Le tissu fixé en pathologie moléculaire diagnostique

Le tissu fixé en pathologie moléculaire diagnostique Laboratoire de Pathologie Moléculaire Institut de Pathologie, CHUV, Lausanne Dr Jean BENHATTAR 23 octobre 2009

irréversible Quelles modifications recherche-t-on en Pathologie Moléculaire? Grosses altérations génétiquesg ADN, (protéines) gain ou perte de chr,, translocation, réarrangement r géniqueg Petites altérations génétiquesg mutations, petites délétions d ou insertions Altérations épigénétiques DNA méthylation Amplification de gènesg plusieurs copies du même gène g (oncogènes) nes) ADN, (ARN) ADN ADN, (protéines) réversible Modification de l expression l d un d gèneg Présence de molécules exogènes (virus, bactéries, prion) ARN, protéines ADN, ARN, protéines Toutes ces analyses peuvent être effectuées par PCR ou RT-PCR

Molécules de bases en biologie moléculaire ADN ARN Instable en milieu acide (dépurination) Molécule très s résistanter Stable à -20 C OH Instable en milieu basique Très s sensible aux RNases (transpiration, salive, cellules) rapide dégradationd Stable à -80 C

Matériel à analyser en pathologie (gène) transcription traduction ADN ARN Protéines Tissus fixés Tissus frais ou congelés Cellules (cytologie) Sang, moelle Quels sont les avantages / inconvénients de chaque type de matériel?

Tissus frais ou congelés : matériel loin d être parfait AVANTAGES Représente l état exact des molécules à étudier Matériel généralement de bonne qualité. Tout type d analyses possibles Histologie possible Matériel stable à -80 C, plusieurs analyses pour un même prélèvement INCONVENIENTS Attente parfois trop longue entre début opération, prélèvement et congélation ischémie Décongélations: altération de la morphologie, ARN dégradation Pas toujours représentatif de la lésion à analyser Contamination des prélèvements par autres tissus difficilement décelable Possibilité de transmission de pathogènes avant digestion du tissu

Tissus fixés : matériel idéal pour les pathologistes AVANTAGES INCONVENIENTS Matériel le plus commun en pathologie. Matériel hyper stable à 25 C Histologie parfaite Sélection de la lésion à étudier par l histologie prélèvements précis analyses précises Molécules liées de façon covalente entre elles Attention au type de fixatif utilisé Meilleur : formol tamponné Difficultés d extraction Matériel généralement de très mauvaise qualité (très dégradé) Nombreuses analyses impossibles (Southern, Northern, Western) Taille des PCR limitée (environ 400 bp) optimisation des PCR

Est-il possible d analyser l ADN et l ARN de tissus d archives fixés et inclus en paraffine? 1 - Optimiser l extraction de l ADN et de l ARN de tissus fixés au formaldéhyde et inclus en paraffine. 2 - Optimiser les réactions de PCR et RT-PCR: choix des amorces, taille des fragments à amplifier, conditions de réaction. 3 - Analyses à but diagnostique: éviter les faux-positifs et les faux-négatifs.

Analyse par PCR ou RT-PCR en pathologie Il y a 3 étapes essentielles pour une analyse en biologie moléculaire à partir d'un fragment tissulaire ou d'un culot de cellules: 1 -Extraction d ADN ou d'arn 2 -Amplification par PCR ou RT-PCR 3 Analyse du produit d amplification

Prélèvement des tissus fixés 1) Prélèvement sur le bloc Tube Bloc de paraffine Tissu prélevé 3) Prélèvement sur lame Tissu Lame histologique 2) Rouleaux de 4-10 μm d épaisseur Coupe déposée sur lame 4) Microdissection

Choix du bloc et de la lésion à analyser ou comment éviter les faux-négatifs

Qualité de l ADN après extraction tissus congelés tissus fixés 1000 bp 600 bp 100 bp

Qualité de l ARN après extraction tissus congelés tissus fixés 28S 18S 1000 bp 600 bp 100 bp

FIXATION AU FORMALDEHYDE

1 - Extraction de l ADN et de l ARN génomiques Problème : ADN et ARN très dégradés et liés de façon covalente avec d autres molécules Cellules et tissus congelés Tissus fixés Déparaffiner Digestion O.N. avec Protéinase K + chauffage (decrosslinking) Extraction standard (colonne ou phénol/chloroforme)

2 - Optimisation des réactions de PCR et RT-PCR 1 - Produits de PCR de petite taille : 70-250 bp 2 - RT (transcriptase inverse) avec amorce spécifique : meilleur rendement pour passer de ARN -> cadn spécifique 3 - Fort rendement d amplification : choix judicieux des amorces, nombre de cycles plus élevé, peu ou pas d amplifications non spécifiques.

3 - Eliminer les faux-positifs et les faux-négatifs! 1. Pour les réactions de PCR et RT-PCR : introduire toujours un contrôle positif et un contrôle négatif; toutes les réactions doivent être effectuées en double. 2. Taille du PCR contrôle doit être bien supérieur à celle du PCR à analyser. 3. RT-PCR: coamplifier un ARN contrôle (GAPDH, β- actine...), si possible dans le même tube. 4. RT-PCR: défavoriser la réaction avec l ARN contrôle.

Analyse par Biologie Moléculaire en fonction du type de matériel PCR Tissus fixés - / + + / +++ * Tissus congelés Cellules (cytologie) Sang, moelle Cultures cellulaires + / +++ + / +++ + / +++ +++ Southern - + / +++ - / +++ ++ / +++ +++ ISH + / +++ + / +++ + / +++ + / +++ +++ RT-PCR - + / +++* - / +++ - / +++ - / +++ +++ Northern - - / +++ - / +++ + / +++ +++ Analyses + / +++ ++ + / ++ + / ++ +++ * Extraction ADN et ARN avec protocoles modifiés

Les analyses par biologie moléculaire en pathologie diagnostique Dans un contexte diagnostique, la recherche d'anomalies génétiques spécifiques peut avoir 3 objectifs majeurs: 1) confirmer ou infirmer un diagnostic, 2) prédire la réponse à un traitement, 3) préciser le pronostic.

Liste des analyses effectuées à l Institut de Pathologie de Lausanne par le laboratoire de Pathologie Moléculaire Pathologie Analyse moléculaire Tissus ADN/ARN Méthode d'analyse Lymphome IgH gene rearangement Tumeur ADN PCR - gel acrylamide (QIAxcel) Lymphome TCR-γ gene rearrangement Tumeur ADN PCR - gel acrylamide Lymphome t(11 ;14) Tumeur ADN PCR - gel agarose Lymphome t(14 ;18) Tumeur ADN PCR - gel agarose Placenta Parvovirus B19 Tumeur ADN PCR - gel agarose Côlon HNPCC MSI = Microsatellite Instability Normal + Tumeur ADN PCR - gel acrylamide dénaturant (QIAxcel ) Côlon HNPCC MLH1 promoter methylation Tumeur ADN bisulfite - qpcr - HRM Côlon HNPCC BRAF mutation Tumeur ADN PCR - séquençage Côlon thérapie KRAS mutation Tumeur ADN PCR - SSCP Côlon thérapie EGFR amplification Tumeur ADN qpcr Poumon thérapie EGFR mutation tumeur ADN PCR - séquençage (QIAxcel) GIST KIT and PDGFRA mutations Tumeur ADN PCR - séquençage (QIAxcel) Oligodendrogliome LOH 1p and 19q Normal + Tumeur ADN PCR -gel acrylamide dénaturant (QIAxcel) LCR (cancer) htert promoter methylation LCR + Tumeur ADN bisulfite - qpcr - HRM Divers Patient tissue origine Normal + Tissu ADN PCR - gel acrylamide dénaturant (QIAxcel )

Pathologie Analyse moléculaire Tissus ADN/ARN Méthode d'analyse Sarcome Synovial sarcoma : t(x ;18) Tumeur ARN PCR - gel agarose Sarcome Sarcome Sarcome Sarcome Sarcome Sarcome Ewing sarcoma: t(11;22) and t(21;22) Alveolar rhabdomyosarcoma : t(12 ;16) and t(12 ;22) Myxoid liposarcoma : t(12 ;16) and t(12 ;22) Desmoplastic small round cell tumor : t(11 ;22) LG fibromyxoid sarcoma : t(7 ;16) Extrakeletal myxoid condrosarcoma t(9 ;22) and t(9 ;17) Tumeur ARN PCR - gel agarose Tumeur ARN PCR - gel agarose Tumeur ARN PCR - gel agarose Tumeur ARN PCR - gel agarose Tumeur ARN PCR - gel agarose - séquençage Tumeur ARN PCR - gel agarose Sarcome Clear cell sarcoma : t(12 ;22) Tumeur ARN PCR - gel agarose Environ 700 analyses effectuées par année avec un taux de succès >98%

Lymphomes cutanés: valeur clinique des clones T mis en évidence par PCR

Ca à la couleur de l eczéma, ça gratte comme l eczéma, mais ce n est pas de l eczéma! Il faut savoir reconnaître un eczéma et surtout connaître le diagnostic différentiel de certaines formes d eczéma. Ainsi l eczéma palmoplantaire peut être confondu avec une affection très différente : le mycosis fongoïde. Mycosis-fungoides-Type Cutaneous T Cell Lymphoma of the Hands and Soles: A Variant Causing Delay in Diagnosis and Adequate Treatment of Patients with Palmoplantar Eczema. K. Spieth et al. International Journal for clinical and investigative Dermatology 205, 2002.

MECHANISME DE RECOMBINAISON DU RECEPTEUR TCR-g V4 V3 V2 V1 J1 J2 C CELLULE GERMINALE recombinaison V4 V3 V2 N J1 J2 C LYMPHOCYTE T V2 N J1

Lymphome ou inflammation V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 V10 V11 J1 C1 J2 C2 LYMPHOME INFLAMMATION V1 V2 V3 V4 J1 C1 J2 C2 V3 V4 V5 V6 J1 C1 J2 C2 30% 0.01% V1 V2 V3 V4 V5 V6 J2 C2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 J2 C2 0.01% 0.01% V7 V8 V9 V10 J1 C1 J2 C2 V1 V2 V3 J1 C1 J2 C2 0.01% 0.01% + autres réarrangements 20% + autres réarrangements 40% + Germline 60% + Germline 60%

Par analyse en biologie moléculaire les bandes de réarrangement T sont visibles sur gel après amplification de l ADN par PCR Gel d agarose Population clonale de cellules T lymphome Population hétérogène de cellules T inflammation Gel de polyacrylamide

TCR-g gene rearrangement 1 2 3 4 5 6 T-cell clone C - ++ ++ + +

Attention! 1. Une mauvaise amplification peut aussi conduire à une fausse positivité. 2. Fines bandes ne veulent pas toujours dire monoclonalité. C+ 1a 1b 2a 2b 3a 3b 4a 4b 5a 5b 1 2

Clonalité par PCR : Questions et problèmes Monoclonalité, oligoclonalité ou polyclonalité. Eliminer les faux-positifs et les faux-négatifs. Interprétation des résultats: mini clone, clonalité B et T dans le même prélèvement, clones différents au cours de la maladie. Représentativité du matériel à analyser. Clonalité = tumeur?

Les mutations du gène KRAS et l efficacitédes anticorps monoclonaux anti-egfr dans le traitement des cancers colorectaux

Les mutations du gène KRAS Les 3 isoformes des protéines ras (H-, K- et N-ras) sont des plasma membrane-bound proteins de 21kDa. Les protéines Ras p21 existent en 2 états physiologiques, soit dans une forme inactive par liaison au GDP, soit dans une forme active par liaison au GTP. Les protéines Ras vont acquérirent un potentiel de transformation grâce à une mutation ponctuelle (au niveau des codons 12, 13, 59 et 61); ce qui va bloquer la protéine KRAS sous sa forme active. Les mutations KRAS se produisent très tôt dans la séquence adénome-carcinome, elles sont présentes dans environ 40% des cancers.

Thérapie anti-egfr et inhibition de la voie de signalisation Ras/Raf/MAPK

Response to Cetuximab According to the Presence or Absence of KRAS Mutation in the Overall 114 Patients KRAS mutation Wild type KRAS Tumor Response No. of Patients % No. of Patients % P Regression 0 0 34 43.6 Stable 14 38.9 26 33.3 Progression 22 61.1 18 23.1 Total 36 100 78 100 Lievre, A. et al. J Clin Oncol; 26:374-379 2008

Progression-free survival by treatment within KRAS groups + traitement anti-egfr Mutant 7.4 vs 7.3 weeks + traitement anti-egfr Wild type 12.3 vs. 7.3 weeks P= <0.0001 Amado, R. G. et al. J Clin Oncol; 26:1626-1634 2008

Détection des mutations du gène KRAS Matériel: pièce chirurgicale ou biopsie. - Matériel fixé et inclus en paraffine dans la quasi totalité des cas. - Proportion de cellules tumorales très variable. Méthodes d analyse après amplification par PCR 1. Séquençage C est le gold standard. Problème: méthode peu sensible (limite de détection: 40% de cellules tumorales) > haute probabilité de faux négatifs. 2. ASPCR (Allele Specific PCR) Méthode très sensible. Haute probabilité de faux positifs. 3. SSCP (Single Stand Conformation Polymorphism) Méthode assez sensible (limite de détection: 5-10%). Pratiquement pas de faux négatifs et de faux positifs.

Séquençage codons 12 13 Mutation 12-GAT codons 12 13 WT?

Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) tissu à analyser DNA extraction PCR + * * Denaturation ssdna Migration sur gel d acrylamide non denaturant Syber Gold staining ssdna dsdna

TGT AGT GAT GCT GAC GTT WT WT GTT GAT GAT contrôles?

Détection par RT-PCR des transcrits de fusions des sarcomes des tissus mous sur tissus fixés et inclus en paraffine

Sarcome synovial Tumeur rare : 10-15% des sarcomes de l adulte Touche souvent les adultes jeunes Localisation ubiquitaire (plus souvent les membres inférieurs) Plusieurs variantes morphologiques ressemblant à d autres types tumoraux diagnostic parfois difficile

Translocation spécifique du sarcome synovial Translocation t(x,18) (SYT-SSX) 3 gènes principalement impliqués : SYT (18q11), SSX1 et SSX2 (Xp11), très rarement SSX4 SYT (SYnovial sarcoma Translocation) SSX (Synovial Sarcoma X chromosome) Formation d un gène chimérique qui est transcrit Transcrits de fusion détectables par RT-PCR

SYT (ADN) SSX (ADN) Chr 18 Chr X SYT-SSX (ADN) (ARN) M C+ Pas de translocation Translocation t(x;18) primer SYT RT (cadn) primer SSX β-actine t(x;18) PCR Electrophorèse

Translocation X;18 (SYT-SSX) dans les sarcomes synoviaux M C+ t(x;18) t(x;18) N I Nég. Nég. b-actine t(x;18) Gel d agarose à 2% et coloration au bromure d éthidium

Sarcome d Ewing Le sarcome d'ewing est une tumeur osseuse maligne qui s'observe chez des personnes âgées de 5 à 30 ans avec un pic d'incidence entre 10 et 15 ans. Il représente 10 à 15% des tumeurs osseuses. C'est une tumeur à fort potentiel métastatique (poumon, moelle osseuse). La translocation t(11;22)(q24 ;q12) a été décrite pour la première fois en 1983 dans les tumeurs d'ewing, et a été caractérisée en 1992. Diagnostic difficile.

Translocation spécifique du sarcome d Ewing Translocations t(11,22), t(21,22), t(7,22), t(17,22) et t(2,22) 3 gènes principalement impliqués : EWS 22q12 Fli-1 11q24 ou ERG 21q21 Formation d un gène chimérique qui est transcrit La mise en évidence de ces translocations permet d'affirmer le diagnostic. Dans 90 % des cas, il s'agit du gène de fusion EWS et Fli- 1 mais parfois du gène EWS et du gène ERG dans environ 10 % des cas. Cependant, il existe des translocations variantes et complexes. Ces transcrits de fusion peuvent être mis en évidence par RT-PCR

Meier et al. Diagn Mol Pathol 7:29-35, 1998

EWS (ADN) Fli-1 (ADN) EWS-Fli-1 (ADN) RT-PCR contrôle RT-PCR Ewing (ARN) primer EWS RT (cadn) primer Fli-1 M 1 2 3 1 2 3 Type 2 Type 1 PCR Electrophorèse

Translocation t(11 ;22) (q24 ;q12) (EWS-Fli-1) Avec un seul set de primers EWS7A Fli9B EWS7A Fli6B EWS9A Fli9B EWS9A Fli6B ~ 55% ~ 20% Type I 7 6 7 8 9 321 99 Type II 7 5 6 7 8 9 387 165 7 7 8 9 255 7 8 9 195 7 9 147 ~ 15% 7 8 9 10 6 7 8 9 573 351 328 106 7 8 9 10 5 6 7 8 9 639 417 394 172 7 8 9 10 8 9 447 202 7 8 9 10 9 399 154 Translocations t(21 ;22) (q21 ;q12) (EWS-ERG) EWS7A ERG9B EWS7A ERG6B 7 6 7 8 9 311 84 EWS9A ERG9B EWS9A ERG6B ~ 10% 7 9 137 7 8 9 10 6 7 8 9 563 336 318 91 7 8 9 10 9 389 144

Détection des translocations spécifiques dans les sarcomes d Ewing Tissus fixés Déparaffinage Digestion avec Protéinase K Extraction de l ARN avec le Trizol ARN = phase aqueuse protéines = phase organique 1) RT-PCR direct avec primers EWS-ex7 + Fli-ex6 + Fli-ex9 + β-actine Si RT-PCR négatif RT-PCR direct avec: 2) EWS-ex9 + Fli-ex6 + Fli-ex9 + β-actine 3) EWS-ex7 + EWS-ex9 + ERG-ex6 + ERG-ex9 + β-actine

RT-PCR direct avec primers EWS-ex7 + Fli-ex6 + Fli-ex9 + b-actine M C- C+ II II -- I II I -- I β-actine M I II IV -- III II I II II? β-actine Type I : EWS-exon7 / Fli-1-exon6 Type II : EWS-exon7 / Fli-1-exon5 Type III : EWS-exon7 / Fli-1-exon8 Type 2IV: EWS-exon7 / Fli-1-exon9

Translocations dans les sarcomes Les transcrits de fusion peuvent être facilement détectés par RT-PCR à partir d ARN extrait de tissus fixés et inclus en paraffine. Analyse pouvant être effectuée en 2 jours avec un excellent taux de réussite. Translocation t(x;18) (SYT-SSX) spécifique (100%) des sarcomes synoviaux. Sensibilité: 96%. Translocations EWS-Fli1 et EWS-ERG dans les sarcomes de Ewing: Spécificité: 100%. Sensibilité: 97%.

Conclusions 1. Analyses par PCR et RT-PCR peuvent être effectuée à partir de l ADN ou de l ARN extrait de tissus congelés ou fixés. 2. Nombreuses analyses possibles avec tissus fixés et inclus en paraffine: mutation, délétion, translocation, DNA methylation, expression génique, amplification génique, etc. 3. Taille des produits amplifiés par PCR ou RT-PCR doit être inférieur à 300 bp. 4. Analyses pouvant être effectuées en 2-4 jours avec un excellent taux de réussite ( > 95% pour les tissus fixés et inclus en paraffine). 5. Une décalcification douce, une radiothérapie et/ou une chimiothérapie n affecte que très peu les analyses à partir de l ADN ou de l ARN extrait de tissus fixés et inclus en paraffine. 6. Analyse globale et non par cellule. Pour certaines analyses (séquençage, perte d allèle), la proportion de cellules tumorales par rapport à toutes les autres cellules doit être > 60-70%. Bien choisir le bloc et si nécessaire sélectionner une région à analyser. 7. Biobanques de tissus fixés: stockage aisé et utilisation illimitée.

Un grand merci à Gabrielle Gallagher Patricia Martin Charlotte Bricod