l environnement (la température) et/ou la physiologie des huîtres est un des objectifs du CRH. La présence d herpès virus dans un secteur ostréicole donné peut être due : - à des arrivées extérieures de naissain contenant ce pathogène (contamination d huîtres saines par des huîtres fortement contaminées : transmission horizontale), ou par un effet réservoir (présence du virus dans l environnement et/ou dans les huîtres adultes) - à une contamination initiale de l huître puis déclenchement du mécanisme de prolifération lors d un stress estival. Cette étude va permettre d aborder la compréhension des mécanismes d infectiosité du virus en réalisant la traçabilité de lots initialement contrôlés (lots de naissain dits «propres») avant mise à l eau dans un site préalablement contrôlé. Ce contrôle sera réalisé du mois de septembre jusqu à l arrêt des transferts par une technique de biologie moléculaire (PCR taqman) développée au LFD (Martenot, et al. 2010). Une fois mis sur parcs, ces lots seront contrôlés mensuellement afin de suivre l évolution de la charge virale au cours du temps. Au-delà de l objectif d acquisition de connaissances, le but est de savoir si une telle expérience permettra de réduire les taux de mortalité et ainsi de montrer l intérêt d une certification du naissain à une échelle professionnelle. Cette expérience apportera également des éléments sur la mesure d interdiction d immersion mise en place en Basse-Normandie pendant la période à risque. Protocoles Pour la conduite de l expérimentation, le site d accueil des naissains ne doit pas être fortement contaminé (<40 000UG/50mg de tissus). En effet le LFD a montré que le dépassement d un seuil de 440 000 copies virus pour 50 mg de chair conduit à des mortalités importantes pour le lot concerné (Oden, et al. 2010). Afin de mesurer véritablement l impact d une telle mesure, il convient que pour les lots entrants dans le secteur concerné, la charge virale soit la plus faible possible au regard de la capacité de multiplication de ces pathogènes. Le seuil de mesure garanti par la méthode développée au LFD correspond à 300 copies de virus. Sur l ensemble des mesures réalisées par ce laboratoire sur des lots entrants en Basse-Normandie hors période d interdiction d immersion (de début mai à fin août), 63% des lots présentaient une charge virale inférieure à 300 copies de virus. Dans ces lots, les lots issus du captage naturel et les lots issus d écloseries étaient présents en même ratio. Aussi dans le cadre de cette expérimentation, seuls les lots contenant une charge virale inférieure à 300 copies seront mis sur le site. Afin de compléter l expertise des lots entrants, le SMEL réalisera sur un certain nombre d échantillons un challenge thermique, test mis au point par l IFREMER et transféré au SMEL. Ce challenge test vise à augmenter en milieu contrôlé la température de l eau afin de suivre l évolution des mortalités des huîtres pendant un mois. Cependant les résultats de ce challenge thermique ne conditionneront pas l entrée des lots dans le secteur (seule l analyse virale par biologie moléculaire fera foi). Cette démarche pourra se dérouler sur trois ans (un cycle de production) pour «assainir» le secteur et voir l effet produit sur les mortalités.

Pour une garantie de la réussite du projet, il convient notamment que le site choisi : - ne soit pas trop important (peu de concessionnaires et surfaces limitées), - soit suffisamment éloigné des autres sites d élevage pour éviter une contamination, - présente toutes les classes d âge d huîtres (expérience avec du naissain seul a déjà été réalisée), - soit constitué de professionnels prêts à s impliquer dans la démarche (la défaillance d un seul ostréiculteur ruinerait l expérimentation). Résultats et discussion Les sites ostréicoles de St Rémy des Landes à St Georges la Rivière ont été pressentis pour cette expérimentation. Treize ostréiculteurs exploitent des concessions sur ces deux sites. Un état des lieux de la charge virale des sites accueillant les lots certifiés a été réalisé le 29 août 2011. Sur St-Georges-de-la-Rivière, 12 lots d huîtres adultes ont été analysés. Tous ces lots avaient une charge inférieure au seuil de détection. Il a été possible de déposer du naissain sur ce site à partir du 1er septembre. Par contre sur le site de St-Rémy-des-Landes il a fallu attendre le mois de janvier pour pouvoir commencer l expérimentation. I Chronologie de l étude Certification des lots Entre le 1 er septembre 2011 et le 3 mai 2012, 32 lots ont été contrôlés (24 lots de naissains, 4 lots de juvéniles, et 4 lots d adultes). Suite à ces contrôles, 17 lots ont pu être placés sur les parcs (Tableau 1). Tableau 1 : caractérisation des lots mis sur estran Info ponte Ploïdie Mise en place sur site 1 captage naturel Août 2011 D 03/05/2012 2 captage naturel Août 2011 D 03/05/2012 3 microbrisures télécaptage 2011 à Lestre 1er mai 2011 T 13/10/2011 4 microbrisure télécaptage 2011 à Lestre T4 1er mai 2011 T 27/11/2012 5 télécaptage GT maille de 4 déb juillet 2011 D 13/10/2011 6 télécaptage GT maille de 7 déb juillet 2011 D 13/10/2011 7 télécaptage GT maille de 4 août 2011 T 13/10/2011 8 microbrisures télécaptage 2010 à Lestre T 02/09/2011 9 lame télécaptage 2011 à Lestre 1er avril 2011 T 26/10/2011 10 lame télécaptage 2011 T4 à Lestre 1er avril 2011 T 27/11/2011 11 écloserie France Turbot T4 Sept. 2011 D 05/04/2012 12 écloserie France naissain T6 2 poche 6000/kg 7 juin 2011 T 27/10/2011 13 écloserie GraineOcéanT4 1 poche 23000/kg 28 juil. 2011 T 24/10/2011 14 écloserie TA 2011 T 24/04/2012 15 écloserie Oléron T6 - T 05/04/2012 16 écloserie France Turbot T4 Sept 2011 T 05/04/2012 17 écloserie France Turbot D 20/03/2012 T : Triploïde, D : Diploïde Sur le site de St-Georges la Rivière, 13 lots (1 à 13) certifiés contenant moins de 300UG/50mg de tissus ont été déposés entre le 1 er septembre et le 3 mai (Tableau 1). Cinq de ces lots ont subi en plus un challenge test dans les locaux du SMEL. Il s agissait de cinq lots de télécaptage, provenant de deux établissements différents avec des pontes différentes et de ploïdies différentes. Ce

challenge a eu lieu mi octobre à mi novembre et n a pas révélé la présence de virus dans ces lots. Sur le site de St-Rémy des Landes, 4 lots (14 à 17) ont été mis en place entre le 20 mars et le 5 avril. Suivi mensuel des lots Chaque mois ces lots ont été contrôlés jusqu au 9 mai et aucune charge virale n a été détectée. Le 31 mai, les premières mortalités ont été observées sur la côte Ouest du Cotentin. Cette date coïncide avec le premier déclenchement REPAMO sur cette côte. Dés le 2 juin, le site expérimental a été contrôlé quotidiennement afin d observer d éventuelles mortalités. Des prélèvements d eau ont également été réalisés à marée basse. Le 3 juin une mortalité sur le lot 15 a été observée ainsi qu une observation de bruit anormal (bruit de coquilles vides caractéristique lors d une mortalité d huîtres) sur le lot 14 (lots situés sur le site le plus au Sud de l expérimentation). Des analyses ont été réalisées sur ces lots et les charges virales étaient respectivement de 20 000 copies de virus et absence de virus/50mg tissus. Le 4 juin 2012, date du prélèvement mensuel, tous les lots ont été prélevés. Deux nouveaux lots (lots 1 et 2) subissaient des mortalités (concessions placées plus au sud du site de St George de la Rivière). Par contre il n y a pas eu d observation de mortalités dans le lot 14 qui montrait un bruit anormal la veille. Les charges virales obtenues dans les lots 15, 1 et 2 confirment bien que les mortalités observées sont associées à une quantité importante de virus (Figure 1). Figure 1 : Charges virales (exprimées en Log10) des lots déposés sur les sites de l étude au 4 juin 2012. Les histogrammes représentent les lots placés du Sud au Nord de l étude. 15 jours plus tard deux autres lots étaient atteints sur le site plus au nord de l étude (les lots 4 et 10). Un mois plus tard, les lots 17, 6, 7,9 et 11 étaient touchés par des mortalités. Les charges virales de ces lots confirmaient bien que les mortalités observées étaient dues au virus. Six semaines plus tard tous les lots avaient subi des mortalités sauf deux lots (lot 8 et 14) qui étaient des lots de juvéniles. Il semble que la contamination se soit déroulée du Sud vers le Nord du site. Certains lots ont subi deux vagues de mortalités. En effet la charge virale sur les deux sites a de nouveau été importante vers le 20 août 2012 et des mortalités ont de nouveau été observées (Figure 2).

Figure 2 : Charges virales (exprimées en Log10) des lots déposés sur les sites de l étude au 12 novembre 2012. Les histogrammes représentent les lots placés du Sud au Nord de l étude. Taux de mortalité Les naissains ont tous subi des surmortalités comprises entre 36 et 83,4 % contrairement aux lots de juvéniles (Figure 3). Figure 3 : Pourcentage de mortalités des lots (en bleu : lots de naissains, en rose : lots de juvéniles) Six lots ont eu des mortalités supérieures à 80% (lots 17, 1, 2, 3, 4 et 5), lots regroupés dans une même zone. Les lots 1 et 2 font partis des lots qui ont subi des mortalités dès le 4 juin. Les 4 et 5 ont subi des mortalités 15 jours plus tard, le lot 17 un mois plus tard et le lot 3 six semaines plus tard. Nous avons essayé de voir s il y avait une relation entre un taux élevé de surmortalité et la provenance ou la ploïdie du naissain. Il ne semble pas y avoir de relation entre ces deux paramètres, en effet les lots 1 et 2 sont des lots provenant de captages naturels donc ce sont des animaux diploïdes, le lot 17 est un lot de diploïde d écloserie et les trois autres sont des lots de triploïdes ou de diploïdes de télécaptage. De même nous avons étudié si l impact des surmortalités pouvait avoir une relation avec l âge du naissain ainsi que sa date de mise en dépôt (incidence des saisons). Sur les six lots ayant des surmortalités supérieures à 80%, deux ont été déposés mi octobre, un autre a été déposé fin novembre, le quatrième mi mars et les deux derniers début mai. La date de dépôt ne semble pas influencer la surmortalité des naissains. Au 4 juin 2012, les naissains mis sur parc avaient entre 9 et 14 mois. Nous avons observé des

mortalités à plus de 80% chez des naissains de 13, 11 et 10 mois. Mais nous avons aussi observés des mortalités inférieures à 42% chez des naissains ayant 14, 12 ou 9 mois. L âge du naissain ne semble donc pas avoir d incidence sur les surmortalités. Les deux lots de juvéniles (lots 8 et 14) sont des huîtres qui n ont pas ou peu subi de surmortalités, les taux de mortalité ont été de 0% et 14% respectivement. Les charges de ces lots n ont jamais dépassé le seuil critique de 440 000 particules virales. Pour le lot 8, la date où l échantillon a été le plus chargé en virus correspond à la date de la première observation de mortalité sur le site c est-àdire le 4 juin 2012. II Origine de la contamination? Rôle des juvéniles Le 6 juin 2012, des prélèvements supplémentaires (cinq lots d adultes ou de juvéniles) prélevés autours des individus qui subissaient des mortalités ont été réalisés. Les résultats des analyses montraient que deux lots ne contenaient pas de virus et trois lots avaient des charges de 790, 1600, 2500 virus/50mg de tissus. Les charges virales sont faibles mais cela ne prouvent pas que ces individus ne soient pas vecteurs de contaminations. Par contre, nous avons observé sur le site de Saint Georges de la Rivière que les taux de mortalités des naissains qui étaient placés au Nord par rapport aux juvéniles étaient moins élevés que ceux placés au Sud (Figure 4). Les juvéniles semblent avoir formé comme une barrière à la transmission du virus. Cette hypothèse peut être expliquée par le fait que les juvéniles sont de plus gros filtreurs que les naissains et lors de la propagation du virus celui ci se trouve filtré par les juvéniles. Le laps de temps où ils sont bloqués, permet peut-être la décroissance de la virulence des particules virales. Figure 4 : Pourcentage des mortalités des lots du site de Saint Georges de la Rivière. Les lots sont placés géographiquement du Sud vers le Nord (en bleu : lots de naissain, en rose : lots de juvéniles) Rôle de l eau Dès le 2 juin, des prélèvements d eau ont été réalisés sur le Site de Saint Rémy des Landes (site le plus au Sud de l expérimentation). Ces prélèvements ont été réalisés à marée basse en même temps que le contrôle des poches. Le 2 juin aucune charge virale n a été détectée dans l échantillon prélevé. Le 3 juin 36 000 particules virales/l ont été détectées sur le site. Le prélèvement du 3 juin a été réalisé à proximité de l échantillon qui subissait des mortalités, la charge de l échantillon d huître était de 20 000 particules virales. Le 4 juin, la charge virale de l eau était du même ordre de grandeur (13 000UG/L) alors que la charge dans les huîtres étaient passée à plus de 6 milliards.

Quelque soit la contamination des huîtres, qu elle soit faible (20 000 virus) ou forte (6 milliards de virus), la contamination virale de l eau semble constante (environ 4,4 Log). Il est difficile de savoir laquelle des deux matrices a contaminé l autre en premier. Contamination initiale des huîtres Lors de cette étude, le critère d acceptation des lots pour la mise sur parc était une contenance en charge virale inférieure à 300 virus/50mg de tissus. Nous pensions que ce seuil serait suffisant pour empêcher le démarrage spontané de la virose dans les lots. Sur les 17 lots acceptés deux lots (lot 15 et 1) n étaient pas indemne de virus. Sur les dix analyses réalisaient au cours de la certification sur le lot 15, l une des analyses montrait la présence de 100 virus et sur le lot 1, sur une des dix analyses, 210 virus ont été détectés. Cette faible charge virale peut être responsable du déclenchement d une virose car ces deux lots ont été placés dans la partie plus au Sud de cette expérimentation, lieu où la contamination a démarré. Respect du protocole Un autre facteur de risque de cette étude terrain était le respect strict du protocole par les ostréiculteurs. Un lot de naissain a été introduit sans certification. Ce naissain a été rapidement retiré et analysé. Après analyse nous avons montré que sur les dix analyses trois contenaient une charge virale de l ordre de 1500 virus. Une seconde fois, l ostréiculteur a fait certifier son lot, mais au rendu de résultat (toutes les analyses avaient une charge de l ordre de 500 virus), il a pris la décision de déposer ces huîtres sur le site expérimental. Ce dépôt a été réalisé entre le 10 mai et le 2 juin 2012 et sur la partie la plus au Sud de l étude. Bilan Cette étude a été réalisée sur deux sites ostréicoles allant de St Rémy des Landes à St Georges la Rivière. Sur ces deux sites, 17 échantillons ont été certifiés et ont été mis à l eau car ils contenaient une charge virale inférieure à 300UG/50mg de tissus analysés. Chaque mois ces lots ont été contrôlés et jusqu au 9 mai aucune charge virale n a été détectée. Les premières charges virales ont été observées dans tous ces lots le 4 juin 2012 en même temps que l observation sur trois lots de mortalités. Puis, tous les naissains ont subi des surmortalités comprises entre 36 et 84%. Des résultats, il semblerait que le taux de mortalité ne soit pas en relation avec la provenance du naissain (naissain de captage naturel ou d écloserie) ni de la ploïdie de ces lots. De même il ne semble pas y avoir de relation entre les fortes mortalités et la date de mise en dépôt (dépôt automnal ou printanier). Bilan général Le premier objectif de cette expérience était de mieux comprendre le mécanisme de contamination des lots (contamination horizontale, vecteurs environnementaux ou contamination verticale). Le second objectif était de montrer que la certification des lots avant mise sur l estran pouvait réduire les taux de mortalité et ainsi montrer l intérêt d une certification du naissain à une

échelle professionnelle. Cette année nous ne pouvons pas répondre à ces deux objectifs pour différentes raisons : - la contamination par l eau n a pu être démontrée (manque d échantillonnages) - le protocole n a pas été respecté par l un des ostréiculteurs - le critère d acceptation des lots était certainement trop haut Perspectives et projets 2013 Dans le projet Portbail 2013, nous nous proposons de réaliser une certification sur un plus grand nombre d individus. 100 individus seront contrôlés (20 pool de 5 individus) au lieu de 50 lors de la première étude. Lors de la première étude nous nous étions fixé un critère de moins de 300UG/50mg comme autorisation pour mise à l eau. Deux lots parmi les 17 présentaient une charge virale aux alentours de 200UG/50mg. Cette faible charge a peut-être été responsable du déclenchement de la virose. Nous allons donc baisser ce critère d autorisation de mise à l eau à l absence de détection virale. Tous ces lots seront analysés par un second test (challenge test) via le SMEL, mais seul le résultat du test de biologie moléculaire déterminera la mise en place des lots sur site. Suite au souci de non respect du protocole par un des ostréiculteurs du site de Saint Rémy des Landes, cette année l étude sera réalisée sur un seul site (St Georges la Rivière). Au vu des premiers résultats de la précédente étude, nous suivrons la croissance de chaque lot en contrôlant mensuellement la taille des huîtres. Pour ceci une poche sera dédiée à ce suivi pour chaque lot. De même nous nous proposons de séparer chaque lot de naissain entrant par des lots de juvéniles, afin d observer si les juvéniles ne jouent pas un rôle de filtreurs et par ce fait ralentiraient la prolifération du virus de poche en poche. Bibliographie Martenot, C., E. Oden, E.Travaillé, J. P. Malas and M. Houssin. 2010. Comparison of two realtime PCR methods for detection of ostreid herpesvirus 1 in the Pacific oyster Crassostrea gigas. J. Virol. Methods. 170: 87-90. E. Oden, C. Martenot, M. Berthaux, E. Travaillé, J.P. Malas, M. Houssin. 2011. Quantification of ostreid herpesvirus 1 (OsHV-1) in Crassostrea gigas by real-time PCR: Determination of a viral load threshold to prevent summer mortalities. Aquaculture 317 : 27-31.

Programme CFPPA Etude de la mortalité de naissain "naïf" en 1 ère et 2 ème année pendant et après isolement en bassin ou en site "sanctuaire". Michel LE GUILLOIS Mary claude GASTEBOIS CFPPA de Coutances Lycée agricole de Coutances Partenaires: Université de CAEN LMA LFD SMEL Aude Jouaux, Michel Mathieu Isabelle Roblin, Yann Robert, Christophe Mahé Maryline Houssin Jean Louis Blin

Cadre général de cette étude. Dans le cadre de sa collaboration au sein du CRH, le CFPPA met en oeuvre des programmes de recherche à caractère zootechnique dans le but de proposer aux professionnels des pratiques culturales qui leur permettront d'améliorer le taux de survie de leur naissain. Le CFPPA possède une solide expérience dans la recherche de solutions techniques contre les mortalités estivales avec un nombre important de résultats accumulés depuis 1995. L'optimisation de sa technique de prégrossissement post-télécaptage et l'utilisation de l'isolement lui ont permis de continuer à produire du naissain par télécaptage après "l'apparition" du phénomène de mortalité estivale en 1995. Face aux surmortalités de naissain particulièrement aiguës depuis 2008, la nécessité de proposer des solutions techniques pouvant être mises en place par le plus grand nombre de professionnels normands est apparue comme une des priorités des travaux du CRH. La sélection de souches "résistantes", pour être efficace, doit être accompagnée d'une remise en cause de certaines pratiques culturales actuelles et de la mise en place de solutions zootechniques nouvelles. Etat des lieux En 1996, le CFPPA a maintenu des naissains en bassin pendant toute la période de mortalité estivale et a constaté que les lots maintenus en bassin l'été, puis passés plus tardivement en mer étaient ceux qui avaient subi le moins de mortalité. A partir de cette date, le CFPPA a systématiquement pratiqué l'isolement en bassin de ses lots de naissain d'écloserie pendant tout ou partie de l'été jusqu'à ce que les animaux atteignent un poids unitaire moyen de 0,5 g et a ainsi amélioré le taux de survie lors du passage en mer. A partir de 2008, où l'on observe une amplification importante des mortalités estivales, le CFPPA a constaté qu'un poids unitaire moyen de 0,5g ne suffisait plus pour mettre le naissain à l'abri d'une surmortalité lors du passage en mer. Dès 2009, le CFPPA a mis en route un programme d'étude de l'impact de l'isolement en bassin sur le taux de survie, et a effectué un suivi de chaque lot de naissain pendant deux années consécutives. Le constat est le suivant: - Les naissains sont protégés pendant la phase d'isolement, puis ils subissent des mortalités lorsqu'ils sont remis sur les parcs d'élevage, dès l'automne de la première année et/ou au cours de l'été suivant. - Leur taux de survie au terme de la seconde année est proportionnel à leur poids unitaire moyen en fin de phase d'isolement, au moment où ils sont mis en élevage sur parc. Objectif de cette étude Le CFPPA a donc proposé au cours de cette étude de : Tester plusieurs sites d'isolement ayant des potentiels de croissance différents dont un site en mer ouverte afin de vérifier que l effet additif ISOLEMENT + CROISSANCE en première année permet bien d'obtenir en fin de seconde année une amélioration importante du taux de survie de l'ensemble d'un lot de naissain.

Protocole Cette étude utilise le naissain du programme GIGAVIR 2011. Il s'agit de naissain d'écloserie diploïde T6 provenant de chez France Naissain et sorti directement de nurserie. Son poids unitaire est de 0,19 g. Ce lot a tout d'abord été mis en balnéation au SMEL. Pour la "caractérisation exempt de virus" de départ, l'analyse d'un nombre important d'animaux a été réalisée et validée par challenge thermique. Seulement 2,5% des animaux sont positifs à l'oshv-1 mais avec des charges inférieurs à 1 000 UG / 50 mg de tissu (LFD). De plus à la suite du challenge thermique, aucune augmentation de charge virale au delà de 440 000 UG /50 mg de chair défini par le LFD n'a été détectée et aucune mortalité n'a été observée. Ce lot de naissain a donc été caractérisé de "naïf" (Centre de référence sur l'huître, bilan 2011, Programme GIGAVIR partie 1). Vingt pour cent de ce lot de naissain a été aussitôt pris en charge par le SMEL et une partie a été mise rapidement en élevage sur un parc ostréicole situé à Blainville sur mer, ces animaux servant de lot témoin SM. Le reste du lot a ensuite été transféré le 14/04/11 en structure de prégrossissement dans le bassin du CFPPA situé à la CABANOR. *Un lot de 10 000 unités est maintenu en prégrossissement au CFPPA. Une partie sera passée sur le parc du CFPPA à Blainville sur mer le 20/07/11 Une partie sera passée sur le parc du CFPPA à Blainville sur mer le 16/09/11 Le reste sera passé sur le parc du CFPPA à Blainville sur mer le 14/10/11 CF1. CF2. CF3. *Un lot de 10 000 unités est fourni au LMA le 21/04/11 et sera installé dans leur structure de prégrossissement tout l'été LM. *Un lot de 10 000 unités est fourni à l'université le 17/05/11 pour être installé sur le parc sanctuaire de Cricqueville en Bessin. Ce lot sera trié, compté et pesé sur site le 12/10/11 et réparti de la façon suivante: Une partie est maintenue sur le parc de Cricqueville en Bessin CR1. Une partie est transférée sur le parc du CFPPA à Blainville sur mer CR2. Une partie est transférée sur le parc du LMA à Morsalines CR3. *Un lot a été fourni au Laboratoire Frank Duncombe (LFD) pour être réparti sur différents sites ostréicoles francais. Lingreville sur mer le 18/04/11 LF1 Géfosses le 20/04/11 LF2 Cap Ferret le 21/04/11 LF3 Ile St Riom le 04/05/11 LF4 Les lots qui ont été suivis par le CFPPA (CF1- CF2 - CF3 - CR2) sont travaillés de la façon suivante: - A la mise en poche. Tri par taille (criblage), comptage, taux de mortalité, pesée, mise en poche par catégorie de taille (pour certaines poches, toutes les mortes sont enlevées et les vivantes sont comptées une par une). - En fin d'étude (décembre 2012) Pour chaque catégorie de taille les opérations suivantes sont réalisées: - Tri vivantes mortes, comptage des mortes. - Tri par la taille des vivantes et pour chaque catégorie de taille, comptage et pesée. Remarques:

Le nombre réel d'animaux morts est obtenu en soustrayant le nombre de survivants au nombre d'animaux vivants mis initialement dans la poche. Cette méthode présente l'avantage de pouvoir prendre en compte les animaux morts dont la coquille a disparu suite au broyage par le déplacement des animaux survivants à l'intérieur de la poche. Il faut savoir que lorsque la mortalité se produit sur des animaux de petite taille (T4, T6, T9), un grand nombre de coquilles vides (très fragiles à cette taille) sont très rapidement émiettées par le mouvement des survivantes dans la poche et disparaissent tout simplement. Cela rend donc impossible la détermination du nombre réel d'huîtres mortes si l'on procède par comptage des coquilles vides. Cette erreur est fréquente chez de nombreux ostréiculteurs qui déterminent le taux de mortalité par énumération des coquilles vides et de ce fait les résultats de mortalité annoncés par les professionnels sont très souvent en dessous de la réalité. Résultats et discussion En ce qui concerne les taux de mortalité constatés au 14 octobre 2011 (1 ère année) Cette date correspond à la fin de la période d'isolement pour les lots suivants: Le lot CF3 représentant une très grande partie des naissains du lot CFPPA, les lots CR2 et CR3 représentant les 2/3 du lot mis à Cricqueville en Bessin et le lot LM représentant l'intégralité du lot confié au LMA. Comme on peut le constater sur l'histogramme ci dessous (figure 1), la différence est très marquée entre tous les lots isolés (en vert) et les lots qui ont été mis en élevage sur sites ostréicoles dès le printemps (en bleu), les lots isolés ayant tous un taux de mortalité inférieur à 5%. Les lots passés sur site ostréicole quant à eux présentent des différences importantes (flèches). Deux sites se démarquent, Géfosses LF2 pour sa mortalité faible de 23,5% et l'ile St Riom LF4 pour sa mortalité très élevée de 82%.

Figure 1 : Taux de mortalités suivant les différents sites (au 14/10/11) (SM : Lot témoin, CABANOR ; LM : Lot au LMA ; CR1 : Lot laissé à Cricquevilles ; CR2 : Lot de Cricqueville mis au CFPPA Blainville au 10/11 ; CR3 : Lot de Cricqueville mis à Morsalines au 10/11 ; CF1, 2 et 3 : Lot du CFPPA mis à Blainville respectivement en 07/11, 09/11 et 10/11 ; Lots du LFD mis à Lingrevilles (LF1), à Géfosses (CF2), Cap Ferret (CF3) et à l Ile de St Riom (CF4) au 04/11 et 05/11). En ce qui concerne les taux de mortalités cumulées sur la 1 ère et 2 ème année Les résultats de mortalités cumulées sur les deux années sont présentés sur la figure 2 ci-dessous (en violet, mortalité en 2 ème année ; en bleu : mortalité de la 1 ère année ; en vert : mortalité sur les sites isolés en 1 ère et 2 ème année). Figure 2 : Taux de mortalités cumulées suivant les différents sites (au 14/10/11) (SM : Lot témoin, CABANOR ; LM : Lot au LMA ; CR1 : Lot laissé à Cricqueville ; CR2 : Lot de Cricqueville mis au CFPPA Blainville au 10/11 ; CR3 : Lot de Cricqueville mis à Morsalines au 10/11 ; CF1, 2 et 3 : Lot du CFPPA mis à Blainville respectivement en 07/11, 09/11 et 10/11 ; Lots du LFD mis à Lingrevilles (LF1), à Géfosses (CF2), Cap Ferret (CF3) et à l Ile de St Riom (CF4) au 04/11 et 05/11). L'analyse de ces résultats permet de faire le constat suivant: 1 Les animaux isolés remis en mer sur site ostréicole contaminé en fin d'été (CF2, CF3, CR2) présentent tous une mortalité globale sur deux ans supérieure à 20%, inférieure à la mortalité globale des lots qui avaient été passés directement (SM, LF1, LF2, LF3, LF4) ou très tôt (CF1) sur site ostréicole contaminé. 2 Le lot qui avait été isolé sur le site sanctuaire de Cricqueville et qui a été remis sur site ostréicole contaminé de Blainville CR2 présente un taux de mortalité faible en fin de 2 année (23,1%), plus faible que celui qui avait été isolé tout l'été dans le bassin du CFPPA CF3 (37,1%).

3 Le lot qui a été maintenu sur le site sanctuaire de Cricqueville ne subit pas de surmortalité, puisqu'au terme de la seconde année sa mortalité cumulée sur deux ans est inférieure à 7%. Conclusions sur l effet isolement et sites: - L'isolement au cours du 1 er été permet donc un gain de survie significatif et durable. - L'isolement sur un site sanctuaire est plus efficace que l'isolement en bassin. - Le maintien en isolement permet de réduire considérablement le phénomène de surmortalité. D'où provient la différence entre l'isolement en bassin et l'isolement sur site sanctuaire? Le taux de mortalité des 4 lots isolés est différent: CF1 49,8% - CF2 42% - CF3 37,5% et CR2 23,1%, le taux de mortalité du lot CR2 (isolé à Cricqueville) étant nettement inférieur à celui des autres lots. Lors de la mise sur parc de ces lots à Blainville nous avons constaté que le lot de Cricqueville CR2 présentait un poids unitaire moyen supérieur aux lots isolés en bassin du CFPPA. Le suivi détaillé des lots qui avaient été isolés en bassin puis mis sur parc à Blainville (CF1, CF2, CF3) et du lot isolé à Cricqueville puis remis à Blainville (CR2) permet d'apporter une explication. * Suivi détaillé du lot CF1 (passé sur parc le 20/07/11) (figure 3) Avant la mise en poche et le passage sur parc, le naissain a été trié par la taille et séparé en 2 lots: CF1-0,4 de poids unitaire moyen 0,4g, CF1-0,7 de poids unitaire moyen 0,7g. Figure 3: Taux de mortalité cumulée sur 2 ans du lot CF1 (Lot CFPPA passé en parc au 07/11) * Suivi détaillé du lot CF2 (passé sur parc le 16/09/11) (figure 4) Avant la mise en poche et le passage sur parc, le naissain a été trié par la taille et séparé en 2 lots: CF2-0,4 de poids unitaire moyen 0,4g, CF2-2 de poids unitaire moyen 2g.

Figure 4: Taux de mortalité cumulée sur 2 ans du lot CF1 (Lot CFPPA passé en parc au 09/11) * Suivi détaillé du lot CF3 (passé sur parc le 14/10/11) (Figure 5) Avant la mise en poche et le passage sur parc, le naissain a été trié par la taille et séparé en 3 lots: CF3-0,4 de poids unitaire moyen 0,4g, CF3-0,7 de poids unitaire moyen 0,7g et CF3-1,3 de poids unitaire moyen 1,3g. Figure 5: Taux de mortalité cumulée sur 2 ans du lot CF1 (Lot CFPPA passé en parc au 10/11) * Suivi détaillé du lot CR2 (passé sur parc le 14/10/11) (figure 6) Avant la mise en poche et le passage sur parc, le naissain a été trié par la taille et séparé en 4 lots: CR2-1,6 de poids unitaire moyen 1,6g, CR2-3,2 de poids unitaire moyen 3,2g, CR2-5,4 de poids unitaire moyen 5,4 g et CR2-8,5 de poids unitaire moyen 8,5g. Figure 6: Taux de mortalité cumulée sur 2 ans du lot CR2 (Lot isolé à Cricqueville et passé en parc au 10/11)

Les résultats présentés mettent en évidence la corrélation poids unitaire - mortalité. Sur la figure 6, on voit qu'au delà de 3,2 g le taux de mortalité ne baisse plus et suppose qu il existerait une valeur plancher pour le taux de mortalité. Conclusion sur la relation poids unitaire moyen et mortalité Il semble exister une corrélation négative entre le poids unitaire moyen et le taux de mortalité à 2 ans. Le lot CR2 (isolé à Cricqueville) constitué à 74% d'animaux dont le poids unitaire moyen est égal ou supérieur à 3,2g présente un taux de mortalité plus faible que le lot isolé dans le bassin du CFPPA (poids unitaire moyen inférieur à 2g).

Relation Poids unitaire moyen-mortalité La figure 7 présente le taux de mortalité de l'ensemble des lots CF3 et CR2 en fonction de leur poids unitaire moyen. Tous ces lots ont été isolés puis mis en élevage sur le parc ostréicole du CFPPA à Blainville sur mer, au même âge et à la même date. Figure 7: Taux de mortalité cumulée du lot de naissain isolé en bassin du CFPPA (losanges bleus) et du lot de naissain isolé à Cricqueville (ronds jaunes) à la fin de l année 2012, en fonction de leur poids unitaire moyen lors de la mise en élevage sur le parc ostréicole du CFPPA à Blainville sur mer. Cette figure met bien en évidence la corrélation existant entre le taux de mortalité et le poids unitaire moyen des naissains lors de la mise élevage sur site ostréicole contaminé. Le suivi d'un lot de naissain au cours de sa 2 ème année 2011, nous avait fourni des résultats donnant une courbe de même tendance (Centre de référence sur l'huître, bilan 2011, Michel Le Guillois étude de l'effet isolement en bassin, relation avec la taille et/ou l'âge des naissains). Cette figure semble également montrer une valeur plancher aux alentours de 3 à 4 grammes pour ce lot de naissain, au delà de laquelle le taux de mortalité ne baisse plus. Pour confirmer si cette relation s'applique aussi aux naissains qui avaient été mis directement en mer, en Normandie sans phase d'isolement, le taux de mortalité en fonction du poids unitaire moyen a été indiqué sur la figure 8, reprenant les résultats de la figure 7. Il est à noter tous ces animaux étaient plus jeunes lors de leur passage en mer, et qu'ils ont été placés sur des sites différents de celui du CFPPA.

Graphique 8 : Taux de mortalité cumulée de l'ensemble des lots CRH à la fin de l année 2012, en fonction de leur poids unitaire moyen lors de la mise en élevage sur le parc ostréicole du CFPPA à Blainville sur mer. Le lot de naissain isolé en bassin du CFPPA (CF1 CF2 CF3)est représenté par des losanges bleus, le lot de naissain isolé à Cricqueville (CR2) par des ronds jaunes. Les animaux mis en mer sans isolement sont représentés par les carrés rouges (LF2), noirs (SM) et oranges (LF1) et identifiés par les 3 flèches noires. On remarque que les 3 lots mis en mer sans isolement se disposent bien sur la courbe de tendance générale. Ces résultats semblent donc montrer qu un paramètre important agissant sur la mortalité de naissains originaires d'un même lot et placés sur le même secteur ostréicole contaminé, serait le poids unitaire moyen lors de la mise en élevage sur le parc. A noter : 1 La croissance des différents lots de naissain à Blainville en 2012 a été très forte. Pour exemple, les poches qui contenaient 273 naissains provenant de Cricqueville ayant un poids unitaire moyen de 5,4g ont fourni fin 2012 7,3kg d'huîtres consommables, âgées seulement de 20 mois, pour un poids unitaire moyen de 50,9g. Le passage, en seulement 14 mois, d'un P.U.M de 5,4g à un P.U.M de 50,9g pour des huîtres diploïdes, sur notre secteur de Blainville, est exceptionnel. 2 En 2011 et 2012, le CFPPA a suivi un autre lot de naissain provenant d'une autre écloserie, il s'agissait d'huîtres triploïdes. Ces naissains ont été isolés dans le local du CFPPA et alimentés à partir de l'eau du bassin. Ils ont été placés sur le parc du CFPPA le 29/11/11. Il ont subit une mortalité très forte en 2012, 98,2%. Cela montre bien qu'il existe des différences très importantes entre deux lots d'écloserie élevés dans des conditions similaires.

Bilan de l étude Cette étude avait pour principal objectif d étudier l effet de l isolement de naissain sur différents parcs sur la mortalité, en appui aux résultats observés le CFPPA en 2011 (rapport de synthèse de 2011). Les conclusions principales que l on peut dégager de cette étude sont : - L isolement au cours de la 1 ère année semble apporter un gain de survie plus important, notamment un isolement sur un site sanctuaire. L'isolement au cours du premier été permet d'éviter le phénomène de surmortalité, tout le temps que les animaux sont maintenus en isolement. Tous les lots isolés en 2011 présentaient un taux de mortalité inférieur à 5% au terme de la période d'isolement. - Le taux de survie de naissain mis en élevage sur site ostréicole contaminé semble corrélé au poids unitaire moyen atteint en fin de période d'isolement. L'amélioration du taux de survie au terme de la seconde année ne peut être obtenu que si la croissance au cours de la période d'isolement est suffisante pour que tous les naissains atteignent au moins un poids unitaire moyen se situant aux alentours de 3 grammes. - Un seuil à partir duquel le poids unitaire moyen n est plus corrélé au taux de survie semble atteint au delà de 3-4g. Les études réalisées en 2011 et 2012 montrent cette tendance illustrée sur la figure 9. Un second bilan qui semble se dégager aussi des ces études est que le taux de survie ne dépasse pas les 80%. Figure 9 : Taux de survie global sur deux ans d'un naissain en fonction de son poids unitaire moyen en fin de période d'isolement. Constat des études menées : Si la pratique de l'isolement permet d'améliorer de façon importante le taux de survie, deux conditions doivent être respectées: - Le naissain doit être indemne de virus OsHV-1. - Le naissain doit avoir atteint un poids unitaire moyen d'au moins 3g en fin de période d'isolement.

Bilan général des opérations d'isolement L'effet positif de l'isolement en bassin est il un phénomène nouveau? NON Le CFPPA l'a observé dès 1996 et l'a utilisé dès 1997 pour lutter contre le phénomène des mortalités estivales. Par contre entre 1996 et 2005 un poids unitaire moyen de 0,5g en fin de période d'isolement suffisait pour éviter la mortalité estivale du naissain. A partir de 2008, il faut atteindre un poids unitaire moyen beaucoup plus élevé pour ne pas subir de mortalité importante lors du passage en mer. L'isolement en bassin rend il les huîtres plus "résistantes" face au virus? NON L'isolement permet seulement de protéger le naissain d'une contamination directe. Pour exemple, un naissain ayant un poids unitaire moyen de 0,4g en fin de période d'isolement subira la même mortalité qu'un naissain de 0,4g placé directement sur site ostréicole sans isolement. A poids unitaire moyen égal, un naissain qui a été isolé n'est pas plus "résistant" qu'un naissain qui ne l'a pas été. Y a t-il une relation entre la taille du naissain et la mortalité? OUI Surtout il existe une relation étroite entre le poids unitaire moyen du naissain lorsqu'il est mis sur site ostréicole contaminé et la mortalité qu'il va subir. Y a t-il une relation entre l'âge du naissain et la mortalité? Aucun de nos résultats ne permet d'établir une relation entre l'âge et la mortalité. Si cela était le cas, l'isolement sur plusieurs mois permettrait systématiquement de réduire la mortalité de la totalité des individus d'un lot de naissain. En général les animaux plus âgés ont souvent un poids unitaire moyen plus élevé et subissent des mortalités plus faibles ce qui peut faire penser qu'il y a une relation entre âge et mortalité. Existe t-il une technique particulière d'isolement? OUI Il existe surtout des conditions à remplir : 1 Le naissain ne doit pas être contaminé au départ, donc il faut l'analyser et le certifier. 2 Le site d'isolement ne doit pas être contaminé et sous l influence de bassins ostréicoles impactés par la mortalité. 3 Pendant la période d'isolement, il semble que le naissain doit atteindre un poids unitaire moyen égal ou supérieur à 4g pour garantir une amélioration importante du taux de survie. Est-il possible d'améliorer le taux de survie du naissain naturel par la pratique de l'isolement? A ce jour, quelques essais d'isolement de naissain naturels se sont soldés par un échec et ont entraîné la contamination et la perte des lots de naissains "naïfs" placés sur le même site d'isolement.

Perspectives. Des résultats qui se dégagent de cette étude, il apparaît important de : - de mieux comprendre la relation entre le phénomène de contamination et la physiologie de l'huître, et ainsi de définir les périodes les plus propices pour transférer les naissains sur les sites ostréicoles après isolement. - de sécuriser la méthode de caractérisation d'un lot de naissain «naïf» afin de pouvoir évoluer vers une procédure de certification, l'isolement n'étant efficace que sur des animaux non contaminés - d envisager la mise en place de sites d isolement non influencés par les bassins ostréicoles de production. L'isolement en mer ouverte sur site ostréicole "sanctuaire" est actuellement la solution idéale car elle permet une croissance suffisante avec une technique actuellement bien maîtrisée par les professionnels. Or le nombre de sites sur estran est actuellement limité et ne permettra probablement pas l'isolement d'une quantité suffisante de naissain pour l'ensemble de l'ostréiculture normande. Une solution pourrait de créer des sites d'isolement off-shore qui ne soient pas en compétition avec d'autres activités marines. Il faudra par conséquent aménager des structures et des techniques de prégrossissement adaptées à ces conditions particulières. L isolement semble montrer dans certaines conditions un gain de survie et pourrait être mise en œuvre par un grand nombre d'ostréiculteurs possédant des bassins insubmersibles à terre. Cependant, elle nécessite d optimiser plusieurs points: * Périodicité du renouvellement de l'eau. * Amélioration de la capacité trophique du bassin. * Maîtrise de la température de l'eau. * Technique permettant une circulation suffisante de l'eau au niveau du cheptel. * Détermination de la quantité maximale de naissains pouvant être pré grossis par bassin. * Mise en place de protocole de sécurisation pour éviter la contamination du milieu extérieur vers le bassin et pour éviter la contamination du bassin vers le milieu extérieur en cas de forte mortalité dans le bassin. Si ces résultats semblent encourgageants, il est par contre nécessaire qu une expérimentation doit être rapidement mise en oeuvre et menée sur plusieurs années afin de déterminer s'il est possible d'améliorer le taux de survie du naissain naturel par la pratique de l'isolement en bassin. Bibliographie Jouaux A, Lelong C, Mathieu M, Programme GIGAVIR, Centre de Référence sur l'huître Bilan 2011. Houssin M, Martenot C, Suivi des mortalités des naissains et étude des mécanismes d'infectiosité du virus OsHV-1, Centre de Référence sur l'huître Bilan 2011. Le Guillois M, Evolution de la mortalité du naissain d'écloserie diploïde entre 1993 et 2009, relation taille mortalité, Etude de l'effet isolement en bassin: Relation avec la taille et/ou l'âge des naissains, Centre de Référence sur l'huître Bilan 2011.

Observatoire d agents infectieux de l huître sur les cheptels ostréicoles bas-normands (2012) Coordinateur : CRC Normandie Mer du Nord, Manuel Savary : manuel.savary@wanadoo.fr Partenaires : SMEL

1. Contexte D importantes mortalités ostréicoles ont été constatées sur l ensemble des grands secteurs français de production d huîtres au cours des étés 2008 à 2012. Il a été clairement mis en avant un phénomène contagieux et infectieux lié à ces mortalités. Cependant des éléments de connaissances s avéraient manquants sur les agents infectieux de l huître principalement retrouvés en particulier l herpès virus OsHV1 µvar. En Basse-Normandie, le Comité Régional de la Conchyliculture Normandie Mer du Nord réalise depuis 2009 un observatoire des agents infectieux de l huître sur les cheptels ostréicoles, afin d apporter des données aux scientifiques et à la profession pour approfondir la connaissance et appuyer la réflexion de la profession sur ses pratiques. Cet observatoire s inscrit dans les programmes discutés et validés au sein du Centre de Référence sur l Huître. Cet observatoire repose sur un suivi de poches ostréicoles expérimentales au niveau de quatre sites de production identifiés, répartis sur tout le littoral bas-normand, entre le mois d avril et le mois de septembre. La démarche adoptée consiste à faire des constats de mortalité via des comptages et du tri à chaque marée, à réaliser des prélèvements d individus et les apporter aux laboratoires qui assurent les analyses de l agent infectieux herpès virus OsHV1 µvar. Ce document présente les résultats obtenus en 2012, en perspective des données de 2010 et 2011 (l année 2009 a été écartée au regard des importantes variations de protocole pour cette première année). 2. Matériel et méthodes 2.1. Sites ateliers Le suivi a été réalisé au niveau de quatre secteurs ostréicoles bas-normands : deux dans le département du Calvados : Géfosse-Fontenay (Baie des Veys) et Meuvaines, et deux autres dans le département de la Manche : Blainville sur mer (Côte Ouest) et La Tocquaise (Côte Est). Pour la Manche, le suivi a été réalisé en collaboration avec le SMEL. Le choix des sites ateliers a été pris en fonction de la représentativité des bassins de production ostréicole de la Basse-Normandie (figure 1). Le positionnement des points expérimentaux a été choisi en intégrant, à la fois, les contraintes d'accès (coefficient 70 à 80) et la proximité des réseaux de suivis environnementaux (HYDRONOR et RHLN), du réseau d'observation REMONOR et de l'observatoire Conchylicole mis en place par l'ifremer. Les quatre stations retenues se situent à proximité des points REMONOR suivants (figure 1) : MV01 (Meuvaines), BV02 (Baie des Veys), SV03 (Côte Est) et CO06 (Côte Ouest).

Figure 1 : Répartition spatiale des points de suivi du réseau REMONOR (Ropert M, and co, 2007) 2.2. Matériel biologique 2.2.1. Origine des lots étudiés Dans le cadre de cet observatoire, deux classes d âges ont été suivies, du naissain (année 2012) et des huîtres juvéniles de 18 mois (année 2011). Le naissain provient d un seul et unique lot, issu d un captage naturel au niveau du secteur de Fouras, en Charente Maritime. Le même lot fait également l objet d un suivi par le réseau du SMEL. Quant aux juvéniles, ce sont les huîtres récupérées du suivi de l observatoire de l année dernière, issues, elles aussi, d un captage naturel provenant de Fouras. 2.2.2. Mise en poches Les individus ont été placés dans des poches ostréicoles classiques (figure 2). Le maillage a été adapté à chaque classe d âge : une maille de 4 pour le naissain et une maille de 9 pour les juvéniles.

Figure 2 : Poche ostréicole, maille de 9. (Boudouma, 2010) Sur chaque site atelier, deux poches sont consacrées pour le naissain ; l une destinée au comptage et l autre au prélèvement (une seule poche pour les juvéniles). Figure 3 : Pochon de comptage de naissain (Boudouma, 2010) Les poches destinées au naissain comprennent 2 000 individus chacune. Celles destinées aux juvéniles comprennent 400 individus chacune. Les deux pochons inclus dans les poches de comptage de naissain contiennent 100 individus (figure 3). 2.3. Mise en œuvre du protocole expérimental 2.3.1. Mise à l eau Trois poches ont été disposées par site sur les tables ostréicoles. La mise à l eau a été effectuée à la marée de mi-mars 2012 pour la Manche et à la dernière marée de mars 2012 pour le Calvados (une marée de décalage entre les deux). 2.3.2. Méthode de comptage et de détermination des taux de mortalité Le comptage a été réalisé pour chaque classe d âge, à une fréquence bimensuelle (à chaque marée), allant de la mi-mars à la mi-septembre 2012 (tableau 1). Tableau 1 : Calendrier des marées effectuées

Dans l incapacité d effectuer un comptage total, à chaque marée, pour chaque poche, le comptage a été réalisé suivant la méthode décrite par la bibliographie (Costil et al., 2005 ; Royer et al., 2007). Celle-ci consiste à réaliser des observations sur les pochons contenant 100 individus vivants chacun, comptant le nombre d huîtres vivantes et le nombre d huîtres mortes et/ou moribondes, tout en veillant à écarter ces dernières et à les remplacer par des vivantes (en les récupérant dans la poche de comptage), de façon à remettre le pochon à la densité initiale à chaque fois. Les taux de survie instantanés (S) relevés dans les pochons, servent à calculer la mortalité cumulée (CM (%)) pour chacune des poches, à l aide de la formule suivante : CM = [1 (St2 X St1)] X 100 Avec : St2, St1 : les taux de survie instantanés lors d un comptage et celui qui le précède, respectivement. (S= nombre d individus vivants/effectif initial). L ensemble des comptages sert donc à déterminer le taux de mortalité pour chaque classe d âge, au niveau de chaque secteur, à un moment donné, pendant toute l étude. 2.3.3. Protocole d échantillonnage : Prélèvements en vue d analyses des agents infectieux L échantillonnage a été réalisé sur une période étalée du mois d avril au mois de septembre 2012, à une fréquence bimensuelle pour le naissain, et mensuelle pour les juvéniles. Les 5 individus prélevés pour chaque échantillon sont destinés à des analyses ultérieures pour la recherche des agents infectieux. 2.3.4. Analyse des échantillons d huîtres pour la recherche des agents infectieux Une fois prélevés, les échantillons d huîtres sont apportés au Laboratoire Départemental Frank Duncombe du Calvados pour une recherche de l Herpes Virus OsHV-1 µvar. L analyse est réalisée sur un pool de 5 individus, pour chaque classe d âge, et pour chaque site. 2.4. Données complémentaires Les données de température de l eau de mer correspondent aux mesures réalisées par IFREMER, pour la Baie des Veys et Meuvaines dans le cadre du réseau REMONOR, et par le SMEL pour la Côte Ouest et la Côte Est dans le cadre du réseau HYDRONOR.

3. Résultats et discussion 3.1. Taux de mortalité 3.1.1. Suivi des taux de mortalité du naissain Les courbes de mortalités ont été établies à partir du suivi des poches de naissain au niveau des 4 sites ateliers, suite à des comptages bimensuels de mars à septembre 2012. Les résultats sont représentés sur la figure 4. Les résultats obtenus montrent que d importantes mortalités ont touché le naissain au niveau des quatre sites d étude. Les mortalités cumulées varient de 60,5 à 89%. En effet, le taux de mortalité a atteint 60,5% sur la Côte Est, 77% à Meuvaines, 80% en Baie des Veys et 89% sur le Côte Ouest. Un comptage global final a été réalisé sur les deux points du Calvados (le SMEL continuant un suivi dans la Manche) sur les deux poches de naissain (prélèvement et comptage). En occultant les huîtres prélevées, le taux de mortalité moyen à Meuvaines sur les deux poches est de 77,5%, soit, comme en 2011, un résultat proche du taux de 77% obtenu en mortalité cumulée. Pour la Baie des Veys, le taux mesuré moyen pour les deux poches est de 82%, soit, comme en 2011, un taux proche de la mortalité cumulée globale de 80%. Les pics de mortalité massive sont constatés début juin, sauf pour la Côte Est, où cela a été plus tardif (mi-juillet). Les mortalités se sont poursuivies au cours du mois de juillet pour le Calvados. Il y a une stabilisation des mortalités au mois d août. Figure 4 : Mortalités cumulées (en %) du naissain sur les 4 sites en 2012 En termes de taux de mortalité final, l année 2012 se situe dans une situation intermédiaire entre 2010 et 2011. Au différent de 2010 et 2011, les sites du Calvados présentent des taux finaux similaires avec les sites de la Manche aux extrémités.

L apparition des pics est aussi intermédiaire entre 2010 et 2011, mais il est à noter des taux de mortalité en début de suivi (mars à mai) plus importants (entre 20 et 40%) que les années 2010 et 2011 (entre 0 et 20%). Les pics sont cependant important (fortes variations en peu de temps) comme en 2010 et au contraire de 2011. Il est retrouvé le décalage de mortalité avec une apparition plus tardive sur le Côte Est comme en 2010 et 2011. Figure 5 : Mortalités cumulées du naissain sur les 4 sites en 2011 (gauche) et 2010 (droite) 3.1.2. Suivi des taux de mortalité des juvéniles Lors du suivi bimensuel de mars à septembre 2012 des différentes poches de juvéniles d huîtres dans les 4 sites, il n a pas été constaté de mortalité significative. Cependant un phénomène de mortalité croissante a été constaté sur la poche de la Baie des Veys à partir de la mi-juin pour atteindre à la mi-septembre environ 15%. Une stabilisation de la mortalité a été observée en août et septembre. Cette épisode même peu marquée coïncide avec des mortalités constatées par les professionnels sur certaines concessions de Gefosse-Fontenay, mais avec des taux beaucoup plus importants pour certains. Pour la Manche, les mortalités cumulées atteignent 2% en septembre et 7% à Meuvaines. Figure 6 : Mortalités cumulées (%) des juvéniles sur 4 sites en 2012

La différence de mortalité entre naissain et juvéniles constatée depuis le début de ce phénomène en 2008 sur tous les secteurs ostréicoles français est comme en 2011 très marquée sur les 4 points de suivi en 2012. Cela constitue une différence par rapport à 2010, où les taux de mortalité des juvéniles avaient été plus importants. Les taux mesurés ici s inscrivent dans un cadre de cycle normal de production. Un comptage global final a été réalisé sur les deux points du Calvados (le SMEL continuant un suivi dans la Manche) sur les poches de juvéniles (prélèvement et comptage). En occultant les huîtres prélevées, le taux de mortalité moyen est de 10% à Meuvaines et de 21% en Baie des Veys soit des taux supérieurs aux mortalités cumulées. 3.1.3. Suivi des mortalités du naissain et des juvéniles et évolution des températures au niveau de chaque site atelier La figure 7 représente l évolution des températures de l eau et des taux de mortalité de naissain, au niveau des secteurs de la Manche. Les données de température pour le Calvados n avaient pas pu être extraites au moment de la rédaction de ce document. Figure 7 : Evolution des mortalités cumulées du naissain et des températures de l eau pour la Manche Les pics de mortalité ne sont pas intervenus à la même période sur la Côte Ouest et la Côte Est, mais ils ont lieu suite à un écart de température de 1 C entre 16 et 17 C.

Au regard des résultats des années précédentes, les pics de mortalité sont le plus souvent concomitants avec des températures comprises entre 15 et 17 C, avec parfois des écarts de température marqués avant les mortalités. Cependant il est difficile d établir une notion de seuil, aussi bien en valeur qu en variation. 3.2. Agents infectieux (Herpes virus OsHV-1 µvar) Les courbes d évolution de la charge virale ont été établies suite aux analyses effectuées d avril à septembre sur des échantillons de naissain vivant, prélevés à une fréquence bimensuelle, et de juvéniles vivants prélevés à une fréquence mensuelle. Les résultats des taux de mortalité et des charges virales pour chaque secteur et chaque classe d âge sont représentés sur la figure 8. Les charges virales sont exprimées en Unités Génomiques par 50 mg de chair. La présence de l agent infectieux Herpès virus OsHV-1 µvar a été décelée sur une grande quantité d échantillons quelque soit la classe d âge ou le secteur. Les profils de charge virale obtenus en 2012 présentent une forme identique, que l on retrouverait déjà sur certains secteurs en 2011, alors qu il y avait beaucoup plus de variabilité en 2010. Contrairement aux autres années, l importance des pics de contamination est en adéquation avec les taux de mortalité, c'est-à-dire que le pic le plus élevé est rencontré sur la Côte Ouest et le plus faible sur la Côte Est. Pour le naissain, les pics de charge en virus se rencontrent comme pour les autres années avant les pics de mortalité, à l exception de la Baie des Veys, où c est concomitant. Pour la Côte Ouest, la Baie des Veys et Meuvaines, les pics de charge virale se retrouvent ainsi entre la deuxième quinzaine de mai et la première quinzaine de juin (début juillet pour la Côte Est) pour ensuite régresser et se stabiliser au mois de juillet et août entre 10 000 et 1 000 000 UG pour 50 mg de chair. Après cette date, une tendance à la baisse en concentration de virus est notée, à part sur Meuvaines. La charge virale chez les juvéniles est beaucoup plus faible et ne dépasse qu à 2 reprises les 10 4 UG pour 50 mg de chair (10 000 en Baie des Veys et 27 000 à Meuvaines).

Figure 8 : Evolution des mortalités cumulées et des charges virales pour chaque classe d'âge et chaque secteur en 2012 4. Conclusion Les constats réalisés dans cet observatoire ont montré qu aucun site atelier n a été épargné par le

phénomène de surmortalité en 2012. De nombreuses déclarations de mortalité faites par les ostréiculteurs provenant de tous les bassins de production, viennent conforter les résultats obtenus. Dans l observatoire, les mortalités ont été observées principalement début juin en même temps que chez les ostréiculteurs. Ces mortalités massives touchent particulièrement le lot de naissain, indépendamment du secteur géographique, les huîtres juvéniles, ayant survécu à la vague de mortalité de l année précédente, semblent peu affectées par ce phénomène. Les mortalités cumulées finales de 2012 se situent entre 2010 et 2011. Les résultats d analyse des échantillons d huîtres vivantes, prélevés au niveau de chaque secteur, ont bien démontré la présence et l émergence de l agent infectieux OsHV-1 µvar. En effet, le rôle du virus de l herpès de l huître creuse dans le phénomène de surmortalité, sur le littoral français, au cours de ces dernières années, est considéré comme prépondérant. Bien que l herpès-virus soit présent dans une grande quantité des échantillons, les charges virales retrouvées au sein des juvéniles sont nettement moins importantes que celles retrouvées dans le naissain. Les augmentations de charge virale sont rencontrées avant les pics de mortalités pour le naissain. Les résultats de cette troisième année de l observatoire dans le cadre d un protocole similaire à celui de 2010 et 2011 ont permis d étayer des éléments, qui sont concordants entre ces trois années, en particulier en terme d évolution des mortalités et de la charge virale (présence d une augmentation virale avant un pic de mortalité, particularisme du point de la Côte Est, ). Résumé Depuis 2008, d importantes mortalités ont été constatées au niveau de l ensemble des secteurs français de production d huîtres creuses. Ce phénomène est associé à des agents infectieux, et particulièrement à l herpèsvirus OsHV-1 µvar. Au sein du Centre de Référence sur l Huître, le Comité Régional de la Conchyliculture Normandie- Mer du Nord réalise depuis 2009 un observatoire des agents infectieux de l huître creuse sur les cheptels ostréicoles bas-normands. Des mesures de mortalité et de présence de l herpès-virus sont faites sur un lot de naissain et un lot de juvéniles d avril à septembre tous les 15 jours sur 4 sites représentatifs des zones ostréicoles bas-normandes. En 2012, les premiers cas de surmortalité sont apparus fin-mai et début juin à la suite d augmentation des charges virales et ont concernés uniquement le naissain. Les taux cumulés de mortalité ont atteint entre 60,5 et 89% soit des taux situés entre les résultats obtenus en 2010 et 2011. Bibliographie - Costil K., Royer J., Ropert M., Soletchnik P., Mathieu M., 2005. Spatio-temporal variations in biological performances and summer mortality of the Pacific oyster Crassostrea gigas in Normandy (France). Helgoland Marine Research 59, 286 300. - Royer J., Ropert M., Costil K., 2007. Spatio-temporal changes in mortality, growth and condition of the Pacific oyster, Crassostrea gigas, in Normandy (France). Journal of Shellfish Research 26, 973 984. Références - Boudouma N., 2010. Observatoire des agents infectieux de l huître creuse sur les cheptels ostréicoles bas-normands. Rapport de stage Master 2 «Ressources Vivantes Côtières» de l Université de Caen, IBFA réalisé au CRC Normandie Mer du Nord - Ropert M., Pien S., Mary C., Bouchaud B., 2007. REMONOR, Résultats 2006. IFREMER LERN Port en Bessin - SMEL