Mécanismes de l apoptose The Biology of Cancer ( Garland Science 2007) Jocelyn CERALINE ceraline@unistra.fr EA 4438/UdS/Faculté de Médecine/EA4438 Equipe Signalisation et cancer de la prostate Service d Hématologie et d Oncologie HUS
Les notions de mort cellulaire Événements non génétiquement programmés La nécrose est une mort cellulaire accidentelle faisant suite à une agression très violente. Elle induit une lyse cellulaire provoquant une réaction inflammatoire. 1 2 1. Gonflement des organelles Caryolyse Libérations des enzymes lysosomales 2. Rupture des membranes et désintégration de la cellule Réaction inflammatoire
Les notions de mort cellulaire Événements génétiquement programmés 1. La sénescence Arrêt irréversible de la prolifération cellulaire due à l érosion des télomères. Locus INK4a/ARF/INK4b 35 kb sur le chromosome 9p21 Epissage alternatif conduisant à l expression de trois gènes suppresseurs de tumeurs : p15 INK4b, p16 INK4a et ARF p16 INK4a et ARF partagent les mêmes exons 2 et 3, mais sont traduits dans un cadre de lecture différent Deux protéines distinctes (ce ne sont pas des isoformes) avec des fonctions distinctes. Levée de l inhibition de deux gènes suppresseurs de tumeurs prb et p53. Kim and Sharpless, Cell 127, Oct. 2006; p265
Les notions de mort cellulaire Événements génétiquement programmés 2. L autophagie L autophagie correspond à une vacuolisation de tout ou d une partie des constituants du cytoplasme. Les vacuoles sont ensuite présentées aux lysosomes pour une dégradation complète. L autophagie est considérée comme une adaptation de la cellule à son environnement. C est aussi un moyen utilisé par la cellule pour éliminer des constituants cytoplasmiques endommagés ou surnuméraires. Elle dépend de la voie de signalisation de mtor (target of rapamycine). Excessive, elle induit une mort cellulaire autophagique. Sarkar et al. Nat. Chem. Biol. 3: 331-338 (2007
Les notions de mort cellulaire Événements génétiquement programmés 3. L apoptose ou mort cellulaire programmée Première description par Kerr, Wyllie et Currie en 1972 (Br. J. Cancer 26, 1972, 239-257) Description de nouvelles caractéristiques morphologiques de cellules mourantes. Modifications distinctes de celles observées lors de la nécrose. Résultat d'un programme endogène sous-jacent de mort cellulaire appelé apoptose ou mort cellulaire programmée, suicide cellulaire. Le nom apoptose fait référence à la chute programmée des feuilles à l'automne : apo pour éloignement et - ptose pour chute.
Apoptose Processus par lequel des cellules déclenchent leur auto-destruction en réponse à un signal. C'est une mort cellulaire physiologique génétiquement programmée, nécessaire à la survie des organismes pluricellulaires. Rôle important au cours de l embryogenèse. L apoptose est en équilibre constant avec la prolifération cellulaire, et contribue ainsi à l homéostasie tissulaire. L apoptose est une cible des mécanismes moléculaires conduisant au cancer et à la résistance thérapeutique.
Apoptose Observation microscopique de l apoptose Les membranes plasmiques ne sont pas détruites Condensation périnucléaire de la chromatine Diminution du volume cellulaire Il n y a pas d'inflammation Fragmentation de la cellule La cellule émet des signaux entrainant sa phagocytose par les macrophages. Phagocytose des cellules fragmentées par les macrophages
Phénotype apoptotique Modifications biochimiques de la membrane cytoplasmique La membrane cellulaire garde sa cohésion tout au long du processus d apoptose mais elle bourgeonne transitoirement. Sa composition biochimique change : Il y a externalisation de la phosphatidylsérine. Il s agit d un phospholipide anionique initialement situé sur le feuillet interne de la membrane cytoplasmique. Cette externalisation implique l inhibition de l aminophospholipide translocase. La sphingomyéline se déplace en sens opposé et devient accessible aux sphingomyélinases qui la dégradent.
Phénotype apoptotique Mise en évidence de l externalisation de la phosphatidylsérine
Phénotype apoptotique Des modifications morphologiques et une fragmentation de l ADN Bourgeonnement de la membrane cytoplasmique et présence de corps apoptotiques Marquage avec un fluorochrome, le DAPI (4',6-Diamidine-2'- phenylindole dihydrochloride) qui se fixe spécifiquement à l'adn. Fragmentation de l'adn causée par les endonucléases induites durant le processus apoptotique. Coupure internucléosomale de l'adn conduisant à la libération de fragments oligonucléosomaux typiques de l'apoptose de 180-200 paires de bases. Visualisation de ces fragments sur un gel d'agarose sous forme de bandes multiples formant une "échelle d'adn" (DNA ladder).
Phénotype apoptotique Mécanismes moléculaires des changements nucléaires La fragmentation de la chromatine ( 50 Kpb) est attribuée à la migration nucléaire d une flavoprotéine mitochondriale, Aif (apoptosis inducing factor). La fragmentation de l ADN (180-200 pb) est attribuée à la migration nucléaire de l endonucléase G, initialement mitochondriale, et à la nucléase Cad (caspase activated Dnase). D autres endonucléases comme par exemple, la L-DNase II issue de la maturation de la protéine Lei (leucocyte elastase inhibitor) y contribuent également. Clivage de protéines cibles intracellulaires assurée par des caspases.
Phagocytose des corps apoptotiques Phénotype apoptotique
Phagocytose des corps apoptotiques La phagocytose est assurée par des cellules «spécialisées»(macrophages) ou «amatrices»(hépatocytes, cellules dendritiques). La phagocytose comporte une étape de reconnaissance puis une étape d ingestion. Les molécules de phosphatidylsérine externalisées et autres modifications de la membrane plasmique sont des signaux «mange-moi» adressés par la cellule apoptotique à la cellule phagocytaire.
Les voies de signalisation de l apoptose http://www.biooncology.com/bioonc/research/apo ptosis/index.m
Voies intrinsèques de l apoptose Les caspases (cysteinyl aspartate-cleaving proteases) Ce sont des protéases à cystéine. Un résidu cystéine inclus dans une séquence peptidique de type QACXG (X= R, Q ou G) est présent au niveau de leur site catalytique. Leurs sites de clivage au niveau des protéines cibles sont L/VEXD ou DXXD (X = n importe quel acide aminé). Les caspases clivent leur cible du côté carboxy-terminal de l acide aspartique. Applications Substrat Ac-DEVD-AFC [N-acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-AFC (7-amino-4-trifluoromethylcoumarin)] Inhibiteur Ac-DEVD-CHO [N-acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-CHO (aldéhyde) ].
Voies intrinsèques de l apoptose Les caspases Les caspases sont synthétisées sous forme de zymogènes ou procaspases inactives. Les procaspases seront ensuite clivées au niveau de résidus aspartate pour générer la caspase active. On distingue les caspases initiatrices et les caspases effectrices de l apoptose.
Les caspases Caspase initiatrices C. elegans : Mammifères : Prodomaine - DED (death-effector domain), - CARD (caspase activation and recruitment domain) bouquet de 6 hélices α : module d interaction protéique. Domaine d activation auto-catalytique Spécificité : L/VEXD. Caspase effectrices Prodomaine court Exécution de l apoptose en clivant des substrats spécifiques Spécificité : DXXD (X, n importe quel acide aminé).
Voies intrinsèques de l apoptose Les protéines de la famille de gènes Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) Au nombre de 25 à l heure actuelle
Voies intrinsèques de l apoptose Les protéines de la famille de gènes Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) Les domaines BH1, BH2 et BH3 des anti-apoptotiques (Bcl-2) forment une structure globulaire permettant une interaction avec le domaine BH3 des pro-apoptotiques. => Inhibition des anti-apoptotiques Equilibre ou déséquilibre en faveur ou en défaveur de l apoptose La surexpression de BCL-2 est un évènement courant au cours de la cancérogenèse. Exemple : le réarrangement chromosomique t(14;18)(q32;q21) dans les lymphomes folliculaires humain expression de BCL-2 sous le contrôle d un promoteur fort du gène des chaînes lourdes des immunoglobulines.
Voies intrinsèques de l apoptose La mitochondrie est au cœur de la machinerie apoptotique La mitochondrie séquestre dans son espace intermembranaire, une série de molécules solubles, les Simp (soluble intermembrane proteins). Quand les Simps quittent cet espace induction de l apoptose. C est le cas du cytochrome c, une hémoprotéine assurant le transport des électrons entre les complexes III et IV de la chaîne respiratoire mitochondriale. Au début du processus apoptotique, cette hémoprotéine quitte l espace intermembranaire à travers des canaux spécialisés et passe dans le cytosol.
Voies intrinsèques de l apoptose La mitochondrie est au cœur de la machinerie apoptotique La sortie du cytochrome c de l espace intermembranaire mitochondriale est contrôlée par les membres de la famille Bcl2. Bcl2, anti-apoptotique, inhibe la sortie du cytochrome c. Bax, Bad, Bak, et Bid, pro-apoptotiques, au contraire activent la sortie du cytochrome c. Une fois dans le cytoplasme, le cytochrome c va ensuite interagir avec des partenaires pour activer la caspase-9 La caspase-9 activée entraine une activation en cascade des autres caspases dans le cytosol (caspases -3 et -7 sont les premières).
Voies intrinsèques de l apoptose La protéine adaptatrice Apaf-1 connecte le cytochrome c à la cascade des caspases Apaf-1 (apoptosis protease-activating factor-1) = protéine cytosolique de 130 kda. Domaine CARD en N-terminal, un domaine d hydrolyse de l ATP et des motifs WD40 répétés C-terminaux. Cytochrome c cytosolique motifs WD40 exposés après hydrolyse de l ATP. Oligomérisation d Apaf-1 et interaction avec la procaspase-9 via les motifs CARD. => Complexe Apaf-1/Procaspase9/Cytochrome c ou apoptosome. => Activation de la caspase-9 initiatrice, puis de la caspase-3 effectrice.
La voie intrinsèque de signalisation de l apoptose The Biology of Cancer ( Garland Science 2007)
Rôle des caspases effectrices Clivage limité de protéines cytoplasmiques ou nucléaires impliquées dans : - la régulation du cycle cellulaire - la formation du cytosquelette - la signalisation intracellulaire - la réparation de l ADN [Poly(ADP-ribose)polymérase ou Parp], - l apoptose. Le clivage protéique conduit soit à une activation fonctionnelle, soit à une inactivation (Parp) de la protéine cible.
La voie extrinsèque de signalisation de l apoptose http://www.biooncology.com/bioonc/research/apo ptosis/index.m
Voies extrinsèques de l apoptose Les récepteurs à domaine de mort Ces récepteurs membranaires appartiennent à la superfamille du TnfR (tumor necrosis factor receptor) : TRAIL (TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand), Fas, DR (Death Receptor) 3, 4, 5. Ils possèdent dans leur partie intracytoplasmique C-terminale, une région conservée appelée domaine de mort DD (Death Domain, comme DED et CARD). Ligand + Récepteur Trimérisation recrutement de protéines cytosoliques FADD (fas associated death domain) Complexe DISC (death inducing signaling complex) activation des caspases 8 et 10.
Voies intrinsèques et extrinsèques de l apoptose
Contrôle des voies intrinsèques et extrinsèques de l apoptose Trois classes de molécules contrôlent les activités des caspases - BCL-2 qui bloque uniquement la voie mitochondriale en empêchant la sortie du cytochrome c des mitochondries. Structure de la protéine Bcl-2 en complexe avec un ligand de type acyl-sulfonamide. Source PDB 2021
Contrôle des voies intrinsèques et extrinsèques de l apoptose Les protéines IAP pour Inhibitors of Apoptosis. Ce sont des protéines d environ 80 acides aminés Structure des IAPs Famille des IAPs Domaines d interaction avec les protéines à motif IBM (IAPbinding motif) E3 Ubiquitine ligase IBM : Tétrapeptide avec alanine en N-ter retrouvé dans caspase initiatrice (caspase 9) et effectrice (caspase 7)
Contrôle des voies intrinsèques et extrinsèques de l apoptose Seule la protéine XIAP bloque in vivo les deux voies de signalisation de l apoptose. Elle inhibe l activation de la caspase-3 par la caspase-9 et empêche la libération de la caspase-3 de l apoptosome. La protéine Survivin inhibe l apoptose sans interaction directe avec les caspases. Le modèle proposé est une coopération avec XIAP. Lien avec le cancer Surexpression de la survivin dans la plupart des tumeurs Rôle important dans la survie des cellules cancéreuses Dario C. ALTIERI, Biochem. J. (2010) 430, 199 205 Facteur de risque de progression tumorale et d échappement thérapeutique.
Contrôle des voies intrinsèques et extrinsèques de l apoptose La protéine mitochondriale Smac/DIABLO Second mitochondria-derived activator of caspase/direct inhibitor of apoptosisbinding protein with low pi) Inhibiteur des activités des IAPs.)
Voies de signalisation de l apoptose induite par p53 Impact du génotype p53 sur la réponse des thymocytes à une irradiation
Ce qu il faut retenir L apoptose est une mort cellulaire génétiquement programmée Processus d élimination de cellules en voie de transformation Voie intrinsèque faisant intervenir médiateurs anti-et proapoptotiques Voie extrinsèque impliquant des récepteurs membranaires de mort Importance de la mitochondrie Différentes approches de mise en évidence de l apoptose Ne reflète pas toujours les effets cytotoxiques des agents anticancéreux Applications en thérapie anticancéreuse des récepteurs de mort.