Chromatographie En 1906 Michael Tswelt, un botaniste russe, a fait percoler une extrait de plante à travers une colonne remplie de poussière de craie (CaCO3). Il a obtenu plusieurs bandes de couleurs différentes. C'est ainsi qu'est née la chromatographie (chromos: couleur). La technique a été étendue aux milieux gazeux et diverses propriétés outre l'adsorption sur un solide sont aujourd'hui utilisées. Le travail est effectué individuellement pour l extraction (#1), un extrait par deux équipes sera asséché et chromatographié (#2 à #5). Chaque étudiant récupère les résultats et produit un rapport. 1. Extraction et purification des pigments de feuilles d'épinards 2. Préparation de l échantillon pour la chromatographie 3. Chromatographie sur gel de silice en couche mince 4. Identification de 4 pigments séparés 5. Tests de phases mobiles VOUS TRAVAILLEZ AVEC DES SOLVANTS ORGANIQUES. IL Y A RISQUE D'INCENDIE. N'UTILISEZ PAS DE BRÛLEUR OU DE PLAQUES CHAUFFANTES. Matériel fourni: Épinards, mortier et pilon Éthanol 95%, éther de pétrole (30-60), cyclohexane, acétone. Plaque chromatographique de silice 20 x 20 cm Jarre à chromatographie pour plaque 20 x 20 cm Éluants : A) Éther de pétrole : acétone [8 : 2] B) Éther de pétrole : acétone [7 : 3] C) Éther de pétrole : acétone [6 : 4] D) Éther de pétrole : acétone : cyclohexane [70 : 25 : 5] E) Éther de pétrole : acétone : cyclohexane [80 : 15 : 5] F) Éther de pétrole : acétone : cyclohexane [85 : 10 : 5]
1. Extraction et purification des pigments (travail individuel) Peser environ 3 g de feuilles d'épinards (prenez la partie vert foncée en enlevant les nervures et les tiges) que vous défaites en petits morceaux. Placer les feuilles dans le mortier et ajouter une spatule de sable. Ajouter environ 30 ml d'éthanol à 95% et broyez plusieurs minutes. Décanter le liquide dans un bécher de 100 ml Ajouter de nouveau 20 ml d'éthanol dans le mortier et broyer. Décanter le liquide dans le bécher de 100 ml, laisser reposer quelques minutes, puis filtrer au moyen d'un entonnoir avec un tampon de ouate, dans une fiole conique de 125 ml. Transférer l'extrait obtenu (il est dans une fiole conique de 125 ml) dans une ampoule à décantation de 125 ml. Ajouter 5 ml de NaCl 1M qui facilitera le passage dans l'éther de pétrole en diminuant la solubilité des produits dans l'éthanol. Ajouter 20 ml d'éther de pétrole. Mettre le bouchon et renverser l'ampoule. En tenant l'ampoule à l'envers (robinet vers le haut), ouvrir le robinet pour éliminer la surpression due à l'éther de pétrole. Refermer le robinet. Agiter légèrement et éliminer de nouveau la surpression. Agiter plus fortement, éliminer la surpression et laisser reposer pour que les deux phases se séparent. Transférer la phase alcoolique (inférieure) dans la fiole conique initiale et la phase éther de pétrole (supérieure) dans une fiole conique propre. Recommencer l'extraction de la phase alcoolique avec une nouvelle portion de 20 ml d'éther de pétrole. Combiner les deux fractions d'éther de pétrole. Transférer les fractions d'éther de pétrole dans l'ampoule à décanter. Ajouter 20 ml d'eau et extraire en conservant la fraction éther de pétrole. Cette opération élimine les traces d'alcool de la fraction éther de pétrole. Transférer la fraction éther de pétrole dans une fiole conique de 125 ml propre et sec. Ajouter suffisamment de sulfate de sodium anhydre pour éliminer toute trace d eau Décantez la fraction éther de pétrole dans une autre fiole conique de 125 ml propre et sec 1 *. 2. Préparation de l échantillon pour la chromatographie (travail en équipe de 4) Évaporer à sec : Dans la hotte, placer une cuvette métallique remplie d'eau chaude du robinet. Ajuster un tube de caoutchouc à la sortie d'air comprimé et ouvrer doucement le robinet pour obtenir un léger courant d'air. D'une main tenir la fiole conique contenant la fraction éther de pétrole et de l'autre tenir le tube d'air. Placer la fiole dans 1 Propre et sec (nettoyer et rincer à l eau, assécher à l acétone) 2
le bain d'eau chaude et faire circuler l'air dans la fiole conique jusqu à ce que le solvant soit complètement asséché. (Un seul membre par équipe de 4 fait cette partie) Reprendre le résidu coloré par un petit volume (2*300µL) d'éther de pétrole et le transférer dans un eppendorf Utiliser cette solution pour faire la chromatographie. 3. Chromatographie sur gel de silice en couche mince (en équipe de 4) Le solvant d'élution sera préparé par la technicienne et déposé dans les jarres à chromatographie. À moins d avis contraire ce sera l éluant B (cf. pp1) La chromatographie se fera sur gel de silice ne couche mince (CCM), nous utiliserons une feuille d aluminium comme support à la couche mince de silice. Manipuler toujours les chromatogrammes avec des gants pour éviter leur contamination. Tracer très faiblement (sans pression sur le crayon), pour ne pas enlever la silice, une ligne à 2,5 cm au bas de la plaque à l aide d un crayon au carbone. Déposer par petites gouttes (1mm de diamètre) à l aide d une P20 (on vous montrera) 300µL de votre extrait sur toute la ligne sauf les 3 derniers cm, où vous déposerez par petites portions un au même point 7µL, voir figure ci-contre. Déposer le chromatogramme dans la jarre et laisser développer environ 1h. Après vérification auprès du personnel enseignant, sortir le chromatogramme, marquer le front de migration de l éluant pour le dernier 3 cm seulement et laisser sécher sous la hotte. 4. Identification de 4 pigments séparés (en équipe de 4) Découper le chromatogramme comme indiqué et conserver la migration du 7 µl pour faire numériser, ce sera la figure 1 à mettre dans votre rapport. Préparer 4 tubes contenant chacun 1-2 ml d acétone, choisir 4 bandes de migration sur le reste du chromatogramme avec le personnel enseignant, les découper et les mettre séparément dans un des tubes contenant 1-2 ml d acétone. Agiter délicatement et prendre le spectre de chaque bande, à cette étape il est possible qu une dilution avec l acétone soit nécessaire si l absorbance maximale est trop élevée. À l aide des spectres fournis de standards, identifier chacune des bandes choisies. 250 7µL 5. Tests sur la composition de phases mobiles (travail en équipe de 4) Pendant la chromatographie principale, vous ferez 3 tests de composition de la phase mobile sur 3 petites bandelettes de gel de silice avec 3 solvants différents qui vous seront désignés. Déposer, par petites portions le 7 µl d extrait à 1,5 cm au bas de chaque bandelette de gel de silice. Placer les bandelettes dans des béchers suffisamment haut (probablement 400 ml) avec 1cm d un des éluants proposés (cf. pp1) et choisis avec l aide de l enseignant. Après une migration du solvant jusqu à deux centimètres de l extrémité supérieure de la bandelette (pas plus), sortir le chromatogramme et marquer le front du solvant. Numériser ou photographier vos bandelettes en indiquant clairement le solvant utilisé. 3
Rapport : (un rapport individuel) Vous présenterez votre rapport dans un fichier Word.. 1. Présenter la figure 1 montrant votre chromatogramme, numéroter chaque bande correspondant à celles découpées pour identification et calculer leur Rf. 2. Présenter les spectres des bandes que vous avez découpées du chromatogramme principal et identifier s il s agit d une Chl a, Chl b, Phéo a, Phéo b ou Caroténoïde en utilisant les maxima attendus des spectres de chaque substance, voir page suivante. 3. Présenter en une seule figure les chromatogrammes tests sur la composition de la phase mobile et jugez de la qualité de la séparation des pigments en fonction de la polarité de phase mobile. Lien vers le site pour les indices de polarité de Burdick & Jackson Index de polarité Exemples de calcul de l indice de polarité d un solvant : Solvant B) Éther de pétrole : acétone [7 : 3] Dans l index de Burdick & Jackson vous trouvez les indices pour Éther de pétrole 0,1 Acétone 5,1 Indice de polarité du solvant sera = ((7 x 0,1) + (3 x 5,1))/10 = 1,6 Solvant D) Éther de pétrole : acétone : cyclohexane [85 : 10 : 5] Dans l index de Burdick & Jackson vous trouvez les indices pour Éther de pétrole 0,1 Acétone 5,1 Cyclohexane 0,2 Indice de polarité du solvant sera = ((85 x 0,1) + (10 x 5,1) + (5 x 0,2))/100 = 0,6 4
Spectres des pigments photosynthétiques Chlorophylle a ou b. Ce site contient toutes les informations pertinentes sur les caractéristiques structurales et spectrales des différentes chlorophylles. http://fr.wikipedia.org/wiki/chlorophylle NB : Vous avez découpé une bande de coloration grise, il s agit d une chlorophylle dénaturée (lesmg2+ ont été remplacés par des H+) qu on nomme phéophytine, vous pouvez quand même identifié s il s agit d une Phéo a ou Phéo b selon l origine. Caroténoïdes Référer à la banque : http://lipidbank.jp/ 5