Expression des gènes et des protéines : Transcription (Procaryotes)

Expression des gènes et des protéines : Transcription (Procaryotes) I) Introduction La transcription c est la Polymérisation ribonucléosides 5 triphosphates en ARN. La transcription nécessite une enzyme qui est l'arn polymérase qui est ADN dépendante (ARNP). La reverse transcription (ARN à ARD) se fait via la reverse transcriptase. Le dogme central de la biologie moléculaire II) Rappel des mécanismes fondamentaux de la transcription L ARN polymérase utilise le brin d ADN transcrit (non codant) pour la transcription. La synthèse de l'arn se fait de 5' à 3', le premier nucléotide de l'arn porte un triphosphate en 5' c est un rntp(4 ribonucléosides 5 -triphosphates). Il y a un OH en 3 de la chaine de croissance. La transcription se déroule par l addition de rntp complémentaire au brin transcrit. Les deux derniers phosphates du rntp sont hydrolysée, libérant un pyrophosphate qui sera hydrolysé ensuite par une pyrophosphatase (P-Pi 2Pi). Le phosphate restant (phosphate α) est lié par une liaison ester au carbone 3 libre du dernier nucléotide du transcrit en cours de synthèse. La transcription est un processus asymétrique, c est-à-dire que pour un gène ou un groupe de gènes donné, seul l un des deux brins de l ADN est transcrit. Le magnésium est indispensable pour que la réaction de transcription ait lieu. Toujours une triade d'acide aspartique pour tenir le triphosphate. Expression des gènes et biosynthèse des protéines : Transcription (Procaryotes) 1

Les étapes de la transcription : Initiation Reconnaissance du promoteur par l ARN Polymérase. Fixation de l ARN Polymérase sur l ADN : Séparation locale des 2 brins. Sélection et polymérisation des premiers nucléotides Elongation Déplacement enzyme minimum. A l avant : séparation des 2 brins, A l arrière : séparation hybride ARN-ADN simple brin puis reformation du double brin. Terminaison Terminateur, Arrêt de la polymérase, seul, cofacteur. III) ARN polymérase bactérienne A) Purification Il faut faire pousser les bactéries puis les lyser, en utilisant par exemple des détergents, ou ultrason. Puis une étape de centrifugation, on garde le surnageant (extrait soluble). On fractionne l'extrait soluble, en faisant une chromatographie : Échanges d'ions puis d'affinité. Puis on obtient une enzyme pure. Pour mesurer l'activité de l'arn polymérase, on ajoute ADN Mg 2+ /MN 2+ et 4 NTPs dont 1 NTP radioactif. On mesure la radioactivité incorporée dans l'arn. α 32 p : on mesure le nombre de nucléotide incorporé. Avec le γ 32 P c'est le nombre de chaîne. Les chaînes d'adn commencent le plus souvent par une purine (A ou G). La radioactivité montre que l'arn est synthétisé de 5' à 3'. Il y a une montre manière de montrer cela avec l α 32 P. B) Composition, rôle des sous-unités, assemblage et structure de l'enzyme Pour voir la composition de l ARN polymérase ADN dépendante on fait une électrophorèse faite dans des conditions dénaturantes, on ajoute du SDS. On remarque qu'elle renferme 5 sous-unités : β βσαω. Ce qui donne comme formule : α2ββ ωσ, une enzyme complet (= holoenzyme). L édifice est séparable en deux fractions : σ et α2ββ ω. α2ββ ω est l'enzyme minimum, c'est à dire le core enzyme, catalyse la réaction de synthèse de l ARN. Fonctionne seul lors de l élongation. L ARN 6S est un constituant supplémentaire de l ARN polymérase bactérienne. Cet ARN est impliqué dans la régulation expression des gènes chez les bactéries. Expression des gènes et biosynthèse des protéines : Transcription (Procaryotes) 2

α2 a pour rôle d assemble le core enzyme qui interagit avec des protéines régulatrices et parfois avec l ADN. Les sous-unités β β sont fondamentales pour la catalyse. La sous-unité σ permet d'amener la polymérase sur des promoteurs spécifique, il existe différent facteur σ. Le rôle de ω n'est pas encore clairement défini. Le rôle de la sous unité σ est déterminé par Isolement du complexe par filtration sur nitrocellulose qui fait passer les ADNs doubles brins mais pas la protéine. Facilite la formation du complexe ADN-Enzyme. ADN marqué et ADN polymérase, au temps 0 il y a addition ADN non marqué puis prélèvement à différents temps. Mesure de la radioactivité retenue sur le filtre : Sur le schéma on peut voir que l'holoenzyme est stable contrairement au core enzyme (qui se trouve donc sans facteur σ), le facteur σ stabilise la liaison de l'arn polymérase à l'adn double brin. Le facteur Sigma change les propriétés de liaison à l ADN de l ARN polymérase en réduisant son affinité pour l ADN général tout en augmentant celle pour les promoteurs. Le facteur sigma contrôle la spécificité. IV) Initiation de la transcription, l'unité de la transcription A) Convention, définitions Brin transcrit = brin matrice = brin non codant Brin codant (car il possède le code de l'arn) = brin non transcrit Promoteur: Une région d ADN qui fixe la polymérase lors de l initiation de la transcription. Point d initiation: La position sur l ADN correspondant à la première base incorporée dans l ARN. Terminateur: Une séquence d ADN qui induit la terminaison de la transcription par l ARN polymérase. Unité de transcription: La séquence d ADN entre le site d initiation et de terminaison de la transcription; l unité peut renfermer plusieurs gènes (opéron). Un promoteur est toujours associé à une unité de transcription. Expression des gènes et biosynthèse des protéines : Transcription (Procaryotes) 3

Convention d identification des éléments d une unité de transcription. Le +1 c'est là ou est initié la transcription. Elle commence par la reconnaissance du promoteur par l'arn Polymérase. Fixation de lʼarn Polymérase sur l ADN : Séparation locale des 2 brins, Sélection et polymérisation des premiers nucléotides. B) Identification des sites d initiations Il y a 2 approches pour identifier un site d'initiation pour un gène donné : Cartographie à la nucléase S1 (S1 mapping), mais qui n'est plus utilisé, et l'allongement d'amorce. Pour les deux approches : préparation de l'arn total. La nucléase S1 aime bien casser les simples brins, mais laisse les doubles brins. L'urée est l'idéal pour détruire les liaisons hydrogènes (NH2)²=C=O. Pour le S1 mapping il faut disposer du brin transcrit renfermant les parties 5 et amont du gène étudié. Marquage de l extrémité 5 du brin transcrit au 32 P (sonde). Un fragment d ADN simple brin correspondant au brin transcrit est préparé puis marqué à son extrémité 5. Après hybridation à l ARN et digestion à la nucléase S1 la détermination de la taille du fragment protégé indique approximativement ou débute la transcription. Pour déterminer le site précis d initiation : séparation sur un même gel du fragment protégé et des produits d une réaction de séquençage chimique de la sonde. Expression des gènes et biosynthèse des protéines : Transcription (Procaryotes) 4

Identification du site d'initiation par extension d'amorce. On choisit une sonde d'adn radioactif (obtenue à partir du gène d'intérêt ou de la protéine). On sélectionne ensuite les ARN désirés grâce à cette amorce, puis allonge cette amorce par transcription inverse. La synthèse d'adn s'arrête lorsque la polymérase a atteint l'extrémité 5' de l'arn, soit le site d'initiation de la transcription. Une analyse par électrophorèse sur gel puis autoradiographie nous permet de déterminer la taille des fragments synthétisés, et donc la distance entre la sonde et le site d initiation de la transcription (TTS). La position de la sonde étant connue, on peut en déduire celle du site d initiation de la transcription. C) Identification du site de fixation de l ARN polymérase On peut identifier le site de fixation de l ARN polymérase grâce à la technique de foot-printing (empreinte). On utilise une enzyme lors de l'empreinte qui est la Dnase I, et on va utiliser un fragment d'adn (on peut aussi utiliser des radicaux hydroxyles). Cela consiste à soumettre le fragment d ADN protégé par l enzyme (protéine) à une digestion endonucléasique ménagée qui va pouvoir couper toutes les liaisons phosphodiester accessibles, mais en provoquant statistiquement une coupure par molécule On suspecte que la polymérase va se fixer à proximité. La première étape de cette réaction, on va marquer le fragment d'adn qui est utilisé, à une de ses extrémités en ajoutant du P 32. Si on ajoute de la protéine, elle va reconnaître sa séquence cible. Sur le test on a mis de la protéine ou de l'adn seul on rajoute de la Dnase qui clive l'adn double brin. On va mettre très peu d enzyme, chaque brin va être clivé une fois, donc un clivage par molécule, mais ne sera pas la même à chaque fois. La différence entre les deux c'est qu'à l'endroit où il y a la protéine il n'y a pas de coupure. L'étape suivant sera d'isolé les fragments d'adn qui sont marqués, et on va dénaturer ces fragments. On a séparé ses fragments par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Si on met trop de DNAse on risque de ne pas de voir l'empreinte, car il y aura que des petits fragments, on n aura pas tous les intermédiaire, donc il est important d'avoir un clivage par molécule. Il faut en parallèle mettre un séquençage chimique, pour identifier un certain de nombre de bases. L'ARN polymérase bactérienne protège la position -50 à +20. Réaction de Fenton : intérêt, libération d'oh et production de radicaux hydroxyles. Les radicaux hydroxyles vont faire un clivage de toutes les liaisons phosphodiester. Si on fait l'empreinte avec, site de protection de -35 à +5/+10. Les radicaux hydroxyles sont plus petits. L empreinte générée est moins claire qu avec le DNase. Expression des gènes et biosynthèse des protéines : Transcription (Procaryotes) 5

D) Identification des zones de contact, de proximité ADN /ARN polymérase Interférence de liaison. A partir d'un fragment d'adn qui tient le site de liaison de la protéine, la première chose qu'on va faire c'est une modification chimique de l'adn, en modifiant une base (exemple : le diméthyl sulfate, capable de modifier de N7 du G, N3 du C et le N1 du A. N'agit pas sur certaine position dans le double brin, car les positions sont impliqués dans la formation de liaisons hydrogènes. Sur le double on va simplement méthyler la position N7 du G.) On va se placer dans des conditions douces, (les flèches sont les positions de bases modifiées). La prochaine étape est la formation du complexe, l'interférence est à cet endroit. Si la base modifié se situe vers le site de liaison, certain complexe ne vont pas se formée, car la modification de certaine base l'en empêche. On va ensuite isoler le complexe sur un gel natif. On va éliminer la protéine, puis on va cliver l'adn au niveau du point de modification (flèche) on va ensuite une électrophorèse sur gel dénaturant, puis à la fin par une autoradiographie. On va avoir sur le même gène, le résultat de l'expérience sans protéine. Ce qu'on obtient est un profil d'interférence. E) Les éléments promoteurs reconnus par l'holoenzyme renfermant le facteur sigma 70 Certaines zones sont protégés, et en comparant ses éléments on voit qu'il y a des éléments conservés d'un gène à l'autre : éléments promoteurs. Séquence consensus des éléments promoteurs : Boite -35 TTGACA brin non transcrit Boite -10 TATAAT brin non transcrit Expression des gènes et biosynthèse des protéines : Transcription (Procaryotes) 6

La séquence autour du point de départ est aussi conservée. Dans 90% des cas, entre les boites -10 et -35 la distance est entre 16 et 18pb. Les promoteurs forts très actifs (2-5s) présentent une forte identité de séquence avec les séquences consensus. La liaison va être très efficace. Il y a même un élément en amont de la boite -35 qui va augmenter l'activité de la transcription. On peut modifier par mutation pour améliorer ou diminuer l'efficacité de la transcription. Il n y a pas assez de polymérase pour s'associer à l'ensemble des promoteurs. Comment l ARN polymérase trouve-elle les promoteurs? Le temps mit par L'ARN polymérase pour se fixer sur le promoteur est trop court pour être de la diffusion. Pour donc trouver plus facilement un promoteur, il va se fixer de manière aléatoire à l'adn puis par échange avec d autres séquences, jusqu'à trouver un promoteur. Ensuite l'arn polymérase va séparer les doubles brins, afin de former une bulle de transcription, puis la première liaison phosphodiester. Un dinucléotides va être mettre en place, formant un complexe ternaire, avec l'holoenzyme, le promoteur et le dinucléotides. La polymérisation se poursuit toujours avec une chaîne de 9 nucléotides avec enzyme immobile. Le facteur σ s'en va, et on passe en phase d'élongation. Il y a une possibilité néanmoins d initiation avortée. Départ de la chaîne en croissance ; reprise de la synthèse au premier nucléotide. La synthèse de l ARN a lieu dans la bulle de transcription. F) La bulle de transcription Cartographie de la bulle de transcription : La boite -10 est fréquemment ouverte, si on ouvre la paire de base AT, on va traiter cette paire de base, avec du DMS, il modifie également le N1 de l'adénine, seulement possible en simple brin. On referme, sauf aux endroits où il y a eu méthylation. Ensuite on va localiser les paires de bases qui ne se sont pas refermé. On va utiliser l'enzyme nucléase S1, qui va cliver seulement les régions simples brins, et on va avoir plusieurs fragments. Cela permet d'identifié ce qui faisait partit de la bulle de transcription. Différentes régions de l ARN polymérase contactent directement le promoteur. Le facteur σ 70 seul ne peut pas reconnaître l'adn, la structure change lorsqu'il est associé avec le core enzyme, ceci permet son interaction avec le promoteur. Mais si on élimine la partie N terminal de σ 70 permet la fixation au promoteur de σ tronqué seul. La structure du facteur sigma σ 70 est HtH, souvent lors d'interaction l'adn. Différentes région de σ 70 et α contribuent à la reconnaissance du promoteur. Expression des gènes et biosynthèse des protéines : Transcription (Procaryotes) 7

L hélice 2.4 de sigma donne la spécificité de reconnaissance de la boite -10. Une mutation sur la séquence -35 peuvent affecter la liaison de l ARN Polymérase. Une mutation sur la séquence - 10 peuvent comme -35 affecter la reconnaissance de l initiation de la transcription. Mais aussi empêcher l'ouverture de la double hélice. (Plus simple si les paires de bases sont AT). Les interactions entre le facteur sigma et le core enzyme changent lors de la libération du promoteur, quand on va en phase d'élongation. Un domaine de sigma occupe le canal de l ARN et doit être déplacé pour permettre la suite de la synthèse de l ARN. Les initiations avortées surviennent avant que l enzyme passe en phase d élongation. Le facteur Sigma est relargué lorsque la chaîne d ARN est constituée de 9 nucléotides. Il y a des changements de conformations importantes lors du passage initiation à élongation. Les petits cercles violets représentent les résidus acides dans 1.1 et 3.2 qui sont des modules mobiles dans sigma 70. Le cycle du facteur σ. Le facteur σ est associé avec le noyau de l ARN polymérase de façon transitoire ; il se dissocie du noyau au début de la phase d élongation et peut s associer avec un autre noyau pour initier la synthèse d une nouvelle chaine. La polymérase est ainsi relâchée. Expression des gènes et biosynthèse des protéines : Transcription (Procaryotes) 8

G) La substitution des facteurs σ et le contrôle de l'initiation Les activités des différents facteurs sigma sont régulées par différents mécanismes. Ça va être une compétition entre les facteurs σ. L'holoenzyme avec un σ 70 différent va reconnaître des promoteurs différents. Par exemple E Coli renferme 7 facteurs Sigma différents. Le facteur antisigma, une protéine qui va s'associer un facteur σ et inhiber sa capacité à reconnaître des promoteurs spécifiques. Il y a aussi le facteur anti-anti sigma. (Exemple de facteur : synthèse des flagelles) La réponse heatshock : Un jeu de gêne qui va être activé en réponse à une augmentation de température, causant une dénaturation des protéines. Tous les organismes ont cette réponse. Elles renferment des chaperons qui agissent sur les protéines mal repliées. Le facteur de choc thermique (σ E ) est libéré suite au clivage des RseA et devient actif à ce moment-là. Il est don inactif quand il est associé avec une protéine RseA. Pour libérer le facteur σ E RseA sera clivé 2 fois, et ainsi il pourra y avoir production de protéine de choc thermique. Les facteurs σ d E. Coli reconnaissent des promoteurs ayant des séquences consensus différentes. On a des distances spécifiques entres les boites selon les différents sigmas d'e. Coli. L'expression des facteurs sigma peut-être en cascade qui sont requis pour l expression des gènes. Une cascade de facteurs sigmas est créée quand un facteur sigma est requis pour la transcription du gène codant pour le facteur sigma suivant. Les gènes précoces du phage SPO1 sont transcrits par l ARN polymérase de l hôte. Chez Bacillus Subtillis la sporulation est contrôlée par une cascade de facteur sigma. On part d'une bactérie en phase végétative (croissance normale et division), l'adn est répliqué, on a une structure septum qui se met en place, et une copie de l'adn se met en place dedans, et il va y avoir mise en place d une spore avant relargage, et la cellule mère est lysée. La sporulation chez Bacillus subtilis est le résultat d une succession d événement ordonné. Expression des gènes et biosynthèse des protéines : Transcription (Procaryotes) 9

Sporulation Cascade de phosphorylation Une cascade de phosphorylation aboutit à la phosphorylation d un activateur de la transcription. Les facteurs sigmas changent dans les deux compartiments de la sporulation chez Bacillus subtilis. Chaque compartiment passe à l étape suivante d un nouveau facteur sigma qui déplace le facteur sigma précédent. La communication entre les deux compartiments coordonne le timing des substitutions des facteurs sigma. Phophorelay, une voie dans laquelle un phosphate passe progressivement d une protéine à une autre. σ F déclenche la synthèse, dans la préspore, de σ G et active SpoIIR qui lui-même active SpoIIGA qui clive alors pro-σ E. Les échanges d information entre la cellule mère et la préspore coordonnent le programme d expression des gènes. V) Élongation de la transcription Un modèle pour le mouvement de l enzyme est suggéré par la structure cristallographique. L ADN est en mouvement dans un canal de l ARN polymérase et forme un coude dans le site actif. Des changements dans la conformation de certains modules flexibles de l ARN polymérase contrôlent l entrée des nucléotides dans le site actif. Expression des gènes et biosynthèse des protéines : Transcription (Procaryotes) 10

Lors de la réaction de transcription il faut désenrouler la double hélice, puis la réenrouler. On va donc former des super tours positifs devant, et derrière des supers tours négatifs. L'élongation dans la transcription, chez e.coli à 37 sa tourne vers les 40-50 nucléotides par seconde contre 15 durant la traduction. La transcription est moins fidèle que la réplication car la réplication doit être parfaite alors que la transcription peut faires erreurs. L'ARN polymérase n'a pas d'activité exonucléasique, pas de proofreading (relecture). Mais endonucléasique : élimination de petits fragments en 3' de l'arn en croissance. Si on a une carence en rntp, arrêt de la polymérase, qui va donner le phénomène de backtracking. Pour corriger ça, il y va y avoir un retour en arrière et le petit fragment d ARN sera cliver. Elle le fait encore mieux avec des cofacteurs : GreA, GreB. Ceci donne donc l activité endonucléasique. La réaction pourra donc reprendre. La Vitesse de de l'arn polymérase est non uniforme, à cause de trafic sur l'adn, il peut y avoir déjà une autre polymérase en train de transcrire, ou bien à cause de l'ouverture de l'hélice, ou bien à causes des régions riche en GC. Il peut y avoir des régulateurs sur l'adn ; ou bien y avoir des travaux : des exonucléase, qui s'occupe de la réparation. L'ADN est réparé en permanence! L ARN polymérase établit et rompt des liaisons lors de chaque réaction de polymérisation. Lors de la phase de l'élongation une protéine supplémentaire NusA va se fixer sur le noyau d'enzyme en phase d'élongation. NusA à un rôle dans la terminaison et l'antiterminaison. Pendant toute la phase de l'élongation, NusA sera associé au noyau de l'enzyme à la place du facteur sigma. A la fin NusA est libéré pour laisser place de nouveau à sigma. Expression des gènes et biosynthèse des protéines : Transcription (Procaryotes) 11

VI) La terminaison de la transcription C'est l arrêt de la synthèse de l'arn et la libération de l'hybride ADN-ARN, Puis reformation du duplex ADN. Elle se produit sur les terminateurs, et il en existe deux classes : ceux qui sont reconnus par la polymérase elles-mêmes sans aucun autre facteur, qui sont qualifiés intrinsèques (80%). Les autres ont besoin d'une protéine et sont appelé terminateur rho dépendant. La terminaison intrinsèque nécessite un terminateur dans l'adn qui génère une structure en tige boucle dans l'arn produit par la transcription du terminateur. C'est donc le signal de terminaison se trouve donc dans les séquences transcrites et présente dans l'arn. Le terminateur se présente comme une séquence palindromique permettant ainsi la structure en tige boucle. Dans les boucles des terminateurs intrinsèques, il y a toujours une région qui contient des U au pied, et une autre région contenant des GC dans la tige. Dans l'adn, la région riche en GC est suivit d une région riche en AT. Ce qui donne une région riche en GC dans la tige, et riche en U au pied. Lorsqu'on arrive au terminateur, une région riche en GC permet un ralentissement, permet mise en place de la tige-boucle, puis arrêt de la transcription. NusA a pour rôle de rallonger les pauses de la polymérase. La déstabilisation de la structure de la bulle de transcription lors de la transcription d un terminateur intrinsèque est induite par la formation d une structure en tige boucle dans l ARN. La région riche en U se trouvant après la boucle est facile à rompre, cela entraine une déstabilisation de l hybride, et entraine le relargage de l ARN polymérase... Expression des gènes et biosynthèse des protéines : Transcription (Procaryotes) 12

Le facteur rho est une protéine héxamérique qui va s associer à l'arn, qui a d'énorme capacité, car peut se déplacer sur l'arn, jusqu'à rejoindre l'arn polymérase et entrainer la dissociation du complexe de transcription. Peut ouvrir les hybrides entre l'adn et ARN, activité hélicase. Entraine un changement de conformation de l enzyme, et donc entraine un relargage de l ARN polymérase. rut est un acronyme pour rho utilization site qui est la séquence de l ARN reconnue par le facteur rho. Chez la bactérie, la moitié des terminateurs sont de ce type. Il est fréquent chez les bactériophages. La terminaison rho dépendante a besoin d'un palindrome, il y a bien une tige boucle mais il y a absence de régions riche en U. Ceci entraîne une pause de la polymérase qui va s'arrêter au niveau de la tige boucle. NusA va aussi augmenter la durée de la pause. Puis la protéine Rho va ouvrir l'hybride. VII) L'antiterminaison Il constitue un mécanisme de contrôle. C est un signal moléculaire spécifique qui permet à l ARN polymérase de poursuivre la transcription au-delà des sites normaux de terminaison. On a ainsi une extension de l ARN. Ce mécanisme est présent chez les phages et les bactéries. Expression des gènes et biosynthèse des protéines : Transcription (Procaryotes) 13

Les phages utilisent l antiterminaison pour réguler les gènes précoces et tardifs. N et Q sont des protéines phagiques. Le mécanisme d antiterminaison peut fonctionner à des localisations différentes suivant les unités de transcription. Le produit pn est une protéine d antiterminaison qui permet à l ARN polymérase de continuer la transcription au-delà des sites terminateurs t L t R1 en agissant sur nut L ou nut R. Le produit pq est aussi une protéine d antiterminaison qui permet à l ARN polymérase de continuer la transcription au-delà du site t R en agissant sur qut. Cela ne se produit pas à l initiation ou à la terminaison, mais pendant la phase d élongation quand elle est en train de s allonger après le site nut/qut. La polymérase continue sa transcription et force le passage et continue la transcription au-delà du terminateur sans tenir compte de son signal. La liaison de facteurs à l ARN au niveau des séquences Nut ou Qut transcrites associe les protéines d antiterminaisons au terminateur via une boucla dans l ARN. Les sites nut renferment deux éléments : A et B. L élément A est retrouvé dans les systèmes bactériens ; il est indispensable pour la fixation de protéines bactériennes. L élément B est spécifique au phage. La mutation de B entraîne la disparition de l antiterminaison, B fixe la protéine N, il est donc indispensable. Des mutations ont été faites pour savoir quand N est sans effet : - Mutation du gène rpob qui code pour la sous-unité β ARN polymérase - Mutation des gènes NusA, B E et G important. Expression des gènes et biosynthèse des protéines : Transcription (Procaryotes) 14

Les complexes d antiterminaison de la transcription formés avec la protéine N, les séquences nut et les protéines d antiterminaison peuvent avoir des efficacités différentes. pn+ NusA permettent l antiterminaison à courte distance. L ARN polymérase est sous forme insensible au terminateur. complexe avec une faible processivité site nut < 200 bp du site de terminaison Le complexe d antiterminaison incluant les cinq protéines est stable et permet l antiterminaison à longue distance (> milliers de pb en aval du site nut) Complexe avec une haute processivité L ARN polymérase est sous une forme insensible au terminateur. VIII) Le contrôle de l expression des gènes chez les bactéries A) Les séquences cis et trans Il y a distinction de deux sortes de séquences, celles agissant en cis et celle agissant en trans. L élément cis agit sur lui-même, l information est à l intérieur de l ADN. L élément trans génère un produit (protéine ou ARN) qui régule l expression en s associant avec des éléments cis. L activité des gènes est régulée par des interactions spécifiques entre les produits des éléments trans avec les éléments cis. Tout produit d un gène libre de diffuser pour trouver sa cible est dit agissant en trans. Les promoteurs et les terminateurs sont des éléments Cis alors que la polymérase est un élément trans. B) Les gènes structuraux et les gènes régulateurs Gène structural : gène codant un polypeptide qui possède des fonctions enzymatiques ou structurales et qui est nécessaire pour le métabolisme normal et la croissance d une cellule ou d un organisme. (ARM, Protéine, ARNnc : ARNr, arnt ) Gène régulateur : gène dont la fonction primaire est de contrôler le taux de synthèse des produits d un ou de plusieurs autres gènes ou voies. (Protéine régulatrice, ARN régulateur, régulation expression autres gènes) Expression des gènes et biosynthèse des protéines : Transcription (Procaryotes) 15

Protéine régulatrice se lie à l ADN sur un ou plusieurs sites spécifiques. Les sites régulateurs se trouvent à proximité du promoteur. Régulation positive : L interaction de la protéine régulatrice avec sa cible active la transcription. La protéine régulatrice est appelée activateur. Régulation négative : L interaction de la protéine régulatrice avec sa cible inhibe la transcription. La protéine régulatrice est appelée répresseur. Le site de liaison du répresseur est appelée opérateur, l opérateur est donc la cible du répresseur. C) L opéron L opéron est un regroupement de gènes structuraux, Les gènes concourent à la réalisation d'une même fonction physiologique et sont transcrits ensemble. Production d un ARMm polycistronique (code pour plusieurs gènes) qui code pour des protéines avec des fonctions apparentées. L'utilisation d'arn messagers polycistroniques est un moyen pour la cellule de coordonner la synthèse protéique et de contrôler la quantité relative des produits codés par les différents cistrons. (Voies métaboliques et voies de transport par exemple). Les gènes sont individualisés chez les eucaryotes, à l exception de Caenohabditis elegans qui a 25% des gènes organisés en opérons. Expression des gènes et biosynthèse des protéines : Transcription (Procaryotes) 16

D) L opéron lactose renferme 3 gènes structuraux Le contrôle de l opéron dépend d un gène régulateur : le gène laci qui code pour le répresseur lac (tétramère), cela entraine une régulation négative sur les gènes lacz, lacy et laca qui codent pour des protéines. Une mutation dans laca ne donne aucun effet à court terme. Alors que dans lacz ou lacy donne une perte de la fonction. L allolactose (inducteur) est une molécule signal, isomère du lactose. La béta-galactosidase va cliver le lactose en galactose et glucose, consommé pour produire de l énergie, et une partie du galactose va générer de l allolactose. L IPTG est un inducteur gratuit de l opéron lactose, entièrement de synthèse qui est non métabolisé contrairement à l allolactose. En présence d un inducteur, un représseur devient inactif qui ne peux plus se fixer à l opérateur. L ARNm (Z,Y,X) a une demi-vie de seulement 3 minutes, mais l activité de la bétagalactosidase est plus stable. Induction : synthèse d enzymes en réponse à l apparition d un produit spécifique. Ce type de régulation est très répandu chez les bactéries et à lieu également chez les eucaryotes monocellulaire (levure). Enzyme inductible de 5 à 5000 molécules environs. Lors de l apparition de l inducteur, induction de l opéron qui provoque la synthèse d ARN puis synthèse d enzyme. L opéron lactose est un opéron catabolique c est-à-dire une réaction enzymatique qui permet de consommer quelque chose. Il y a deux sites de fixation sur le répresseur : Un domaine qui permet de fixer l inducteur qui induit un changement de conformation du répresseur, inhibe sa liaison à l opérateur. Et le DBD site de fixation à l opérateur qui est un domaine de la protéine se liant à l ADN (OB FOLD). Expression des gènes et biosynthèse des protéines : Transcription (Procaryotes) 17

Il existe un potentiel paradoxe dans la constitution de l opéron. L opéron lactose contient le gène structural (lacz) codant l activité béta-galactosidase nécessaire au métabolisme du sucre : il contient également le gène (lacy) codant la protéine nécessaire au transport du substrat à l intérieur de la cellule. Mais si l opéron est dans un état réprimé, comment l inducteur peut-il pénétrer dans la cellule pour débuter le processus d induction? Deux éléments garantissent la présence permanente d une quantité minimale de la protéine dans la cellule, suffisante pour débuter le processus d induction. Il y a en permanence un niveau basal d expression de l opéron : même lorsqu il n y a pas d induction, il est exprimé à un niveau résiduel. Et un petit nombre d inducteur de toute façon dans la cellule par un autre système d entrée. laca code pour la β-thiogalactoside acétyltransférase qui a pour rôle de permettant à la cellule d'utiliser les thiogalactosides. E) Les mutations du système de régulation de l opéron lac a) Mutant non inductibles Les mutants qui ne peuvent être exprimés sont dits non inductibles. Exemple : mutation lacl s. Absence de liaison aux inducteurs sur le répresseur. Le répresseur lié en permanence à l opérateur => super-réprimé. b) Mutant constitutifs L expression continue d un gène qui ne répond pas à la régulation est une expression constitutive. Les mutants possédants cette propriété sont des mutants constitutifs. L opérateur O c est une expression constitutive, car les mutants ne fixent plus le répresseur. Mutation du répresseur : I -, perte de fonction du mutant, expression constitutive. I -d perte de fonction de liaison à l opérateur, expression constitutive. Les mutations qui inactivent le gène laci sont de différents types. F) Le répresseur et l opérateur. a) Purification du répresseur Fixation à l IPTG marqué b) Fixation du répresseur à l opérateur Retard électrophorétique avec séquence ADN opérateur. c) Les caractéristiques de l opérateur Les frontières de l opérateur, empreinte DNase I -> -5 +21. On remarque la présence de motifs palindromique. Il est formé de 2 séquences répétées inversées; chaque répétition peut être considérée comme un demi-site pour l opérateur. Expression des gènes et biosynthèse des protéines : Transcription (Procaryotes) 18

d) Modes d action des inducteurs Liaison du répresseur à l ADN en présence de différents inducteurs potentiels (Lactose, galactose, glucose, allolactose, IPTG). Le promoteur/opérateur marqué, répresseur pur. Formation du complexe en présence d inducteur in vitro. Rétention sur filtre de nitrocellulose qui retient uniquement les complexes et pas ADN ou ARN seul. L IPTG est le meilleur inducteur, largement plus que le glucose ou le galactose. Il existe deux modèles pour la dissociation du répresseur : Soit l inducteur se lie quand le répresseur est sous forme libre ou bien directement quand le répresseur est lié à l ADN. L opéron lactose utilise le second modèle. La fixation de l inducteur induit un changement de conformation du répresseur (transition allostérique). e) Pourquoi le répresseur est-il sous forme tétramère? Vu qu un dimère se lie à un opérateur, un tétramère pourrait donc se lier à 2 opérateurs. Il y a présence de 2 sites supplémentaires : O2 et O3 en plus d O1. O1 est important au fonctionnement alors qu O2 et O3 augmentent l efficacité du système. Le répresseur se fixe sur O1 et sur O2 ou O3, formation d une boucle d ADN pour augmenter la probabilité d amener le répresseur sur O1. Les niveaux de répressions sont vus avec des mutations sur O1, O2 et O3. Aucune répression si O1 muté, mais il y a seulement une baisse du niveau de répression si O2 ou O3 mutés. f) Le répresseur et la fixation de l ARN polymérase à l ADN L ARN polymérase et le répresseur sont capable de fixer simultanément sur l ADN. La fixation du répresseur augmente l affinité de la polymérase. Lors de l induction, la transcription est initiée très rapidement. Expression des gènes et biosynthèse des protéines : Transcription (Procaryotes) 19

Analyse du mécanisme de répression sur des molécules uniques. Sur l extrémité 5 on met du fluorophore ainsi que sur la polymérase. Puis l ADN est lié à de la Biotine Streptavidine. Analyse de répression sur des molécules uniques, avec ADN sur ADN, et polymérase sur ADN. On voit qu on retrouve les Spot de la polymérase ADN sur l image d ADN sur ADN. On peut donc maintenant suivre les molécules uniques. La répression des catabolites : Dans un premier temps on met soit un milieu avec du glucose ou du lactose, le second avec les deux. On remarque que dans le premier le glucose ou le lactose est utilisé normalement, mais dans le second cas le glucose est d abord utilisé en premier puis vient le lactose. La cellule fait des économies d énergies car il faut d abord dégrader le lactose avant de l utiliser contrairement au glucose. Il y a contrôle de la source de carbone pour une utilisation préférentielle du glucose. La répression des catabolites repose sur une régulation positive => Activateur. Lorsque le glucose est indisponible comme source d'énergie, il est utilisé de préférence aux autres sucres. Ce choix est fait en empêchant l'expression de plusieurs opérons dont les opérons lactose, galactose et arabinose. Cet effet s'appelle la répression des catabolites. L entrée du glucose entraine la déphosphorylation de la protéine IIA Glc. La protéine IIA Glc déphosphorylée se lie à la lactose perméase et inhibe l entrée du lactose. Donc quand le glucose entre, il est impossible de faire rentrer du glucose. En effet tant qu il y a du glucose, elle n'a donc pas besoin des enzymes nécessaires au métabolisme du lactose. La régulation est liée à la concentration intracellulaire d AMP cyclique (Adénosine monophosphate phosphate lié au 5 du sucre). La présence du glucose entraine une diminution de la concentration d AMPc, tandis que l absence de glucose entraine une augmentation de la concentration d AMPc. L adénylate cyclase permet la production d AMPc à partir d ATP, et la phosphodiestérase de production de 5 AMP à partir d AMPc. Cet AMPc forme un complexe avec la protéine CAP (pour Catabolite gene Activator Protein, ou CRP pour camp Receptor Protein). Expression des gènes et biosynthèse des protéines : Transcription (Procaryotes) 20

La protéine IIA Glc déphosphorylée inhibe l activité de lʼadénylate cyclase. Alors que phosphorylée elle stimule l activité de lʼadénylate cyclase Puis après la formation du complexe, la protéine CRP s associe alors à l ADN sous la forme d un Homodimère de deux sous-unités de 22.5KD, qui peut être activé par une seule AMPc. Un monomère CRP contient une région de liaison à L ADN et une région activatrice de la transcription. Le CRP se fixe à un site d une vingtaine de paires de bases au niveau d un promoteur réactif. Les sites de liaison sont des variations de la séquence consensus. CRP est liée à la faible efficacité du promoteur, ayant de mauvaises séquence -35 et -10. Mode d action de la protéine CRP : Il y a une interaction directe avec l ARN polymérase, et une interaction avec l ADN induit un changement de structure facilitant la liaison de la polymérase. Les 2 phénomènes interviennent. Si on fait une délétion sur la partie C-terminal de la sous-unité α : i y a absence d activation. La CRP augmente la vitesse de fixation de fixation de la polymérase, et augmente la vitesse d un complexe. L association entre ADN et CRP induit un coude dans l ADN. Donc en absence de glucose sur l opéron lac, le CRP se fixe à l ADN, fixation de la polymérase, alors qu en présence de glucose, le CRP ne se fixe pas à l ADN, et donc la polymérase non plus. On a un fragment d ADN qui renferme le site de liaison à la protéine CRP. Est-ce que la liaison de la protéine entraîne un changement de conformation? On génère des sondes de différents sites. On marque les extrémités au P32 et on va générer des complexes ADN-Protéines. On va séparer ses différents complexes sur un gel, et on a des complexes qui migrent plus rapidement que d autre, ce qui nous indique que la protéine entraîne une modification de la conformation. S il était resté linéaire, tous aurait migré d une manière linéaire. La CRP régule aussi l expression d autres opérons : Opérons galactose et Arabinose. Opéron tryphosphane Un réseau d opérons sous la dépendance d un même régulateur est appelé régulon. Un exemple est le tryptophane. L opéron tryptophane est un exemple d opéron anabolique. Il est composé de 5 gènes structuraux : TrpE, TrpD, TrpC, TrpB et TrpA. Il y a un promoteur, un opérateur et la présence de 2 terminateurs situés après les gènes structuraux, l un est un terminateur intrinsèque et l autre est rho dépendant. trpr gène non lié à l opéron, code pour le répresseur. Seul il est incapable de se lié à l opérateur, il a besoin de tryptophane pour se lier à l opéron, le tryptophane est un corépresseur. On a alors obtention de la forme active du répresseur, et sa liaison à l ADN va arrêter la transcription. En absence de tryptophane il y a production d enzymes qui permettent de produire du tryptophane. Expression des gènes et biosynthèse des protéines : Transcription (Procaryotes) 21

Il y a présence d un autre site de régulation. Si on délète la partie se trouvant entre l opérateur et TrpE, et en présence de tryptophane, on a augmentation de l expression de l opéron, il y a donc un autre mécanisme indépendant de la répression. Ce mécanisme se nomme atténuation. Ce mécanisme fut mis en évidence par Charles Yanofsky. La transcription se trouve stoppée avant les gènes structuraux. Devant les gènes structuraux il y a une courte séquence codante de 14 acides aminés appelée ARN leader. Juste après la séquence 4 (voir schéma du dessous) on voit une série de U, la séquence 3 et la séquence 4 peuvent s apparier, un terminateur intrinsèque peut se former, et donc ne pas produire le reste. La régulation dépend donc de la formation ou non du terminateur intrinsèque. Il dépend de la concentration en tryptophane. S il y en a, la terminaison sera efficace (139 nucléotides), mais en absence il y aura formation d un grand ARN (7000 nucléotides). Le mécanisme de l atténuation repose sur un couplage entre la transcription et la traduction. L ARNm leader renferme deux codons tryptophanes, s il y a cadence en tryptophane arrêt du ribosome sur le codon tryptophane. De ce fait la séquence 2 est libre, et elle peut s hybrider avec la séquence 3, de ce fait la polymérase peut continuer la transcription. Tout dépend donc de la Expression des gènes et biosynthèse des protéines : Transcription (Procaryotes) 22

synchronisation entre la transcription et la traduction, qui se repose sur le fait que le ribosome suit la polymérase. Expérience semblable en présence d un oligonucléotide anti 1 complémentaire à la région 1, 2 est synthétisé avec 3. Poursuite de la transcription. In vivo isolement des mutants avec absence de régulation. Perte association entre régions 3 et 4. Si on isole les révertants, on retrouve la régulation, association 3-4 par mutation compensatoires. D autres opérons utilisent cette forme de régulation. Opéron Histidine, avec la présence de 7 histidines dans le peptide leader sous forme de régulation de l expression de cet opéron. Deux autres opérons : opérons Leucine avec un peptide leader avec 4 leucines, et opéron thréonine avec un peptide leader avec 7 thréonines. Un même répresseur peut agir sur plusieurs unités de transcription, par exemple le répresseur tryptophane peut agir sur 3 unités : l opéron tryptophane, le gène aroh et le gène régulateur trpr, réprimé par le produit du gène. Autorégulation. Le répresseur de l opéron Tryptophane contrôle l expression de différents gènes. Les opérateurs peuvent être localisés à différents position par rapport au promoteur. Le contrôle de la terminaison de la transcription de l opéron tryptophane chez bacillus subtilis est différent de celui d E. Coli. Trap complexe : complexe de 11 protéines dont chaque membre fixe le tryptophane. A haute concentration la liaison du tryptophane induit un changement de conformation du complexe permettant sa liaison à l ARN naissant (5 UTR ou 5 Leader) de l opéron tryptophane. La liaison du complexe à l ARN induit une formation d un terminateur. Lorsque la concentration de Trp est faible le complexe TRAP ne s associe pas à l ARN et la formation d un stem anti-terminateur permet la poursuite de la transcription. Le repliement différentiel induit d un ARN en cours de synthèse est déterminant pour la poursuite ou l arrêt de la transcription. Les T-Box RNAs, sont rencontré dans les 5 UTR des gènes qui codent les aminoacyl-arntsynthétases ou les gènes de biosynthèses des acides aminés des bactéries Gram+. La reconnaissance des T-Box repose sur des appariements entre T-Box et anticodon des l ARNt. Le mécanisme des T-Box : Dans la partie de gauche on a le système qui fonctionne avec un ARNt qui aminoacylé ou il n'y a pas de changement de conformation, poursuite de la synthèse et le second ou il n'est pas aminoacylé formation d'un antiterminateur qui permet à la polymérase de continuer. Expression des gènes et biosynthèse des protéines : Transcription (Procaryotes) 23

L antiterminaison par la liaison d une protéine : la protéine HutP régule l opéron hut chez B. Stubilis en réponse à la L-His. Un homohexamère de HutP se lie à une UTR de l ARN localisée entre le gène hutp et l opéron hut produisant les enzymes catabolisant la L-His. HutP reconnaît l ARN seulement après avoir fixé la L-His. HutP reconnaît des triplets NAG. La liaison de HutP détruit le terminateur. Antiterminaison dirigée par une petite molécule : activation de gêne par destruction d un terminateur. Les riboswitches. Un riboswitch est composés d un aptamère et d une plateforme d expression. Un riboswitch est une structure d'arn présente sur un ARN messager et qui peut lier directement un ligand (une petite molécule). Cette fixation déclenche un effet sur l'expression du gène porté par l'arnm en bloquant ou en activant la traduction de la protéine correspondante. Les riboswitches sont ainsi une des voies possibles de régulation de la traduction. L architecture de la plate-forme contrôle l expression. La molécule se fixe au niveau de l'aptamère et cela provoque un changement de conformation dans la plate-forme d'expression. Un riboswitch spécifique de la guanine. Riboswitch qui marche en fixant directement la guanine, on va générer une anti-terminaison. En absence de guanine il n'y aura donc pas d'antiterminaison. Ce riboswitch contrôle l opéron xpt-pbx de B. subtilis qui code pour une xanthine phosphoribosyltransférase et une xanthine perméase. La liaison de la guanine à l ARN est un déterminant critique pour le métabolisme des purines dans certaines bactéries. Il y en a aussi un qui est spécifique de l'adénine, mais là il y a un anti-terminateur qui se forme en absence d'adénine. IX) Les stratégies de régulation de l expression des gènes chez le bactériophage lambda. Pour les phages SPO1 ou T7, après infection de la bactérie il y a multiplication du phage puis lyse de la bactérie ; c est la voie lytique. Il existe une forme supplémentaire de propagation pour le phage lambda : la voie lysogène. Dans la voie lysogène, après infection il y a intégration du génome de la bactérie ; ceci génère un prophage. La voie lytique donne une immunité à la bactérie, lors de l induction il y a libération du prophage et reprise de la voie lytique. Le phage lambda peut suivre la voie lytique ou lysogène : Expression des gènes et biosynthèse des protéines : Transcription (Procaryotes) 24

La voie lytique (schéma de droite) est divisée en différentes périodes. L expression des gènes précoces immédiats et des gènes retardés est nécessaire à la voie lytique et à la voie lysogène. Lambda a 2 gènes précoces immédiats (N et Cro) qui sont transcrits par l ARN polymérase de l hôte. Le produit du gène N est requis pour l expression des gènes précoces retardés. Trois des gènes précoces retardés sont des gènes régulateurs. La lysogénie requiert l expression des gènes précoces retardés cii et ciii. Le cycle lytique nécessite l expression du gène précoce immédiat cro (réprésseur) et du gène précoce retardé Q. Le cycle lytique dépend de l antiterminaison par la protéine N (pn). pn est un facteur d antiterminaison qui permet à la polymérase de poursuivre la transcription au-delà du terminateur. pq est le produit d un gène précoce retardé et c est une protéine antiterminatrice qui permet à la polymérase de transcrire les gènes tardifs. L ADN du phage lambda est circularisé après infection. Le phage lambda a trois stades d expression des gènes lors du cycle lytique. Expression des gènes et biosynthèse des protéines : Transcription (Procaryotes) 25

Le circuit de la lysogénie est maintenu par la protéine répresseur de lambda (schéma de droite). Le répresseur de lambda est code par le gène ci. Le répresseur de lambda agit sur les opérateurs O L et O R operators pour bloquer la transcription des gènes précoces immédiats. L expression des gènes précoce immédiats permet une cascade d expression de gènes, la répression de ces gènes empêche la mise en place du cycle lytique. La lysogénie confère une immunité contre les infections ultérieures par d autres phages. Le répresseur de lambda et ses opérateurs définissent la région d immunité. L ARN polymérase initie à P L et P R mais pas à P RM durant le cycle lytique. Le répresseur de lambda se lie à l ADN sous la forme d un dimère. Un monomère de répresseur a deux domaines distincts. Le domaine N-Terminal contient le DNA-Binding domain (domaine de liaison à l opérateur). Le domaine C-Terminal permet la dimérisation. La liaison à l opérateur se fait sous la forme d un dimère. Le clivage du répresseur entre ses deux domaines réduit l affinité de la protéine pour l opérateur. Le clivage du répresseur induit le cycle lytique. Le motif de liaison à l ADN du répresseur du répresseur est un motif hélice coude hélice. La DBD d une molécule de répresseur contacte un demi-site de liaison. Le DNA-Binding domain du répresseur renferme deux courtes hélices α qui rentrent dans les sillons majeurs de deux tours d hélices successifs. Le DNA-Binding site est une séquence palindromique (partielle) de 17pb. La séquence en acide aminés de l hélice de reconnaissance établit des contacts avec des bases particulières de l opérateur. Les dimères de répresseur Lambda se lie coopérativement à l ADN. Les opérateurs O L et O R renferment 3 sites de liaison du répresseur (O L 1 O L 2 O L 3 ; O R 1 O R 2 O R 3). La liaison d un dimère de répresseur à un opérateur augmente l affinité de liaison d un autre dimère de répresseur à un opérateur adjacent. L affinité du répresseur est 10 x plus grande pour O L 1 et O R 1 que pour O L 2 et Expression des gènes et biosynthèse des protéines : Transcription (Procaryotes) 26

O R 2. La coopérativité permet au répresseur de se fixer sur les sites O L 2/O R 2 à de faibles concentrations. Si O L 1, O R 1, O L 2 et O R 2 sont occupés alors O L 3 et O R 3 restent libres. O L 3 et O R 3 sont utilisé en cas de mutation dans O L 1 et O R 1. Le répresseur de lambda maintient un circuit d autorégulation. Le DNA binding domain du répresseur sur O R 2 contacte l ARN polymérase et stabilise sa liaison sur P RM. Ceci constitue la base de l autorégulation du maintien de la production du répresseur. La liaison du répresseur sur O L bloque la transcription du gène N à partir de P L. La liaison du répresseur sur O R bloque la transcription de cro mais elle est requise pour la transcription de ci. La liaison du répresseur sur les opérateurs O R et O L bloque l entrée dans le cycle lytique et permet sa propre synthèse. Le répresseur maintient la lysogénie mais cette protéine est absente dans le cycle lytique : La coopérativité dans les interactions augmente la sensibilité de la régulation. Les dimères de répresseur liés à O L 1 et O L 2 interagissent avec les dimères liés à O R 1 et O R 2 pour former des octamères. La coopérativité des interactions permet de bloquer très efficacement les promoteurs PR et P L. Le répresseur à faible concentration peut se lier sur O R 2 et O L 2. Les produits des gènes cii et ciii sont requis pour l établissement de la lysogénie. Les produits des gènes précoces retardés cii et ciii sont requis pour que la polymérase initie la transcription sur le promoteur P RE. cii agit directement au niveau du promoteur et ciii protège cii de la dégradation. La transcription à partir de P RE permet l établissement de la synthèse du répresseur et bloque l expression du gène cro. L établissement de la synthèse du répresseur utilise un promoteur particulier : Expression des gènes et biosynthèse des protéines : Transcription (Procaryotes) 27

La production d un ARN dont la partie 5 contient l antisens du produit du gène cro va entraîner l arrêt de la traduction de l ARNm codant pour cro. Le promoteur P RE est un promoteur faible qui nécessite la protéine cii pour être fonctionel. P RE à des séquences -10 et -35 atypiques. L ARN s associe au promoteur uniquement en présence de cii. cii se lie à une région proche de la boîte -35. La lysogénie nécessite une série d événements. cii et cii permettent de mettre en place la synthèse du répresseur. La production du répresseur bloque l expression des gènes précoces immédiats et tardifs. Le répresseur met en place le circuit de maintenance de se propre synthèse. Dans le stade final de l établissement de la lysogénie l ADN de lambda est intégré dans le génome bactérien. La voie de la lysogénie conduit à la synthèse du répresseur : Expression des gènes et biosynthèse des protéines : Transcription (Procaryotes) 28

Le répresseur Cro est requis pour la voie lytique. Cro se lie aux mêmes opérateurs que le répresseur de lambda mais avec des affinités différentes. La meilleure affinité est pour O R 3 ; l affinité est équivalente pour O R 2, O R 1, O L 2 et O L 1. Quand cro s associe à O R 3 il empêche la liaison de la polymérase à PRM et bloque ainsi le promoteur impliqué dans la maintenance du répresseur. Quand cro se lie aux autres éléments de l opérateur dans O R ou O L, il empêche l ARN polymérase d exprimer les gènes précoces immédiats ce qui indirectement bloque l établissement de la synthèse du répresseur. La voie lytique conduit à l expression du gène cro et des gènes tardifs. Qu est ce qui détermine la balance entre lysogénie et cycle lytique? Après l expression des gènes précoces retardés Cro et le répresseur sont présents. L événement critique se réalise si cii permet une synthèse suffisante du répresseur pour supplanter l action de cro. cii influence le choix entre lyse et lysogénie. Les protéines clés de la lysogénie et du cycle lytique? Le répresseur joue un rôle déterminant dans la lysogénie et Cro est déterminant pour le cycle lytique. Expression des gènes et biosynthèse des protéines : Transcription (Procaryotes) 29

cii influence le choix entre lyse et lysogénie. La présence de cii permet la synthèse de ci à partir de PRE. L augmentation de la stabilité de cii augmente la fréquence de la lysogénie. ciii protège cii de la dégradation par les protéases de l hôte (protéines HflA et HflB). Mutations dans le gène hfla favorise la lysogénie en permettant la stabilisation de cii. A l inverse la dégradation de cii entrainera une absence de synthèse de ci et l engagement dans le cycle lytique. L activité des protéases HlfA et HlfB est dépendante de la concentration en AMPc. Dans le cas d un milieu de culture riche avec une concentration élevée de glucose, le milieu intracellulaire renfermera des protéases très actives car la concentration en AMPc sera faible. La protection de cii par ciii sera insuffisante et entraînera la dégradation de cii et l induction du cycle lytique. Dans le cas d un milieu de culture pauvre avec concentration faible de glucose, le milieu intracellulaire renfermera des protéases peu active car la concentration en AMPc sera forte. La synthèse favorisée de cii permettra l engagement dans la voie de la lysogénie. L activation de la transcription sur les promoteurs bactériens : Dans a) l activateur contacte la partie N-Terminal de la sous-unité alpha. Dans b) l activateur interagit avec le domaine 4 du facteur sigma70. Dans c) l interaction de l activateur avec le promoteur permet un positionnement correct de l ARN polymérase. Expression des gènes et biosynthèse des protéines : Transcription (Procaryotes) 30