Les Mécanismes de transcription dans E. coli par Stéphanie Monnet Professeur accompagnant : M. Dominique Belin Problème posé : Le but du projet était de se pencher sur l analyse de l ADN plasmidique, ADN présent dans les bactéries tels E. coli mais non essentiel à ces bactéries, et tout particulièrement sur l interaction entre AraC, activateur transcriptionnel, et RpoA, un des sous-unités de l ARN polymérase. L interaction entre ces deux protéines peut se faire de différentes manières, plus ou moins efficaces et est repérable grâce à des enzymes rapporteurs (phosphatase alcaline) qui sont exprimés sous leur contrôle. Pour voir les différentes influences, il faut muter les gènes et les comparer au type sauvage noté WT (ou souche K1) pour le RpoA +. Pour obtenir la mutation K75 d arac, des plasmides, résistants à l ampicilline, sont introduits dans la bactérie. Les souches contenant dee gènes rpoa mutés s appellent K2, K6 et K7. On va ensuite observer quels sites ont été mutés dans K75 en comparant le gène avec celui du WT. Puis les plasmides K75 et WT vont être introduits dans les différentes souches K1, K2, K6 et K7 afin de voir si la mutation K75 est plus efficace que le WT. Procédé et méthodes : 1. Minipreps d ADN Pour pouvoir comparer l ADN de AraC muté (K75) et non-muté (WT), il faut tout d abord extraire l ADN plasmidique de la bactérie. Pour cela une miniprep est effectuée. Les bactéries sont mélangées avec différentes solutions : La solution 1 contient du Tris HCl, de l EDTA, qui va neutraliser le magnésium et ainsi empêcher la DNase de dégrader l ADN, et du glucose qui va tamponner l hydroxyde de sodium (NaOH). La solution 2 contient de l hydroxyde de sodium (NaOH) qui va dénaturer l ADN chromosomique, de l eau et du SDS qui en dénaturant les lipides, détruit la paroi de la bactérie et permet ainsi aux éléments de sortir. La solution 3 contient de l acétate de potassium, de l acide acétique glacial et de l eau. Cette dernière solution va précipiter les chromosomes bactériens et les protéines. Après avoir mélangé successivement les bactéries aux trois solutions, rajouté du phénol qui enlève les protéines, de l EtOH qui capte l eau et les sels et précipite les acides nucléiques, et effectué d autres manipulations, on obtient l ADN présent dans les cellules. Cette dernière solution est envoyée en laboratoire pour obtenir le séquençage de l ADN. 1
2. Analyse des séquences On obtient la séquence d AraC qui a été décrypté par un ordinateur. Certaines lettres ne sont pas lues par ordinateur, il faut donc regarder les courbes représentant l ADN pour retrouver les lettres manquantes. Dès lors il est possible de comparer le WT et le K75 et de repérer les mutations. 3. Criblage de boites : analyse qualitative Pour observer les effets des mutations sur les différentes mutants RpoA, on introduit le plasmide mutant K75 et le WT dans les souches K1, K2, K6 et K7 contenant différents allèles de rpoa. Pour effectuer cette opération, un bouillon de culture est préparé préalablement et coulé dans une boite en plastique. Dans ces boites du Xp est présent, cette molécule s hydrolyse en présence d enzyme et donne un produit bleu. Ainsi en fonction de la teinte du bleu, on peut en déduire approximativement la quantité d enzyme et par conséquent si les mutations ont bien compensé le défaut. 4. Culture liquide ou overnight (O/N) : analyse quantitative Le criblage des boites ne nous permet pas de calculer l activité enzymatique, l O/N en revanche en donne une très bonne approximation. Dans cette expérience, les cellules libéraient de la phosphatase alcaline qui réagissait avec le PNPP présent dans le milieu, et une couleur jaune était observable après un certain temps pouvant varier de 30 minutes à 22 heures. L apparition de cette couleur indiquait que le PNPP avait réagi et qu il était possible de calculer l activité enzymatique grâce à une formule simple. Résultats : 1. Comparaison des ADN WT et K75 séquence WT séquence K75 2
2. Striage des plasmides K75 et WT dans les souches K1, K2, K8 & K7 Les boites contenant du LB, de l ampicilline, du XP et de l arabinose 3. Tableau représentant l activité enzymatique 3
4. Diagramme représentant l activité enzymatique Discussion : wt (K1) K2 K6 K7 On remarque que le phénotype d Arac est modifié, en effet un codon alanine (GGT) est muté en codon aspartate (GAT). Lors du criblage des boites, le plasmide K75 devient bleu car le Xp est hydrolysé. De plus grâce au tableau représentant l activité enzymatique, on observe que la mutation dans K75 (pour la souche K1) compense beaucoup les défauts de la transcription. Dans les autres souches (K2 K6 K7) les défauts de rpoa sont compensés mais moins efficacement. Conclusion : Le Xp, utilisé pour le criblage des boites, s est hydrolysé ce qui prouve la présence d enzymes (phosphatase alcaline). On observe de plus qu il y a une plus grande production de phosphatase alcaline avec l ADN muté K75 qu avec l ADN non-muté WT. C est ainsi qu on peut en déduire que les défauts de l ARN polymérase sont compensés et qu il existe une interaction évidente entre AraC et RpoA pour l activation de la transcription. Autres clarifications : Une autre mutation sur AraC avait aussi été observée, un codon glycine (GGT) s était modifié en codon asparate (GAT) mais on s en est moins préoccupé durant nos expériences. De plus, certaines étapes de cette expérience étaient déjà faites avant mon arrivée car il est difficile d obtenir des résultats en si peu de temps. 4
Remerciements : Comme dans chaque expérience de vie, rien ne peut se faire sans aide, je voudrais remercier tout particulièrement : - Madame Maria-Filomena Silva qui m a accompagnée durant toute cette semaine, qui m a assistée durant chaque expérience et qui a su être patiente avec moi. - Monsieur Dominique Belin pour ses nombreuses connaissances et le temps précieux mis à ma disposition. - Les autres membres du laboratoire, Monsieur Yves Mattenberger et Mademoiselle Marie- Claire, pour le merveilleux accueil qu ils m ont réservé. - Le centre médical universitaire de Genève qui m a permis d accéder à ces laboratoires. - L association «la science appelle les jeunes», représenté par Madame Olivia de Pol, pour avoir organisé une si belle semaine, remplie d expériences inoubliables. 5