LA BORRELIOSE DE LYME EN EUROPE

LA BORRELIOSE DE LYME EN EUROPE Olivier Péter 1, André Zwahlen 2, André Suard 3 1 Institut Central des Hôpitaux Valaisans, Microbiologie, 1950 Sion 2 Dép. Médecine interne et des maladies infectieuses, Hôpital de St-Loup Orbe, 1318 Pompaples 3 Dermatologue FMH, 1870 Monthey 1999, dernière révision mai 2008 Historique de la découverte En 1975, les observations de 2 mères de famille de la petite ville de Lyme (Connecticut, Etats Unis), allaient être à l origine de la découverte d une nouvelle maladie, la maladie de Lyme. En effet, ces 2 mères, d enfants atteints d arthrites suspectes d être de la forme rhumatoïde juvénile, révélèrent un nombre étonnement élevé de voisins atteints par la même maladie articulaire. Alerté par ces mères de famille, une équipe de l université de Yale mit en place un programme de surveillance épidémiologique du comté et révéla un certain nombre d atypies : une prévalence d oligoarthrite 100 fois plus élevée que l arthrite rhumatoïde juvénile, l expression des manifestations au cours de l été et une répartition des cas en foyers géographiques. Parmi les 51 cas recensés en 4 ans, 13 avaient rapporté une piqûre de tiques et présenté un érythème dans les 4 mois précédant l oligoarthrite. Pour ces chercheurs, il était évident qu il s agissait d une nouvelle maladie et la dénommèrent «arthrite de Lyme» (70, 73, 74). L étude prospective du collectif atteint permit la reconnaissance de l EM, de symptômes neurologiques et d autres complications, notamment cardiaques. En référence à l expression multisystémique des complications, la maladie fut rebaptisée «maladie de Lyme», mais l agent infectieux restait inconnu. En 1981, Willy Burgdorfer voulu démontrer la présence de rickettsies dans les tiques de chiens, Dermacentor variabilis, comme vecteur de la fièvre pourprée des Montagnes Rocheuses (Rocky Mountain spotted fever) à Long Island (New York) où la maladie semblait progresser. L absence de rickettsies dans ces tiques, orienta W. Burgdorfer vers d autres espèces de tiques, en particulier les Ixodes scapularis (I. dammini); à sa surprise, il mit en évidence des spirochètes (9). Dans le même laboratoire, A. Barbour parvint à cultiver ces spirochètes dans un milieu de Kelly modifié (5). Peu de temps après, l examen de tiques Ixodes ricinus de Suisse confirma la présence de spirochètes similaires en Europe (6, 10). La culture in vitro de ces spirochètes donna accès aux études bactériologiques, moléculaires et immunochimiques. Le spirochète fut dénommé Borrelia burgdorferi (31). Date de révision 2008-05-14 /OP 1 / 1

Borrelia burgdorferi (sensu lato) Figure 1 : Borrelia burgdorferi sensu lato Borrelia burgdorferi est une bactérie microaérophile, Gram négative, de 20-30 µ de long Avant la description de Borrelia et de 0.4 µ de diamètre. Les burgdorferi, une vingtaine d'espèces de flagelles au nombre de 7-11 Borrélies étaient recensées. Elles font lui assurent sa structure et sa toutes partie de la famille des mobilité. Spirochaetaceae. Toutes les borrélies sont pathogènes pour les animaux La croissance est lente (reptiles, oiseaux, mammifères) et/ou et optimale à 33-35 C. pour l'homme et sont transmises par des Elle nécessite un tiques, excepté Borrelia recurrentis milieu de culture très transmise à l'homme par le pou. Avant la riche. découverte du spirochète responsable de la maladie de Lyme par le Dr Willy Burgdorfer (9) en 1982, chaque espèce de Borrélie était associée à une espèce de tique précise, en général une tique «molle» ou Argasidae. B.burgdorferi par contre, est transmis par une tique dite «dure» ou Ixodidae. Très tôt Barbour et al (7), Wilske et al (78) ont démontré la relative homogénéité des isolements américains de B.burgdorferi et la grande variabilité observée parmi les souches européennes du point de vue du profil protéique et des réactions antigéniques avec des anticorps mono- et polyclonaux. En 1992, à l'aide d'anticorps monoclonaux, nous avons créé un système simple de classification basé sur la mobilité électrophorétique des principales protéines de surface, nommées OspA et OspB (50) (Table 1), identifiant 4 groupes parmi les 23 isolements obtenus des tiques du Valais. Le groupe I représentait le type B. burgdorferi ss, le groupe II (VS461), le groupe III (VS102) et le groupe IV (VS116). La même année, Baranton et collaborateurs (4) démontraient qu'en Europe l'espèce B. burgdorferi sensu lato (sl) représentait 3 espèces différentes sur la base de critères génétiques et phénotypiques. Ils décrivaient B. burgdorferi sensu stricto (ss), B. garinii, correspondant à nos groupes III et le groupe VS461. Une année plus tard Canica et collaborateurs (12) proposaient le nom de B. afzelii pour le groupe VS461. Le groupe VS116 était bien reconnu comme un autre groupe génétique et ce n est qu en 1997 qu il fut nommé B. valaisiana (77). Cette borrélie a par la suite été retrouvée dans différents pays d Europe (Grande-Bretagne, Irlande, Allemagne, les Pays Bas) et en Asie (Chine, Japon, Corée). Les isolements de ce groupe sont relativement peu nombreux et proviennent presque exclusivement de tiques. Dans le même temps, une autre espèce était définie, comme B. lusitaniae (36) à partir des trois isolements initiaux de tiques Ixodes ricinus du Portugal. Cette dernière espèce de borrélie inclut également des isolements de tiques en provenance d autres pays d Europe. Elle a également été retrouvée en Suisse (32). En 2004, une nouvelle espèces de Borrélie, B. spielmanii a été décrite sur la base d un isolement humain (biopsie de peau) suivi d un certain nombre d isolements de tiques (56). La distribution géographique de ces espèces n'est pas uniforme à travers le monde. En Amérique B. burgdorferi ss est largement prédominante et une autre espèce a été décrite B. bissettii en Californie. De même des isolements d'i. dentatus, une tique parasitant les lapins sur la côte Est, ont été nommés B. andersoni. En Europe occidentale et en Suisse en Date de révision 2008-05-14 /OP 2 / 2

particulier, B. garinii représente l' espèce dominante, suivie de B. afzelii puis de B. burgdorferi ss. En Suisse, 5 espèces ont été répertoriées et isolées des I. ricinus d' une même forêt (32). En Scandinavie et aux Pays Bas, B. afzelii est beaucoup plus largement répandue que B. garinii. Plus l' on s' éloigne vers l' Est B. burgdorferi ss disparaît (27, 58). Au Japon, outre B. garinii et B. afzelii, B. valaisiana a été identifiée et certains isolements d' I.ovatus forment un autre groupe génétique, appelé B. japonica (52). D autres espèces y sont également décrites, telle que B. myamotae, B. tanuki, B. turdae. TABLE 1 Réactivité des différentes espèces de borrélies envers les anticorps monoclonaux (H3TS, I 17.3, J 8.3, D6, A116k) et mobilité électrophorétique des principales protéines de surface OspA et OspB en kdalton. Mobilité électrophorétique Anticorps monoclonaux des protéines de surface A et B --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------H3TS I 17.3 J 8.3 D6 A116k OspA OspB Groupe I + 31 34 (B. burgdorferi ss) Groupe II (B. afzelii) - + + - - 32 35 Groupe III (B. garinii) - - - + - 32.5 /* Groupe IV (B. valaisiana) - - - - + 33 /* *Les espèces B. garinii et B. valaisiana ne présentent apparemment pas d OspB Figure 2 : Migration électrophorétique de souches de Borrelia burgdorferi sensu lato sur gel de polyacrylamide. Coloration au bleu de Coomassie démontrant l hétérogénéité des protéines inférieures à la flagelline, 41 kda). 93 kda Flagelline OspA OspC Date de révision 2008-05-14 /OP 3/3

Le génome de Borrelia burgdorferi Le génome de Borrelia burgdorferi sensu stricto a été entièrement séquencé (20). Il est constitué d un chromosome très particulier et jusqu à plus ample connaissance unique pour une bactérie, puisqu il est linéaire et de relativement petite taille, soit 910'725 pb et accompagné de 21 plasmides, dont 12 linéaires et 9 circulaires, comptant pour environ 613'000 pb (13). Sur ces plasmides se trouvent l essentiel des protéines de surfaces, OspA, OspB, OspC et la flagelline, pour ne citer que les plus connues. On observe une copie de chaque plasmide par chromosome, mais différents plasmides partagent des régions d ADN homologue. Certains de ces plasmides peuvent être perdus au cours de cultures à long terme, entraînant une perte de pathogénicité (60). Le contenu en G-C de l ensemble du génome est de 29 % seulement. Date de révision 2008-05-14 /OP 4 / 4

Figure 3 Vue d ensemble du chromosome de Borrelia burgdorferi sensu stricto et de quelques-uns de ces plasmides (20). Chromosome Date de révision 2008-05-14 /OP Plasmides 5/5

Les vecteurs Les tiques du complexe Ixodes ricinus ont besoin d une humidité relative élevée, supérieure à 70 %, pour survivre. Elles se rencontrent en abondance dans les forêts humides avec un sous-bois dense (herbes, roseaux, broussailles et buissons ) des régions tempérées de l hémisphère Nord. L importance des populations d I. ricinus diminue avec l altitude. On les rencontre jusqu à 1200m, exceptionnellement 1600m. I. ricinus est une tique dite exophile, c est-à-dire qu elle passe l essentiel de son existence à l affût sur la végétation en attente d un hôte de passage. Elle est active dès que la température atteint 7 C (49). Elle s accroche à tout ce qui bouge, puis, cherche un endroit où piquer, si l hôte lui convient. Figure 4: I.xodes ricinus, femelle non nourrie Les pièces buccales sont bien adaptées pour percer la peau et s y ancrer fortement à la manière d un harpon (Figure 5). Il faut savoir que la piqûre est totalement indolore pour l homme. Figure 5 : Vue ventrale du rostre d I. ricinus femelle en microscopie électronique à balayage. (Prof. P.A. Diehl, M. Vlimant, Inst. de Zoologie, Université de Neuchâtel) Date de révision 2008-05-14 /OP 6 / 6

Cette tique a besoin d un repas de sang à chaque stade (larve, nymphe, adulte) pour accomplir son cycle de développement (Figure 6). Le repas de sang va durer de 3 à 5 jours pour les larves qui se laissent ensuite tomber au sol pour muer. Les nymphes vont se nourrir sur un nouvel hôte pendant 5 à 7 jours, se laisser tomber au sol et muer. Le repas de sang de la femelle dure 7 à 10 jours. Le mâle se fixe parfois, mais ne prend qu un frugal repas. Il féconde une ou plusieurs femelles et meurt. Le repas de sang accompli, la femelle cherche un endroit propice dans le sol pour pondre plusieurs milliers d œufs. Ixodes ricinus parasite un très grand nombre d hôtes différents. Plus de 300 hôtes, des reptiles aux mammifères en passant par les oiseaux, ont été répertoriés (21). Cette espèce de tique n a aucune spécificité parasitaire et l homme intervient toujours accidentellement dans ce cycle. Le cycle complet s effectue en 2 à 3 ans. Figure 6 : Cycle de développement d I. ricinus JF Graf, NOVARTIS Date de révision 2008-05-14 /OP 7/7

La transmission La transmission de B. burgdorferi sl est assurée, pour l'essentiel, par les tiques du complexe I. ricinus (Figure 3) dans les régions tempérées de l'hémisphère Nord (Table 2). D autres espèces de tiques, telle Pholeoixodes hexagonus ont démontré toutes les capacités de vecteur et de réservoir de B. burgdorferi sl (22, 75). De plus, il n est pas exclu que d autres espèces de tiques ne soient impliqués, mais leur rôle reste hypothétique ou marginal, en ce qui concerne la transmission de B. burgdorferi à l homme. TABLE 2 Principaux Vecteurs Répartition géographique I. scapularis (I. dammini) USA (côte Est, centre et Sud) I. pacificus USA (côte Ouest) I. ricinus Europe, Afrique du Nord, CEI I. persulcatus CEI, Asie I. ovatus Asie Figure 7 : Aire de distribution des tiques du complexe Ixodes ricinus Les borrélies se trouvent généralement dans l'intestin des tiques seulement. Comment la transmission a-t-elle lieu? Deux hypothèses ont été émises : Le phénomène de régurgitation qui peut se passer au cours du repas sanguin dont la durée est de plusieurs jours et l'autre serait la migration des borrélies de l'intestin vers les glandes salivaires. Ces 2 hypothèses, au départ antagonistes, pourraient se révéler les 2 exactes. La fréquence très faible d'infection généralisée dans les tiques et une transmission modérée des borrélies de la femelle à ses oeufs entraînent une faible proportion de larves infectées dans la nature, généralement de 1 à 2 %. Avec le premier repas de sang sur les campagnols et mulots, les larves s'infectent de borrélies. Arrivées au stade de nymphes, 10 à plus de 50 % des tiques sont porteuses de borrélies, un taux presque comparable à celui des tiques adultes. Les nymphes sont donc les principales responsables de la transmission de B. burgdorferi sl à l'homme, étant 10 à 50 fois plus nombreuses que les tiques adultes. Par des travaux en laboratoire, on sait que les tiques ne transmettent pas immédiatement les borrélies qu'elles portent. Si une tique infectée reste attachée moins de 24 heures sur l'hôte, la transmission est rare, alors qu'après 72 heures la transmission est assurée à 100 %. C'est la raison pour Date de révision 2008-05-14 /OP 8 / 8

laquelle il est fortement recommandé de retirer la tique le plus vite possible et de désinfecter l'endroit de la piqûre (8). Les hôtes réservoirs En dehors des tiques, les animaux sauvages sont des réservoirs importants de B. burgdorferi sl. Par des études en laboratoire, il a été démontré que les mulots présentent à intervalles irréguliers des spirochétémies pendant plus d une année (23). En Europe plusieurs groupes (26, 29, 34) ont isolé des borrélies des rongeurs. Tous ces isolements sont des B. afzelii. Au Japon, Nakao et collaborateurs (44, 45) ont fait des Figures 8 : rongeur (Apodemus sylvaticus) parasité par de nombreuses larves et nymphes d I.ricinus Figure 9 : jeune rouge-gorge parasité par des nymphes d I.ricinus observations similaires sur des isolements de rongeurs et les isolements des oiseaux étaient des B. garinii. En Suède, Olsen et collaborateurs isolaient également B. garinii d I. uriae, une tique des oiseaux de mer (48). Cette même équipe a démontré l échange de B. garinii entre les 2 hémisphères Nord-Sud par les migrations des oiseaux de mer (47). En Suisse, Humair et collaborateurs ont réalisé de nombreux isolements de Borrélies d oiseaux du genre Turdus (merles) et de tiques parasitant ces oiseaux et ils ont obtenu des B. garinii et des B. valaisiana. (30). Ils ont également démontré que l écureuil roux est probablement un des réservoirs de B. burgdorferi ss et B. afzelii (28). Il semble de plus en plus évident que l histoire naturelle de B. burgdorferi est complexe. Dans la nature coexistent plusieurs cycles de transmission indépendants : 1) oiseaux - tiques avec B. garinii et B. valaisiana, 2) rongeurs - tiques avec B. afzelii, 3) écureuil roux - tiques avec B. burgdorferi ss et B. afzelii. Certains animaux comme les hérissons seraient porteurs des 4 espèces (22). D autres animaux sont probablement des réservoirs de ces Date de révision 2008-05-14 /OP 9 / 9 Figure 10 : Lérot, hôte réservoir de B. spielmanii

borrélies et nécessitent d autres investigations. C est notamment le cas de B. spielmanii, dont l hôte réservoir est le lérot ou loir masqué (55). Prévention et vaccins Lutte contre les tiques La lutte contre I. ricinus s avère particulièrement difficile. Cette tique a un très large éventail d hôtes, qui va des reptiles aux mammifères en passant par les oiseaux. Ce manque de spécificité parasitaire rend toute mesure de contrôle contre une population d hôtes, totalement inefficace. D autre part, la lutte par des acaricides n est pas imaginable en milieu forestier, mais pourrait être envisagée dans une zone limitée (jardin, parc public ). Ces traitements devraient être répétés plusieurs fois pendant la saison d activité des tiques et leurs coûts seraient élevés et très dommageable pour l environnement. D autre part l efficacité de tels traitements n est de loin pas démontrée, parce que les tiques sont souvent cachées à l abris des feuillages ou sur leurs hôtes (mulots, campagnols, oiseaux ). Eviter les piqûre de tiques Figure 10 : Lérot (Eliomys quercinus) La prévention des piqûres passe par une sensibilisation de la population aux problèmes posés par les tiques. Le port de pantalons longs, d habits à manches longues, bien fermés aux poignets et aux chevilles, réduit considérablement les risques. Des habits de couleur clair permettent aussi de mieux repérer des tiques qui se seraient accrochées en cours de promenade. L emploi d agents repoussants (permethrine, DEET) s avère efficace. L observation attentive du corps après une promenade est également indispensable pour se débarrasser des tiques. Mesures après piqûre de tiques Figure 11 : Piqûre de tique femelle I. ricinus Sur la base de l étude des piqûres de tiques en Suisse romande, que nous avons réalisée en collaboration avec le CHUV, Lausanne (P.Francioli, D.Blanc) et l Institut de Zoologie de Neuchâtel (L.Gern) pendant les années 93-95, nous pouvons tirer la conclusion qu il n est pas recommandé de traiter une piqûre de tique (43). Le risque de maladie était évalué à un peu plus de 1 %. Dans la région de Neuchâtel, zone de haute endémie, le risque est toutefois plus élevé, de l ordre de 5% (Malinverni..). Suite à une piqûre de tique, il est conseillé : 1. retirer le plus rapidement la tique fixée. 2. désinfecter l endroit de la piqûre 3. surveiller attentivement l endroit de la piqûre pendant 4 semaines 4. dès l apparition d un érythème migrant ou de tout autre manifestation clinique compatible avec une borréliose de Lyme, consulter rapidement un médecin. Date de révision 2008-05-14 /OP 10 / 10

Un sérum prélevé au moment de la piqûre de la tique et gardé en réserve congelé, peut se révéler utile pour un diagnostic ultérieur, en prenant en parallèle un deuxième sérum prélevé lors de l apparition de symptômes cliniques. Vaccination Aucun vaccin n est actuellement disponible pour prévenir la borréliose de Lyme. Aux Etats- Unis, un vaccin a été mis sur le marché pendant 2-3 ans. Malgré son efficacité reconnue, ce vaccin a dû être retiré de la vente suite à l apparition d arthrite chez quelques personnes vaccinées et à une rentabilité insuffisante. Diagnostic La clinique Le diagnostic de la borréliose de Lyme est au stade précoce basé sur la présence de l'em, cette lésion caractéristique de l'infection à B. burgdorferi sl. L'anamnèse de piqûre de tiques n'est rapportée que chez un tiers des patients. Toutefois un certain nombre de lésions atypiques et toutes les autres manifestations cliniques de la borréliose de Lyme exigent des examens complémentaires (17, 53). La mise en évidence directe Parmi les tests de laboratoire, la mise en évidence directe de B. burgdorferi sl dans le sang ou d'autres liquides biologiques, ou de biopsies diverses n'est guère envisageable par fond noir ou par des méthodes de colorations spécifiques (immunofluorescence, immunoperoxydase...), étant donné le nombre extrêmement faible d'organismes présents. La culture La culture de cet organisme est possible, mais n'est pas recommandée comme test de diagnostic de routine, au vu de son rendement relativement faible. D'autre part la culture est longue, de une à plusieurs semaines, et difficile. Elle requiert un milieu spécial très riche (BSK II ou MKP) et des conditions d'asepsie stricte. La culture ne devrait être envisagée que dans des cas bien précis. Figure 12 : B. burgdorferi en culture vu au microsocope à fond noir Les tests d immunité cellulaire Les tests d'immunité cellulaire ne semblent pas apporter d avantages sur les tests sérologiques. La standardisation est difficile et les réactions non spécifiques sont aussi nombreuses que dans les tests sérologiques. La sérologie Les tests sérologiques pour la détection d'anticorps "spécifiques" dans le sérum, les liquides céphalo-rachidiens et articulaires sont actuellement largement répandus. La spécificité et la sensibilité des tests dépendent des méthodes utilisées, de l espèce de borrélie, de la Date de révision 2008-05-14 /OP 11 / 11

préparation de l'antigène et de sa présentation (59). Parmi les méthodes couramment utilisées citons, l'elisa, l'immunofluorescence, la fixation du complément, l'hémagglutination, l'immunoblot ou Western blot. Les tests ELISA, grâce aux techniques d'antigènes recombinants, ont tendance à devenir beaucoup plus spécifiques et l'on peut espérer voir dans un avenir proche l'apparition sur le marché de tests très spécifiques et d'une bonne sensibilité. Une des innovations récentes est l antigène VLSE (variable like protein sequence expressed). Cette lipo-protéine exposée en surface, n est exprimée par les borrélies que dans les hôtes mammifères(35, 37). Cette protéine a été reconnue comme hautement immunogène et la variation antigénique chez B. burgdorferi sl se produit lors de la recombinaison entre les cassettes vls silencieuses et vlse. Une des régions invariables de la protéine (IR6) que l on rencontre entre des portions hypervariables, correspond à la protéine VLSE. Cette protéine s est révélée très immunogène et stable entre les différentes espèces de borrélies, ce qui en fait un excellent candidat pour les tests sérologiques. Pour plus d information sur l utilité de la protéine VLSE voir le lien www.ichv.ch documentation : CADUCEUS express 7-2006 Actuellement l'immunoblot sert de test de confirmation de résultats positifs ou équivoques, il permet d'éliminer un certain nombre de réactions non spécifiques. Sa sensibilité élevée en fait un test très utile pour la phase précoce de la maladie. Toutefois il existe de grandes différences de sensibilité entre les immunoblots à disposition. Figure 13 Immunoblots (G : IgG, M : IgM) avec 2 sérums présentant une réaction positive élevée comparable par un test de dépistage (valeurs 2,6 et 2,67 respectivement, valeur seuil <1,0) Immunoblot 1 IgG : réaction définie comme non spécifique (flèches vides) Immunoblot 2 IgG : réaction définie comme spécifique contre B. burgdorferi. (flèches pleines) La réaction sérologique d'un patient récemment infecté par B. burgdorferi sl est lente et aléatoire dans sa phase primaire, c'est-à-dire qu'elle ne sera pas obligatoirement dirigée contre l'espèce de borrélie qui l'infecte. Par exemple, la réaction est parfois plus marquée contre B. burgdorferi ss que contre B. garinii, la souche isolée du patient (51). En début d infection nous observons régulièrement dans les immunoblots (Western blots) une très forte réactivité IgG et IgM contre 2 protéines de surface appelées flagelline et OspC. Peu à peu la réponse sérologique se construit contre de nombreux autres antigènes des borrélies et la réponse IgM disparaît généralement en 3 à 6 mois. Lorsque l'infection devient chronique la réaction sérologique (IgG) du patient est dirigée contre de nombreuses protéines de Borrelia et tend à devenir plus spécifique à l'espèce et probablement à la souche qui l'infecte (51). Assous et collaborateurs (2) ont été les premiers à montrer une telle réaction sérologique sélective. En Europe, une association entre les différentes espèces de B. burgdorferi sl et certains symptômes de la borréliose de Lyme a Date de révision 2008-05-14 /OP 12 / 12

été décrite sur la base de la typisation génétique des souches de borrélies isolées de l homme (3, 11, 76) et par sérologie (1, 2, 51, 57). Ces associations ne sont toutefois pas absolues, mais elle présente une fréquence plus élevée de cas : Arthrite de Lyme B. burgdorferi ss (60%) et B. afzelii (30%) Manifestations neurologiques B. garinii (60%) Acrodermatite chronique atrophiante B. afzelii (95%) Sur une centaine de cas de borréliose de Lyme chronique, nous avions démontré que 4 cas étaient probablement associés à une infection à B. valaisiana dont 3 présentaient des symptômes neurologiques et dans 1 cas une arthrite de Lyme (57). Dans un «case report» un patient avec des symtômes neurologiques (paraparésie spastique) a été diagnostiqué par PCR comme une infection à B. valaisiana (15). Même si elles sont rares, les infections humaines à B. valaisiana sont possibles. Dans les infections chroniques, les réactions croisées sont importantes et la réaction est généralement positive quelle que soit l'espèce de borrélie employée dans le test sérologique. Il faut noter que quelques rares patients développent une réponse sérologique très spécifique à une espèce et peuvent être trouvés négatifs avec certains tests de dépistage, dus à une réaction sérologique très spécifique du patient. La différentiation de l'espèce dans les tests sérologiques, l immunoblot en particulier, permet de donner un critère supplémentaire pour confirmer un diagnostic de borréliose de Lyme chronique. En effet, certaines personnes régulièrement piquées par des tiques peuvent développer des taux d anticorps très élevés en l absence de tout symptôme. L association de symptômes particuliers et d une réaction spécifique à l une des espèces de borrélies fréquemment rencontrées dans ce type de pathologie, confortera le diagnostic de borréliose de Lyme. Par exemple un patient avec une arthrite du genou et dont le sérum présente une réactivité plus forte contre B. burgdorferi ss dans les immunoblots a manifestement un diagnostic d arthrite de Lyme Les techniques d amplification génique Les méthodes d'amplification génique (Polymerase Chain Reaction, PCR) ont un rôle de plus en plus important à jouer dans le diagnostic des maladies infectieuses et de la borréliose de Lyme en particulier (32). Plusieurs problèmes doivent être pris en compte, avant de se lancer dans cette technologie pour Borrelia en particulier. Le premier problème auquel nous sommes confrontés avec les borrélies, c est la variabilité d'une certaine partie du génome et la diversité des espèces de borrélies présentes en Europe (33). Le génome des borrélies étant pauvre en G-C (30%), cela restreint considérablement le choix des amorces et des sondes, pour travailler à des températures optimales (55-60 C) et assurer ainsi une bonne spécificité. Le choix des gènes cibles est donc d une extrême importance. La validation du système choisi nécessite ensuite de tester de nombreux isolements de Borrélies de chaque espèce. D autre part, la présence d'inhibiteurs de la polymérase dans les échantillons cliniques abaissent considérablement la sensibilité du test, et comme nous l avons déjà dit, le nombre d organismes présents dans les échantillons cliniques est toujours très faible. Il est indispensable d avoir à disposition des méthodes d extraction d ADN de bonne qualité et d une bonne reproductibilité. C est le cas à présent avec l automation de l extraction, mais chaque système demande d être évalué. Actuellement, la PCR peut être recommandée pour les liquides articulaires et les biopsies cutanées, où la sensibilité est de l ordre de 60 80% des cas de borréliose de Lyme. Dans les LCR, la sensibilité est très basse pour l utiliser comme outil de diagnostic de routine. Dans les infections neurologiques précoces, on peut observer une sensibilité de l ordre de 25-30 %, (38% dans certaines publications, mais avec les résultats cumulés de 4 systèmes PCR). (46). Lors d infections chroniques, la sensibilité est de l ordre de 10 %. Date de révision 2008-05-14 /OP 13 / 13

DIAGNOSTIC DE BORRELIOSE DE LYME PAR PCR en temps réel avec typage (méthode Rauter et al,(54)) Figure 14 : Thermocycler : Light Cycler Figure 15 : Courbe d amplification Figure 16-17 : Courbes de fusion des amplicons après PCR pour identifier l espèce de Borrélie, gènes de la flagelline (gauche) et de l OspA (droite) G A B Date de révision 2008-05-14 /OP 14 / 14

Typage des souches de Borrélies par RFLP (méthode Postic et al,(52)) 1 ère phase : amplification avec des amorces B. burgdorferi sensu lato (espace intergénique du rrna entre le premier 23S et le deuxième 5S) migration électrophorétique sur gel d agarose : résultat positif (taille du fragment ~250 pb) 2 ème phase : le fragment amplifié est coupé par l enzyme de restriction MseI (ou DraI) migration électrophorétique sur gel d acrylamide pour typage Figure 18 : Génotypage de B. burgdorferi sensu lato par RFLP Date de révision 2008-05-14 /OP 15 / 15

TABLE 3 APPROCHES DIAGNOSTIQUES DE LA BORRELIOSE DE LYME Stades cliniques Piqûre de tique Erythema migrans Procédures conseillées Pas de sérologie, garder un sérum congelé Pas de sérologie, traitement antibiotique (garder un sérum congelé) Erythème atypique Sérologie (sensibilité env. 50%), PCR sur biopsie de peau (matériel frais, sensibilité 70-80%) Lymphocytoma cutis benigna Sérologie (sensibilité 80%) PCR sur biopsie de peau (matériel frais, sensibilité 70-80%) Neuroborréliose précoce (paralysie faciale) Sérologie (sérum et LCR) (sensibilité 80%), PCR sur LCR (sensibilité env. 30%) Cardite Sérologie (sensibilité 80%) PCR sur biopsie d organe Douleurs articulaires migratoires Sérologie (sensibilité 80%) Acrodermatitis chronica atrophicans Sérologie (sensibilité 99%), réactivité plus forte contre B. afzelii PCR sur biopsie de peau (matériel frais, sensibilité 70-80%) Chronic neuroborreliosis Sérologie (sérum et LCR) (sensibilité 99%) réactivité plus forte contre B. garinii PCR sur LCR (sensibilité env. 10%) Arthritis Sérologie (sensibilité 90%), réactivité plus forte contre B. burgdorferi sensu stricto PCR sur liquide synovial (sensibilité 80%) Suivi après traitement Suivi clinique Sérologie, pas nécessaire en l absence de manifestations cliniques PCR peut être réalisée en cas de réapparition de symptômes Un traitement précoce peut empêcher une séroconversion. Date de révision 2008-05-14 /OP 16 / 16

17 Présentation clinique et traitement Il y a plus de 20 ans que Steere et coll. ont publié leurs observations d une épidémie d oligoarthrite associée à un érythème migrant, observée pour la première fois dans la région rurale de Lyme, Connecticut, USA (70). La borréliose de Lyme n est pas une nouvelle maladie puisque sa lésion cutanée pathognomonique est l érythème migrant (EM), déjà observé par le suédois Afzelius en 1908 (Figure 19). De plus, une des manifestations neurologiques précoces, la méningite lymphocytaire associée à une atteinte de nerfs crâniens, fut reconnue en 1922 par Garin et Bujadoux, puis par Bannwarth en 1941. A partir de l EM, le spirochète peut migrer par voie lymphatique ou hématogène, si bien que la borréliose de Lyme est une infection multisystémique touchant essentiellement la peau, le système nerveux, les articulations et le cœur (65). Figure 19 : Erythème migrant (EM) typique, diagnostiqué 10 jours après morsure d une tique que le patient de 46 ans avait enlevée luimême. On notera que la lésion se fane en son centre, accentuant le liséré périphérique. Manifestations cliniques (Table 3) A lui seul l EM typique est suffisant pour poser le diagnostic de maladie de Lyme. A ce stade, seulement 50 % des patients auront une sérologie positive. En l absence d EM, le diagnostic repose sur la présence de manifestations tardives avec obligatoirement confirmation sérologique ou mise en évidence du spirochète (17). La borréliose de Lyme est divisée en infections précoces ou tardives et on distingue trois stades dont les manifestations sont reportées sur le tableau 1. Un patient donné peut avoir un ou plusieurs stades de la maladie, mais l infection peut être inapparente jusqu au stade II ou III (16, 66, 71). Date de révision 2008-05-14 /OP 17 / 17

18 TABLE 4 Manifestations cliniques de la borréliose de Lyme Stade I Infection précoce localisée - Erythème migrant - Symptômes généraux (céphalées, myalgies, fatigue) Stade II Infection disséminée précoce - Lésions annulaires secondaires, lymphocytome cutané bénin - Méningite, paralysie faciale, radiculonévrite (S. de Bannwarth) - Douleurs migrantes et transitoires (os, muscle, articulations, tendons) arthrites brèves - Cardite (BAV, insuffisance cardiaque) - Conjonctivite, hépatite, orchite, angine, toux Stade III Infection tardive persistante - Acrodermatite chronique atrophiante, morphée - Encéphalomyélite chronique, paraparésie, polyneuropathie axonale, démence - Arthrites prolongées et chroniques, périostites - Kératite, rétinite Une infection congénitale (mort in utero ou malformation fœtale) a été décrite mais on en ignore le risque précis. En Suisse, les manifestations cutanées représentent 64 % des cas, les atteintes neurologiques 38 %, articulaires 24 % et cardiaques 6 %. Date de révision 2008-05-14 /OP 18 / 18

19 Stade I L infection précoce localisée (stade I) se caractérise par un érythème migrant (Figures 19 et 20). L érythème migrant (l EM) débute quelques jours à semaines sur le site de la morsure de tique par une petite plaque rouge se propageant à sa périphérie de façon centrifuge. Cette lésion atteint en quelques jours un diamètre de 5 cm ou plus (jusqu à 40 cm), se pâlit en son centre, avec à sa périphérie un liséré rouge de 0,5 à 2 cm de largeur, de forme annulaire. L EM a tendance à se faner en 4 semaines (jusqu à 4 mois), même chez les patients non traités. Bien qu on le décèle chez 60 à 80 % des patients développant une borréliose de Lyme, certains auteurs pensent que l EM est pratiquement constant mais que la lésion, parfois pâle et difficile à reconnaître, peut passer inaperçue. L EM typique est un critère suffisant pour poser le diagnostic de borréliose de Lyme, même si la sérologie est négative (50 %) (53). Figure 20 : Erythème migrant se présentant sous une forme de rougeur diffuse centrée par le site de la morsure de tique. Stade II L infection précoce disséminée (stade II) survient quelques jours à semaines après l inoculation, les borrélies atteignant la peau (lymphocytome cutané bénin) (Figure 21), le muscle (myalgie), la synoviale (arthralgies et plus tardivement l arthrite brève), les méninges et le système nerveux central (paralysie faciale, syndrome de Garin-Bujadoux-Bannwarth) (Figures 16 et 17), le myocarde (bloc atrio-ventriculaire), le foie, la rate. Au stade de dissémination précoce, les signes et symptômes ont un caractère typiquement intermittent, survenant en attaque de quelques heures (53, 67). Figure 21 : Lymphocytome cutané bénin du lobe de l oreille. Cette lésion pseudo-tumorale signe déjà une infection disséminée (précoce) située à distance du site de morsure. En Suisse, on estime qu au moins 18 % des paralysies faciales sont Date de révision 2008-05-14 /OP 19 / 19

20 dues à B. burgdorferi. une infections à des paralysies faciales sont dues à B. burgdorferi (36). Chez les enfants plus de 50% des paralysies faciales sont dues à Borrelia Figure 22 : Liquide céphalo-rachidien montrant une inflammation lymphomonocytaire typique. Ce patient de 41 ans présentait une clinique typique de méningo-radiculo-névrite avec une atteinte oculomotrice (VI) et une paralysie faciale périphérique gauche, et une névralgie C7 droite. Figure 23 : La paralysie faciale périphérique chez l enfant est fréquemment due à une Borreliose de Lyme. Cette manifestation peut être isolée et poser le diagnostic différentiel avec les autres causes de paralysie faciale. Elle peut aussi entrer dans le cadre d une inflammation méningée (syndrome de Bannwarth). Date de révision 2008-05-14 /OP 20 / 20

21 Stade III Figure 24 : cas d arthrite de Lyme L infection disséminée tardive (stade III) survient une à plusieurs années après le début de la maladie et prend une forme chronique. L arthrite chronique (Figure 24) imite l arthrite rhumatoïde et son association avec l antigène HLA-DR 4 suggère une composante autoréactive, ce qui expliquerait les échecs fréquents du traitement (33, 72); elle s accompagne invariablement d une sérologie positive (53, 63, 66). La neuroborréliose chronique peut poser un diagnostic différentiel avec une sclérose en plaques dont elle se distingue par la production intrathécale d anticorps antiborrélie (25, 69). L acrodermatite chronique atrophiante est la signature dermatologique de la borréliose chronique de stade III (Figure 25 ). Il s agit d une lésion cutanée persistante, qui peut être localisée en regard de la rotule, du tibia, du coude ou de la main. L épiderme s atrophie, prenant une apparence flétrie et chiffonnée. Il y a une coloration bleu-rougeâtre de la peau. La lésion est parfois associée à une arthropathie dégénérative sous-jacente (24). Figure 25 : Acrodermatite atrophiante chronique de la main. On remarquera l aspect flétri et parcheminé de la peau qui peut prendre un aspect violacé Date de révision 2008-05-14 /OP 21 / 21

22 Une infection congénitale, par transmission transplacentaire de borrélies, a été associée à la mort in utero ou à des malformations fœtales. On ne dispose pas de données suffisantes pour chiffrer ce risque (66), mais il est très bas (41). Traitement Le traitement de la borréliose de Lyme précoce prévient les complications tardives. L administration de doxycycline est la plus efficace. Des résultats identiques sont obtenus avec l amoxicilline associée au probénécide alors que la pénicilline, l érythromycine ou les nouveaux macrolides sont moins efficaces (16, 40, 62, 80). L infection chronique persistante est plus difficile à éradiquer et une importante proportion de patients continuent à présenter des symptômes après traitement (19, 38, 72). Il y a moins d échecs avec les traitements de ceftriaxone iv qu avec la pénicilline à hautes doses (14, 19, 38, 39, 68, 72). Le traitement par voie orale convient pour l EM, les manifestations précoces de la borréliose de Lyme, la paralysie faciale isolée et pour les arthrites brèves ou l acrodermatite chronique atrophiante. La durée du traitement dépend de la manifestation et sera d au moins 14 jours pour l érythème migrant (EM) et de 21 à 28 jours pour les autres manifestations (16). Rappelons que les tétracyclines sont contre-indiquées chez les enfants de moins de 9 ans et chez les femmes enceintes, en raison d une coloration brune des dents lors de leur croissance. La voie parentérale (10 à 14 jours de traitement iv) est préférée pour la méningoradiculonéphrite, l atteinte cardiaque grave, les infections tardives persistantes ainsi que pour les infections disséminées survenant en cas de grossesse (16, 42, 64). L administration prophylactique d antibiotiques après morsure de tique n est pas universellement recommandée et donne lieu à de grandes controverses (42). Pour faire des recommandations de traitement prophylactique, on ne dispose pas de données probantes suffisantes. On rappellera toutefois que 1 tique sur 3 environ est porteuse de borrélie, le risque de transmission varie de 5 à 20 % en Suisse. Cette transmission est accrue s il s agit d une nymphe et le risque de transmission augmente avec la durée d attachement de la tique. En d autres termes, il convient d enlever les tiques le plus rapidement possible avant la phase d engorgement. Il faut dire que transmission ne veut pas dire obligatoirement infection. En Suisse ce risque a été évalué entre 1-5 %. Une étude prospective américaine faisant état d un taux d infestation de 15 % des tiques montrait que seuls 2 sujets sur 173 recevant un placebo avaient développé un érythème migrant, comparé à 0 des 192 recevant l amoxicilline (non significatif) et qu aucune manifestation tardive ou séroconversion asymptomatique n était notée pendant les 6 à 12 mois de suivi (61). Cependant, la séroconversion asymptomatique existe, comme l ont montrée deux études réalisées l une chez des coureurs d orientation en Suisse (18) et l autre dans un suivi de cohorte de personnes mordues par les tiques (43). Jusqu à ce que l on dispose de plus d informations, une antibiothérapie prophylactique en Europe ne se justifie pas. Pourtant plusieurs publications américaines justifient une telle pratique si la tique est démontrée comme porteuse de borrélie, si la prévalence de spirochète dans les tiques d une région dépasse 40 %, en cas de grossesse, en cas de morsure de tique prolongée (plus de 2 jours), ou si le patient ou son médecin sont inquiets (42, 79). Il faut toutefois rappeler que la situation épidémiologique en Europe n est absolument pas comparable à celle présente aux Etats-Unis. Il n est donc pas possible de calquer le modèle américain ici en Europe. Le traitement de la séroconversion documentée est logique et doit être proposé. La séropositivité sans symptôme n est par contre pas une indication reconnue au traitement. Remerciements Date de révision 2008-05-14 /OP 22 / 22

23 Les personnes suivantes ont travaillé sur un projet ou l autre dans le domaine de la borréliose de Lyme à l ICHV (dans l ordre alphabétique) : D. Bee, A.-G. Bretz, A.-F. Constantin, Dr méd. E. Dayer, J. Duay, C. Mueller, Dr méd. G. Praz, B. Recordon, Dr K. Ryffel, Dr L. Toutounghi, J-C. Wyss, Dr méd. X. Zhang. Références 1. Anthonissen F.M., D. K. m., Hoet P.P., Bigaignon G.H. 1994. Evidence for the involvement of different genospecies of Borrelia in the clinical outcome of Lyme disease in Belgium. Research in Microbiology 145:327-331. 2. Assous, M. V., D. Postic, G. Paul, P. Nevot, and G. Baranton. 1993. Western blot analysis of sera from Lyme borreliosis patients according to the genomic species of the Borrelia strains used as antigens. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 12:261-268. 3. Balmelli, T., and J. C. Piffaretti. 1995. Association between different clinical manifestations of Lyme disease and different species of Borrelia burgdorferi sensu lato. Res Microbiol 146:329-340. 4. Baranton, G., D. Postic, I. Saint Girons, P. Boerlin, J. C. Piffaretti, M. Assous, and P. A. Grimont. 1992. Delineation of Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia garinii sp. nov., and group VS461 associated with Lyme borreliosis. Int J Syst Bacteriol 42:378-383. 5. Barbour, A. G. 1984. Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes. Yale J Biol Med 57:521-525. 6. Barbour, A. G., W. Burgdorfer, S. F. Hayes, O. Péter, and A. Aeschlimann. 1983. Isolation of a cultivable spirochete from Ixodes ricinus ticks of Switzerland. Current Microbiology 8:123-126. 7. Barbour, A. G., R. A. Heiland, and T. R. Howe. 1985. Heterogeneity of major proteins in Lyme disease borreliae: a molecular analysis of North American and European isolates. J Infect Dis 152:478-484. 8. Burgdorfer, W. 1989. Vector/host relationships of the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. Rheum Dis Clin North Am 15:775-787. 9. Burgdorfer, W., A. G. Barbour, S. F. Hayes, J. L. Benach, E. Grunwaldt, and J. P. Davis. 1982. Lyme disease-a tick-borne spirochetosis? Science 216:1317-1319. 10. Burgdorfer, W., A. G. Barbour, S. F. Hayes, O. Peter, and A. Aeschlimann. 1983. Erythema chronicum migrans--a tickborne spirochetosis. Acta Trop 40:79-83. 11. Busch, U., C. Hizo-Teufel, R. Boehmer, V. Fingerle, H. Nitschko, B. Wilske, and V. Preac- Mursic. 1996. Three species of Borrelia burgdorferi sensu lato (B. burgdorferi sensu stricto, B afzelii, and B. garinii) identified from cerebrospinal fluid isolates by pulsed-field gel electrophoresis and PCR. J Clin Microbiol 34:1072-1078. 12. Canica, M. M., F. Nato, L. du Merle, J. C. Mazie, G. Baranton, and D. Postic. 1993. Monoclonal antibodies for identification of Borrelia afzelii sp. nov. associated with late cutaneous manifestations of Lyme borreliosis. Scand J Infect Dis 25:441-448. 13. Casjens, S. 1999. Evolution of the linear DNA replicons of the Borrelia spirochetes. Curr Opin Microbiol 2:529-534. 14. Dattwyler, R. J., B. J. Luft, M. J. Kunkel, M. F. Finkel, G. P. Wormser, T. J. Rush, E. Grunwaldt, W. A. Agger, M. Franklin, D. Oswald, L. Cockey, and D. Maladorno. 1997. Ceftriaxone compared with doxycycline for the treatment of acute disseminated Lyme disease. N Engl J Med 337:289-294. 15. Diza, E., A. Papa, E. Vezyri, S. Tsounis, I. Milonas, and A. Antoniadis. 2004. Borrelia valaisiana in cerebrospinal fluid. Emerg Infect Dis 10:1692-1693. 16. Evison, J., C. Aebi, P. Francioli, O. Peter, S. Bassetti, A. Gervaix, S. Zimmerli, and R. Weber. 2006. [Lyme disease Part 2: clinic and treatment]. Rev Med Suisse 2:925-928, 930-924. 17. Evison, J., C. Aebi, P. Francioli, O. Peter, S. Bassetti, A. Gervaix, S. Zimmerli, and R. Weber. 2006. [Lyme disease Part I: epidemiology and diagnosis]. Rev Med Suisse 2:919-924. 18. Fahrer, H., S. M. van der Linden, M. J. Sauvain, L. Gern, E. Zhioua, and A. Aeschlimann. 1991. The prevalence and incidence of clinical and asymptomatic Lyme borreliosis in a population at risk. J Infect Dis 163:305-310. Date de révision 2008-05-14 /OP 23 / 23

24 19. Feder, H. M., Jr., B. J. Johnson, S. O'Connell, E. D. Shapiro, A. C. Steere, G. P. Wormser, W. A. Agger, H. Artsob, P. Auwaerter, J. S. Dumler, J. S. Bakken, L. K. Bockenstedt, J. Green, R. J. Dattwyler, J. Munoz, R. B. Nadelman, I. Schwartz, T. Draper, E. McSweegan, J. J. Halperin, M. S. Klempner, P. J. Krause, P. Mead, M. Morshed, R. Porwancher, J. D. Radolf, R. P. Smith, Jr., S. Sood, A. Weinstein, S. J. Wong, and L. Zemel. 2007. A critical appraisal of "chronic Lyme disease". N Engl J Med 357:1422-1430. 20. Fraser, C. M., S. Casjens, W. M. Huang, G. G. Sutton, R. Clayton, R. Lathigra, O. White, K. A. Ketchum, R. Dodson, E. K. Hickey, M. Gwinn, B. Dougherty, J. F. Tomb, R. D. Fleischmann, D. Richardson, J. Peterson, A. R. Kerlavage, J. Quackenbush, S. Salzberg, M. Hanson, R. van Vugt, N. Palmer, M. D. Adams, J. Gocayne, J. C. Venter, and et al. 1997. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi [see comments]. Nature 390:580-586. 21. Gern, L., and R. C. Falco. 2000. Lyme disease. Rev Sci Tech 19:121-135. 22. Gern, L., E. Rouvinez, L. N. Toutoungi, and E. Godfroid. 1997. Transmission cycles of Borrelia burgdorferi sensu lato involving Ixodes ricinus and/or I. hexagonus ticks and the European hedgehog, Erinaceus europaeus, in suburban and urban areas in Switzerland. Folia Parasitol 44:309-314. 23. Gern, L., M. Siegenthaler, C. M. Hu, S. Leuba-Garcia, P. F. Humair, and J. Moret. 1994. Borrelia burgdorferi in rodents (Apodemus flavicollis and A. sylvaticus): duration and enhancement of infectivity for Ixodes ricinus ticks. Eur J Epidemiol 10:75-80. 24. Gerster J.C., P. O. 1998. Rheumatic manifestations related to acrodermatitis chronica atrophicans. A review of four cases. Review of Rhumatology Engl Ed 65:567-570. 25. Halperin, J. J., B. J. Luft, A. K. Anand, C. T. Roque, O. Alvarez, D. J. Volkman, and R. J. Dattwyler. 1989. Lyme neuroborreliosis: central nervous system manifestations. Neurology 39:753-759. 26. Hu, C. M., P. F. Humair, R. Wallich, and L. Gern. 1997. Apodemus sp. rodents, reservoir hosts for Borrelia afzelii in an endemic area in Switzerland. Zentralbl Bakteriol 285:558-564. 27. Hubalek, Z., and J. Halouzka. 1997. Distribution of Borrelia burgdorferi sensu lato genomic groups in Europe, a review. Eur J Epidemiol 13:951-957. 28. Humair, P. F., and L. Gern. 1998. Relationship between Borrelia burgdorferi sensu lato species, red squirrels (Sciurus vulgaris) and Ixodes ricinus in enzootic areas in Switzerland. Acta Trop 69:213-227. 29. Humair, P. F., O. Peter, R. Wallich, and L. Gern. 1995. Strain variation of Lyme disease spirochetes isolated from Ixodes ricinus ticks and rodents collected in two endemic areas in Switzerland. J Med Entomol 32:433-438. 30. Humair, P. F., D. Postic, R. Wallich, and L. Gern. 1998. An avian reservoir (Turdus merula) of the Lyme borreliosis spirochetes. Zentralbl Bakteriol 287:521-538. 31. Johnson, R. C., F. W. Hyde, G. P. Schmid, and D. J. Brenner. 1984. Borrelia burgdorferi sp. nov.: etiological agent of Lyme disease. Int J Syst Bacteriol 34:496-497. 32. Jouda, F., J. L. Perret, and L. Gern. 2004. Density of questing Ixodes ricinus nymphs and adults infected by Borrelia burgdorferi sensu lato in Switzerland: spatio-temporal pattern at a regional scale. Vector Borne Zoonotic Dis 4:23-32. 33. Kalish, R. A., J. M. Leong, and A. C. Steere. 1993. Association of treatment-resistant chronic Lyme arthritis with HLA-DR4 and antibody reactivity to OspA and OspB of Borrelia burgdorferi. Infect Immun 61:2774-2779. 34. Kurtenbach, K., M. Peacey, S. G. Rijpkema, A. N. Hoodless, P. A. Nuttall, and S. E. Randolph. 1998. Differential transmission of the genospecies of Borrelia burgdorferi sensu lato by game birds and small rodents in England. Appl Environ Microbiol 64:1169-1174. 35. Lawrenz, M. B., J. M. Hardham, R. T. Owens, J. Nowakowski, A. C. Steere, G. P. Wormser, and S. J. Norris. 1999. Human antibody responses to VlsE antigenic variation protein of Borrelia burgdorferi. J Clin Microbiol 37:3997-4004. 36. Le Fleche, A., D. Postic, K. Girardet, O. Peter, and G. Baranton. 1997. Characterization of Borrelia lusitaniae sp. nov. by 16S ribosomal DNA sequence analysis. Int J Syst Bacteriol 47:921-925. 37. Liang, F. T., A. C. Steere, A. R. Marques, B. J. Johnson, J. N. Miller, and M. T. Philipp. 1999. Sensitive and specific serodiagnosis of Lyme disease by enzyme-linked immunosorbent assay with a peptide based on an immunodominant conserved region of Borrelia burgdorferi vlse. J Clin Microbiol 37:3990-3996. Date de révision 2008-05-14 /OP 24 / 24

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