Du galactose à la glycolyse. Approche génétique Perméase Milieu extérieur Intérieur de la cellule
Analyse génétique 2 sites mutés 1 souche de levure m5 double mutante [gal-, lys-] Double mutant Quel déterminisme génétique 1 site muté 1 gène en jeu mais il est pléiotrope une délétion qui enlève plusieurs gènes, hypothèse la plus simple 2 gènes 2 sites mutés affectant sous l hypothèse la plus simple deux gènes. 3 sites etc etc Comment trancher entre ces hypothèses? test de ségrégation.
Analyse génétique 2 sites mutés Analyse du mutant 5 : double mutant [gal- lys-] [ gal- lys- ] x [ gal+ lys+ ] I. Dominance Diploïde [gal+ lys+] II. Ségrégation. On observe après dissection trois types de tétrades. 2 types de spores DP 4 types de spores 2 types de spores 2 spores [gal- lys-] 2 spores [gal+ lys+] 43 [gal- lys+] [gal+ lys+] [gal- lys-] [gal+ lys-] 6 2 spores [gal- lys+] 2 spores [gal+ lys-] 1 Que concluez vous et pourquoi?
Analyse génétique 2 sites mutés Tests de dominance et de ségrégation 2 types de spores 2 spores [gal- lys-] 2 spores [gal+ lys+] 43 4 types de spores [gal- lys+] [gal+ lys+] [gal- lys-] [gal+ lys-] 6 2 types de spores 2 spores [gal- lys+] 2 spores [gal+ lys-] 1 1. Ségrégation des caractères DONC a) au moins 2 sites mutés mis en jeu -On sait qu il n y a qu un site pour le caractère [gal-] -On montre qu il n y a qu un site pour le caractère [lys-] car Toutes les tétrades ont 2 spores [lys+] /[lys-]
Test de ségrégation 2 sites mutés : démonstration 2 sites mutés : Relation entre les tétrades et la distance génétique Chaque tétrade correspond à une méiose, lors de la méiose il y a eu 0 crossing over, 1 CO ou 2 CO. Quelles tétrades attend on selon le nombre de CO. Calcul de la distance en repérant à travers les tétrades les combinaisons recombinées et les parentales.
Test de ségrégation 2 sites mutés : démonstration 2 sites mutés : Relation entre les tétrades et la distance génétique 1. 0 crossing over b - b- c- b+ b+ c- c+ c+ 1 2 3 4 Chromatides sœurs 1-2 et 3-4 Chromatides non-sœurs 1-3, 2-3, 1-4 et 2-4 b- c- b+ c+ b- c- b+ c+ a1 b1 [gal- lys-] a+ b+ [gal+ lys+] a1 b1 [gal- lys-] a+ b+ [gal+ lys+] Tétrades Parentales DP 2 [gal- lys-] 2 [gal+ lys+]
Test de ségrégation 2 sites mutés 2 sites mutés : Relation entre les tétrades et la distance génétique 2. 1 crossing over Entre les chromatides non sœurs 1-3, 1-4, 2-3 ou 2-4 1 2 3 4 b- c- b- c- b+ b+ c+ c+ Tétratypes b- c- b+ c+ b- c+ 1 [gal- lys-] 1 [gal+ lys+] 1 [gal- lys+] Tétratypes T 4 spores différentes b+ c- 1 [gal+ lys-]
Test de ségrégation 2 sites mutés 2 sites mutés : Relation entre les tétrades et la distance génétique 3. 2 crossing over : un fixé entre 2-3, et le second 1-3, 1-4, 2-3 ou 2-4 2-3 et 2-3 2-3 et 1-3 1 2 3 4 b- b- c- b+ b+ c- c+ c+ 1 2 3 4 b- c- b- b+ c- c+ b+ c+ DP. 2 b- c- et 2 b+ c+ T. 1 b- c-, 1 b- c+, 1 b+ c-, 1 b+ c+ 1 2 3 4 2-3 et 2-4 2-3 et 1-4 b- c- b- c- b+ c+ b+ c+ T. 1 b- c-, 1 b- c+, 1 b+ c-, 1 b+ c+ 1 2 3 4 b- b- c- b+ c- c+ b+ c+ 4 spores recombinées DR. 2 b- c+ et 2 b+ c-
Test de ségrégation 2 sites mutés 2 sites mutés : Relation entre les tétrades et la distance génétique 3. 2 crossing over : un fixé entre 2-3, et le second 1-3, 1-4, 2-3 ou 2-4 DP. 2 b- c- et 2 b+ c+ T. 1 b- c-, 1 b- c+, 1 b+ c-, 1 b+ c+ 4 spores recombinées DR. 2 b- c+ et 2 b+ c- Bilan : 3 types de tétrades DP T DR
Test de ségrégation 2 sites mutés Observation des 50 tétrades obtenues 2 sites mutés : Calcul de la distance génétique Parentaux DP Pas de CO + ¼ des 2 CO Tétratype T 1 CO + ½ des 2CO Recombiné DR 2 CO ¼ des événements Distance 100 * (4 DR + 2T ) / 4 ( DP + DR + T ) La distance est sous estimée puisque les tétrades DP et T liées à 2 CO ne sont pas visibles.
Analyse génétique 2 sites mutés Analyse du mutant 5 : double mutant [gal- lys-] [ gal- lys- ] x [ gal+ lys+ ] I. Dominance Diploïde [gal+ lys+] II. Ségrégation. On observe après dissection trois types de tétrades. 2 types de spores 4 types de spores 2 types de spores 2 spores [gal- lys-] 2 spores [gal+ lys+] 43 [gal- lys+] [gal+ lys+] [gal- lys-] [gal+ lys-] 6 2 spores [gal- lys+] 2 spores [gal+ lys-] 1 Calcul de la distance entre les 2 sites mutés.
Test de ségrégation 2 sites mutés Application : Observation des 50 tétrades obtenues Parentaux DP 43 Pas de CO 2 spores [gal- lys-] 2 spores [gal+ lys+] Tétratype T 6 1 CO [gal- lys+] [gal+ lys+] [gal- lys-] [gal+ lys-] Recombiné DR 1 2 CO 2 spores [gal- lys+] 2 spores [gal+ lys-] Distance (4 DR + 2T ) / 4 ( DP + DR + T ) * 100 [( 4*1 + 2*6 ) / 4*50] * 100 = 16 / 200* 100 = 8 UR Distance en comptant les spores en vrac. [gal- lys-] P 92 [gal+ lys+] P 92 [gal- lys+] R 8 : 6 dans T et 2 dans DR [gal+ lys-] R 8 : 6 dans T et 2 dans DR D = 16/200 x 100 = 8 UR
Bilan sur les analyses de tétrades chez la levure Les haplo diplobiontiques: Saccharomyces cerevisiae Analyses en tétrades - 2 sites mutés DP T DR Indépendants Liés DP = DR a et b sur le même chromosome T = 2/3 a et b sur deux chromosomes différents T < 2/3 DP > DR Calcul de la distance (4 DR + 2T ) * 100 4 ( DP + DR + T )
Du galactose à la glycolyse. Approche génétique Perméase Milieu extérieur Intérieur de la cellule
Approche génétique/physiologique 12 mutants [gal-] / 1 site muté par souche, combien de gènes? Groupes gène activité enzymatique affectée 1 GAL1 a 2, 3, 8 GAL2 b 4, 6 GAL4 c 5, 10 GAL5 d 9 GAL9 e 11 GAL11 f 12 : ce mutant est dominant 7 : il appartient aux groupes 1 et 5
La voie du Galactose. Etude des mutants Carte des anomalies enzymatiques
Approche génétique/physiologique 12 mutants / 1 site muté par souche, combien de gènes? Groupes gène activité enzymatique affectée 1 GAL1 a galactokinase 2, 3, 8 GAL2 b mutase 4, 6 GAL4 c galactokinase, transférase, épimérase 5, 10 GAL5 d transférase 9 GAL9 e epimérase 11 GAL11 f galactokinase, transférase, épimérase 7 appartient aux groupes 1 et 5 galactokinase, transférase 1 site muté et 3 activités enzymatiques perturbées?
Approche génétique/physiologique Carte génétique des mutants Localisation des gènes : Tests de ségrégation 359 0 1
Approche génétique/physiologique Analyse génétique schéma de la position des gènes DP DR T 359 0 1 1 site ou 2 très liés 2 sites liés 1 site ou 2 très liés 2 sites indépendants 9 1 5 4 11
Conclusions génétiques et moléculaires. Groupes gène activité enzymatique affectée 1, 7 GAL1 a galactokinase 4 GAL4 c galactokinase, transférase, épimérase 5, 7 GAL5 d transférase 9 GAL9 e épimérase 11 GAL11 f galactokinase, transférase, épimérase 7 appartient aux groupes 1 et 5 galactokinase, transférase 9 1 5 4 7 11
Comment un seul gène peut-il empêcher le fonctionnement de trois autres? 9 1 5 4 11 Action des gènes 4 et 11 en TRANS. Leur action se fait en dehors de la colinéarité
Du galactose à la glycolyse. Approche génétique Perméase 1 5 2 Milieu extérieur 4 et 11 3 activités enzymatiques perturbées Perméase et?? 9 Intérieur de la cellule
Cloner un gène = Isoler l allèle sauvage d un gène dans un vecteur. 1. Isoler des fragments d ADN : Réaliser une banque d ADN génomique 2. Parmi eux, lequel contrôle la fonction recherchée? Réaliser un test génétique fonctionnel afin d isoler le gène recherché : sauvetage phénotypique
Cloner un gène entier dans un organisme. espèce E. Coli Arabidopsis thaliana Saccharomyces cerevisiae Caenorhabditis elegans Drosophila melanogaster Taille en Kb Nb de gènes Taille des gènes Kb Nb moyen d exons/gène 4 700 4 400 1 1 115 000 25 500 3-4 5,2 12 200 6 400 2 1,04 97 600 18 000 3 5,5 140 000 13 500 3 4,2 Homo sapiens 3 300 000 30 000 5kb 100Mb 8,7
Caractéristiques des génomes. Génome de levure 12 200 kilobases Plasmides avec un insert de 2 kb génome de levure dans 6 100 plasmides. On peut le tester sur quelques boites de pétri.
Cloner un gène chez la levure On veut cloner l allèle sauvage du gène révélé par la mutation dans la souche mutante [gal4] 1. Banque d ADN génomique de la souche sauvage. Choix du vecteur Par digestion enzymatique on isole des fragments d ADN de 2-6 kb en moyenne. On va insérer ces fragments d ADN dans des vecteurs, plasmidiques dans ce cas Deux types de plasmides réplicatifs chez la levure sont utilisables. 2. Il faut des tests pour visualiser les événements qui nous intéressent. systèmes rapporteurs - présence du plasmide - présence du gène d intérêt détecté par le sauvetage phénotypique
Choix du vecteur de clonage Plasmide réplicatif multicopies chez la levure Polylinker: site de clonage Ura3 Système rapporteur Transmission aléatoire lors des divisions des levures Nécessité d un milieu sélectif
Choix du vecteur de clonage Plasmide réplicatif faible nombre de copies Polylinker: site de clonage URA3 Transmis comme un chromosome de levure
Systèmes rapporteurs. Plasmide avec deux systèmes rapporteurs 1. Tester la présence du plasmide dans la levure Levure auxotrophe pour l uracile [ura-] ura3 - plasmide avec l allèle sauvage ura3+ 2. Tester la présence de l allèle sauvage recherché: sauvetage phénotypique Levure [gal-] gal4 Seules les levures ayant un plasmide avec le gène sauvage GAL4 vont pousser.
Réalisation du clonage Les levures [ura-, gal-] ; ura3 -, c 4 sont transformées avec les plasmides puis elles sont étalées sur un milieu complet avec du sucrose toutes les levures se développent Lesquelles ont l allèle gal4 +? Il faut cribler deux événements - les levures qui ont intégré le plasmide - Les plasmides qui portent l allèle gal4+.
Quelles levures ont intégré le plasmide? Lesquelles ont l allèle recherché gal4 + Réplique sur un milieu sans Uracile avec le galactose comme source de carbone. - milieu sans uracile les levures ura3- qui poussent ont forcément intégré le plasmide portant l allèle sauvage ura3+ - milieu galactose Comme les levures sont gal4 - elles ne poussent que si le plasmide porte l allèle sauvage gal4 + Pourquoi ne pas faire directement les étalements sur milieu doublement sélectif?
Analyse de l allèle sauvage du gène gal4 1. Extraction moléculaire du plasmide 2. Extraction du gène après digestion enzymatique 3. Séquençage Analyse moléculaire : séquençage analyse dans les banques Électrophorèse d ADN, visualisation
Analyse moléculaire du gène gal4 Interrogation dans des banques ADN On trouve des homologies avec les motifs suivants - Signal de localisation nucléaire NLS - 1 site de liaison à l ADN - 1 site de liaison protéine-protéine - domaine d activation transcriptionnelle
Analyse fonctionnelle - 1. site de liaison protéine-protéine - 2. Signal de localisation nucléaire NLS - 3. site de liaison à l ADN - 4. domaine d activation transcriptionnelle GAL4 est un facteur de transcription Une séquence de fixation sur l ADN Upstream Activating Sequence
Analyse fonctionnelle GAL4 est un facteur de transcription 1) Transcription traduction du gène gal4 Molécule active Site liaison protéine-protéine 2) Retour au noyau de la protéine active Gal4 Séquence NLS 3) Localisation sur le site UAS Site de liaison à l ADN 4) Activation de la transcription du gène Galactokinase Domaine activateur
GAL4 est un facteur de transcription Mutations et conséquences 1) Transcription traduction du gène Gal4 2) Retour au noyau de la protéine active Gal4 Mutations dans le gène GAL4 - signal NLS - site de fixation ADN Site d activation. Produit Gal4 non fonctionnel Ne se fixe pas sur les séquences UAS Pas d activation des gènes en aval
Analyse fonctionnelle GAL4 est un facteur de transcription Mutations dans le gène de la galactokinase Séquence codante anomalie de la protéine Promoteur du gène transcription à des niveaux variables Séquence CIS régulatrice : UAS G défaut de transcription Pas de produit du gène
Le gène gal4 chez la levure. galactokinase Mutations dans le gène de la galactokinase Séquence codante anomalie de la protéine Promoteur du gène transcription à des niveaux variables Séquence CIS régulatrice : UAS G défaut de transcription Conséquences sur le produit du gène seulement Mutations dans le gène Gal4 Séquence trans régulatrice Protéine Gal4 défaut de transcription Conséquences sur tous les gènes régulés par Gal4
Comment un seul gène muté peut empêcher le fonctionnement de trois autres? 9 1 5 Produit Gal4 est non fonctionnel Ne se fixe pas sur les séquences UAS Pas d activation des gènes en aval 4 muté Régulation en TRANS Mutations dans le gène Gal4 Conséquences sur tous les gènes régulés par Gal4
Comprendre la fonction d un gène. Quel est l effet phénotypique lié à la suppression du gène. Quel est le phénotype lié à l allèle nul? Comment générer un allèle nul? Comment «voir l individu porteur de cet allèle nul»? Technique du Knock-out ou KO par transgenèse de remplacement.
ADN à intégrer Chromosomes «site choisi»
Génétique inverse: on connaît le gène, on cherche le mutant. Soit un gène vital «vit» décrit chez la drosophile qui a été cloné et séquencé. Par les analyses génomiques on a trouvé un homologue chez la levure nommé vit levure. - Quel est le phénotype qu il contrôle dans cet organisme? Pour répondre il faut enlever ou muter le gène On utilise la recombinaison homologue chez la levure Transgenèse de remplacement
Recombinaison homologue : transgenèse de remplacement On veut enlever un gène afin de voir le phénotype résultant: Knock Out 1. Le gène ciblé Vit levure est cloné et séquencé: on peut délimiter ses extrémités. 2. On choisit le système rapporteur. Ici l allèle sauvage his3 On prépare à partir d un plasmide un ADN linéaire avec les extrémités du gène encadrant. C est cet ADN qui va être intégré à la place du gène. His3+
Système rapporteur. l allèle sauvage his3 On va utiliser une souche diploïde de levure [his-] Elle porte une mutation au locus his3 qui empêche la synthèse de l histidine. Donc elle est de génotype his3-/his3 ; vit levure +/vit levure + On va la transformer avec des fragments linéaires d ADN His3+ Extrémités du gène vit levure + Cette séquence va s intégrer par recombinaison homologue au locus vit levure et créer une délétion de l allèle vit levure +
Recombinaison homologue : transgenèse de remplacement Transformation d une souche diploïde de génotype his3-/his3; vit levure +/vit levure + avec un gène his3+ cloné entre les extrémité du gène vit levure + his3+ his3+ his3+ his3+ his3+ Recombinaison homologue! 1/10 000 fréquence faible mais on utilise un crible positif. 1 seul allèle est substitué Parmi des milliers de levure, comment isoler celles qui ont intégré au site vit levure, l ADN exogène?
Comment savoir le phénotype associé à cette ORF délétée. 2. Sélection sur milieu sans histidine. seules les levures ayant intégré his3+ survivent.. Leur génotype est his3- / his3- ; vit levure / vit (his3+) 3. Quel est le phénotype lié à la perte du gène étudié?
Comment savoir le phénotype associé à cette ORF délétée. Génotype des levures : his3- / his3- ; vit levure / vit (his3+) Sporulation sur milieu normal et analyse en tétrades: Génotype Phénotype Tétrades his3- ; vit levure. [his- ] his3- ; vit levure. [his-] his3- ; vit (his3+) [his+, D vit levure ] his3- ; vit (his3+) [his+, D vit levure ] Il suffit donc de disséquer les tétrades et de regarder le phénotype des 4 spores on attend deux parentales [his-] et on examine le phénotype des spores [his+] Dans le cas décrit on observe des tétrades avec seulement 2 spores [his- ]. Donc le gène vit est également un gène vital chez la levure.