Plan
INTRODUCTION... 1 PARTIE 1 : GENERALITES... 5 1- GENERALITES... 6 1-1 GENERALITES SUR LES ANTISEPTIQUES... 6 1-1-1- Définition... 6 1-1-2- Mécanisme d action... 7 1-1-3- Les facteurs influençant l activité des antiseptiques... 7 1-1-4- Les qualités exigées d un antiseptique... 9 1-2- RAPPELS SUR LA FLORE BUCCALE... 10 1-2-1- Généralités... 10 1-2-2- Les bactéries choisies pour l étude... 13 1-2-2-1- Lactobacillus acidophilus... 13 1-2-2-2- Streptococcus mutans... 16 1-2-2-3- Actinomyces naeslundii... 19 2- DIFFERENTS COMPOSANTS DES BAINS DE BOUCHE... 22 2-1 LES BAINS DE BOUCHES ANTISEPTIQUES... 23 2-1-1- Bisguanides : Chlorhexidine... 23 Structure chimique... 23 Spectre d activité... 23 Propriétés et indications... 24 Inconvénients et effets indésirables... 26 2-1-2- Ammoniums quaternaires... 26 2-1-3- Hexahydropyrimidines Hexétidine... 27 Structure chimique... 28 Spectre d activité... 29 Propriétés et indications... 29 Inconvénients et effets indésirables... 30 2-1-4- Alcools... 30 2-1-5- Dérivés halogénés... 30 2-1-6- Phénols et dérivés phénoliques... 31 2-1-7- Aldéhydes... 31
2-1-8- Dérivés métalliques... 31 2-1-10- Agents oxydants non halogénés... 31 2-1-11- Acides... 31 2-1-10- Colorants... 32 2-1-12- Dérivés mercuriels... 32 2-1-13- Sanguinarine... 32 2-1-14- Récapitulatif des principaux antiseptiques cf. tableaux I et II... 32 2-2 LES BAINS DE BOUCHE ANTI-INFLAMMATOIRES... 35 2-3 LES BAINS DE BOUCHES ANTIBIOTIQUES... 35 2-4 LES BAINS DE BOUCHES AUX CORTICOÏDES... 35 2-5 LES BAINS DE BOUCHE FLUORES... 36 2-6 LES BAINS DE BOUCHE NEUTRALISANT DE LA MAUVAISE HALEINE... 36 2-7 LES BAINS DE BOUCHE UTILISES DANS NOTRE ETUDE... 36 2-7-1- ELUDRIL... 39 Composition... 39 Indications... 39 Contre-indications... 39 Posologie et mode d administration... 40 Interactions médicamenteuses... 40 Surdosage et mise en garde... 40 Durée de conservation... 41 2-7-2- HEXTRIL... 41 Composition... 41 Indications... 41 Contre-indications... 41 Posologie et mode d administration... 41 Interactions médicamenteuses et surdosage... 42 Durée de conservation... 42
PARTIE 2 : MATERIELS ET METHODES... 43 1- DETERMINATION DES CMI DES BAINS DE BOUCHE PAR MICROMETHODE... 44 2- DETERMINATION DES CMB DES BAINS DE BOUCHE PAR MICROMETHODE... 51 3- BIOFILMS DENTAIRES ET LEUR TRAITEMENT AVEC LES BAINS DE BOUCHE... 54 PARTIE 3 : RESULTATS ET DISCUSSION... 65 1- RESULTATS... 66 1-1- RESULTATS DES CMI ET CMB... 66 1-1-1- Résultats des CMI et CMB pour Eludril... 66 1-1-2- Résultats des CMI et CMB pour Hextril... 72 1-2- RESULTATS DES BIOFILMS IN VITRO... 74 1-2-1- Résultats des biofilms jeunes... 74 1-2-2- Résultats des biofilms matures... 75 2- DISCUSSION... 76 2-1- DISCUSSION DES RESULTATS DES CMI ET CMB... 76 2-1-1 Discussion des résultats d Eludril... 76 2-1-2 Discussion des résultats d Hextril... 79 2-2 DISCUSSION DES RESULTATS DES BIOFILMS... 81 2-2-1 Discussion des résultats d Eludril... 82 2-2-2 Discussion des résultats d Hextril... 84 2-2-3 Discussion des résultats des deux bains de bouche... 86 CONCLUION... 88 RESUMES BIBLIOGRAPHIE ANNEXES
- 1 - Introduction
- 2 - La flore orale est constituée d une grande diversité de microorganismes. Elle comprend des virus, des bactéries, des champignons, des mycoplasmes et parfois des protozoaires. Les bactéries, représentées par plus de 500 espèces (Kolenbrander 2000; Dewhirst et coll. 2010), occupent, au sein de cet ensemble, la part la plus importante. Les microorganismes qui colonisent les surfaces dentaires s organisent en biofilm, appelé plaque dentaire. Le biofilm dentaire ou plaque dentaire se compose de différentes populations bactériennes entourées d une matrice de polysaccharides et de glycoprotéines. La prévention des maladies associées à la présence de biofilm, telles que la carie dentaire ou les maladies parodontales, passe par le contrôle de ce biofilm dentaire. Celui-ci est réalisé le plus souvent par des moyens mécaniques, tel que le brossage, mais aussi par des moyens chimiques. Les agents chimiques sont utilisés surtout sous forme de bains de bouche, en complément des moyens mécaniques. Les agents anti-biofilm se définissent par leur capacité de perturber le biofilm et ainsi prévenir le développement de gingivite ou de carie dentaire. Tous les agents antimicrobiens n ont pas nécessairement ces propriétés. Les agents anti-biofilm actifs peuvent agir sur sa formation en interférant avec les mécanismes impliqués dans l adhésion bactérienne ou de coaggrégation entre les bactéries, en affectant la vitalité bactérienne ou
- 3 - en perturbant le biofilm déjà organisé. De nombreux agents antibactériens ont été testés dans des essais cliniques mais peu ont montré des propriétés antiplaques. Le digluconate de chlorhexidine (CHX) compte parmi les composés les plus éprouvés. Ses propriétés antiplaques sont bien établies. La CHX est un bisbiguanide cationique qui interagit avec les charges négatives de la pellicule acquise et inhibe l adhésion bactérienne à la surface amélaire. La CHX est également connue pour ses caractéristiques bactériostatiques vis-à-vis de la majorité des bactéries orales. À haute concentration, elle devient bactéricide et agit tel un détergent en endommageant les membranes bactériennes. L Hexétidine qui est un antiseptique de synthèse dérivé de la pyrimidine a prouvé sa capacité à réduire le biofilm supra-gingival et l inflammation gingivale, son effet anti-biofilm reste inférieur à celui de la chlorhexidine, tandis qu il présente une activité in vitro au mieux égale à la chlorhexidine. L objectif principal de cette étude est de comparer, in vitro, les effets antimicrobiens et anti-plaques de deux bains de bouche : Eludril et Hextril. Cette comparaison se fera : 1. Entre un Eludril fabriqué et commercialisé en France avec son homologue fabriqué et commercialisé au Maroc.
- 4-2. Entre un Hextril fabriqué et commercialisé en France avec son homologue fabriqué et commercialisé au Maroc. 3. Entre Eludril et Hextril. Cette étude sera réalisée sur des bactéries responsables de la carie dentaire (Streptococcus mutans, Lactobacillus acidophilus, Actinomyces naeslundii), dans leurs états planctoniques en déterminant les CMI et les CMB des bains de bouche (concentrations minimales inhibitrices, concentrations minimales bactéricides), et dans leurs états adhérés en biofilm in vitro que se soit immature (jeune) ou mature.
- 5 - Partie 1 : Généralités
- 6-1- GENERALITES : 1-1 GENERALITES SUR LES ANTISEPTIQUES : 1-1-1- Définition : L antisepsie est un acte médical préventif ou thérapeutique vis-à-vis des infections localisées, superficielles ou profondes. Elle a été définie par l AFNOR (association française de normalisation) en 1999 comme étant «une opération au résultat momentané, permettant au niveau des tissus vivants, dans la limite de leur tolérance, d éliminer ou de tuer les micro-organismes et/ou d inactiver les virus, en fonction des objectifs fixés. Le résultat de cette opération est limité aux micro-organismes présents au moment de l opération». [57] Elle est réalisée au moyen d antiseptiques, leur spectre d activité est variable d un produit à l autre. Ils peuvent exercer sur les microorganismes soit un effet létal (bactéricide, fongicide et virucide), ou une simple inhibition de croissance (bactériostatique, fongistatique, virustatique). [54] Remarque : L appellation antiseptique est aujourd hui limitée aux produits utilisés sur la peau ou muqueuse lésée, alors que la désinfection concerne les surfaces inertes (sols, dispositifs médicaux, ) et la peau saine (solution biocide). (D.Muster, 2008). [61]
- 7-1-1-2- Mécanisme d action : Les antiseptiques ont un mécanisme d action caractérisé par une absence de spécificité aux concentrations utilisées : ils agissent globalement sur les différentes structures cellulaires par un mécanisme physico-chimique non spécifique. Les différents antiseptiques peuvent être classés selon leur mécanisme d action et l on peut distinguer ainsi: [61] Ceux qui dénaturent les protéines ; Ceux qui entrainent un éclatement osmotique de la cellule ; Ceux qui interférent avec des processus métaboliques spécifiques. Les antiseptiques qui causent une dénaturation des protéines ou un éclatement osmotique vont tuer les micro-organismes. Tandis que l interférence avec des processus métaboliques spécifiques affectent habituellement la croissance cellulaire et la reproduction, sans tuer la cellule. (D.Muster, 2008) [57] 1-1-3- Les facteurs influençant l activité des antiseptiques : L étude des multiples phénomènes qui influencent l activité des antiseptiques (notamment les modalités d utilisation et le nombre des germes résiduels) est encore très incomplète.
- 8 - De nombreux facteurs physico-chimiques viennent modifier l activité des antiseptiques en intervenant sur leur disponibilité au niveau de leur(s) site(s) d action. (D.Muster, 2008) [61] (L. Ben Slama, M. Djemil, 2004) [11] La température : liée à l énergie d activation du produit. Les solvants : ils peuvent être synergiques ou antagonistes. ph : ph entre 5,5-8,5 : l activité des produits peut être totalement modifiée selon qu ils se trouvent ionisés ou non. Les électrolytes : les sels de l eau dure interférent avec de nombreux antiseptiques. Formation de complexes et adsorption : elles diminuent la disponibilité du produit. Les surfactants : l effet est lié à l affinité de l antiseptique pour les micelles. Concentration de l antiseptique : il existe une relation exponentielle entre la concentration de l antiseptique et le temps nécessaire pour obtenir l effet attendu. Distribution entre phases liquides non miscibles : effet liée au coefficient de distribution entre les phases. Temps de contact. Interaction avec les matières organiques.
- 9 - suivantes : 1-1-4- Les qualités exigées d un antiseptique : Les principales qualités que l on attend d un antiseptique sont les [61, 54, 42] Action germicide puissante à basse concentration. Activité antimicrobienne rapide, létale et persistance (effet de rémanence dans le temps). Stabilité et résistance à la contamination, absence d inactivation par les cellules de l organisme, les fluides tissulaires ou les exsudats résultant de l infection : interaction avec les matières organiques. Adhésion et pénétration grâce à une tension superficielle basse lorsqu il est appliqué de façon topique sans absorption par les tissus en quantité susceptible d entrainer une toxicité générale. Efficacité contre les micro-organismes à une concentration non irritante pour les tissus, absence d interférence avec la guérison et la réparation tissulaire. Absence d induction d hypersensibilité même appliqué de façon répétée. Absence de toxicité en cas d ingestion accidentelle ou de résorption inattendue. D être stable et conserver ses caractéristiques dans le temps et dans la solution.
- 10-1-2- RAPPELS SUR LA FLORE BUCCALE : 1-2-1- Généralités : La cavité buccale est l un des écosystèmes bactériens les plus complexes de l organisme. Plusieurs espèces de micro-organismes cohabitent dans le milieu buccal : bactéries, levures, protozoaires et virus. Cette cavité naturelle constitue avec le côlon, les parties les plus septiques de l organisme humain (M. Sixou et coll. 2006) [79] La flore bucco-dentaire renferme plus de 50 milliards de bactéries, réparties sur plus de 500 espèces différentes, soit plus de 20 genres distincts (AFSSAPS 2001, GENDRON et coll. 2000). [27] Ces différents groupes de bactéries colonisent les différentes surfaces buccales notamment en formant le biofilm. Le biofilm constitue un habitat bactérien important de la cavité buccale. Il s agit d une organisation bactérienne complexe (Eriksen HM et coll. 2006 [22], dont les premiers stades de formation correspondent à un dépôt de glycoprotéines sur les surfaces des tissus durs ou des tissus mous baignant dans la salive. Cette première couche porte le nom de pellicule exogène acquise. Elle est principalement composée de glycoprotéines (albumine, lysozyme, amylase, phosphoprotéines riches en cystéine, IgA(s), lactoferrine, protéines riches en proline, statherine, mucines ), et est secondairement colonisée par des micro-organismes qui vont
- 11 - s organiser en fonction de critères physico-chimiques, nutritionnels ou relationnels. (Diaz PI et coll. 2006). [21] Deux types de biofilms ont fait l objet d un grand nombre d études, Il s agit du biofilm supra-gingival et biofilm sous-gingival. Comme leurs noms l indiquent, ces deux types de biofilms sont définis en fonction de leur localisation anatomique par rapport à la gencive. Le biofilm supragingival est spécifiquement impliqué dans la pathologie carieuse alors que le biofilm sous-gingival est associé aux pathologies parodontales (gingivites, parodontites, Abcès parodontaux) (M. Sixou et Coll. 2006). [79] Les principales bactéries retrouvées dans le biofilm supra-gingival sont : Streptococcus sobrinus, S. mutans, S. sanguis, S. mitis, S. salivarius, Lactobacillus sp. Actinomyces sp. (notamment A. naeslundii). Des interactions spécifiques ont été décrites entre ces différentes bactéries. (M. Sixou et coll. 2006) [79] Bien que le biofilm dentaire ne puisse être éliminé, la pratique d une hygiène orale mécanique individuelle et quotidienne par un brossage dentaire, associée à des interventions professionnelles tel que le détartrage, permettent généralement un contrôle de l évolution du biofilm dentaire et [In 57] donc du risque pathologique. «Axelsson 1998» Cependant, dans certaines situations et/ou pour des populations à risque (difficulté de brossage, fumeurs ) des mesures supplémentaires doivent être envisagées.
- 12 - Ainsi, de nombreux auteurs recommandent l usage de bains de bouche comme adjuvant à l hygiène orale mécanique (Addy et coll. 1994, Brecx et coll. 1992, Brecx et coll. 1993, Neutushil et coll. 1995). [In 57] L usage des bains de bouche ou de solutions en rinçage à propriétés antiseptiques dans la prévention et le traitement des pathologies buccodentaires est très ancien. Ceci a conduit, depuis environ 50 ans (Slanetz et Brown, 1949) [in74], au développement d études dont l objectif est de définir leur efficacité in vitro et in vivo. Notre étude qui a pour objectif de comparer l effet bactéricide et bactériostatique de deux bains de bouche antiseptiques (Eludril : Chlorhexidine à 0.1%, Hextril : Hexétidine 0.1%) ayant le même principe active mais fabriqués et commercialisés dans deux pays différents (France et Maroc), sera menée sur trois bactéries responsables de la carie dentaire. La carie dentaire qui est une maladie infectieuse, se manifeste par une déminéralisation acide d origine bactérienne. Trois genres bactériens ont démontré des propriétés cariogènes chez l animal : Streptococcus, Lactobacillus et Actinomyces. Les espèces directement impliquées dans les processus carieux sont : Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Streptococcus sanguis, Streptococcus salivarius, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Actinomyces viscosus et Actinomyces naeslundii. [79] Si ces bactéries cariogènes rencontrent dans la cavité buccale des glucides fermentescibles, une quantité importante d acides se produit au contact des tissus durs de la dent. Le phosphate de calcium à la surface de
- 13 - l émail passe en solution sous l action de la chute de ph si la salive n est pas capable de compenser, par son pouvoir tampon, la production d acides (Eriksen HM et coll. 2006). [22] Ce phénomène d acidogénèse du biofilm est responsable du processus carieux. 1-2-2- Les bactéries choisies pour l étude : Les bactéries que nous avons choisi dans notre étude sont : (Lactobacillus acidophilus, Streptococcus mutans et Actinomyces naeslundii) dans leurs états planctoniques (en suspension) et adhérés en biofilm. 1-2-2-1 Lactobacillus acidophilus : L appellation Lactobacillus a été proposée plus de 100 ans, en 1901 par Beijerinck M. W. L espèce acidophilus ''acide aimé'' a été ainsi probablement nommée parce que, historiquement, les lactobacilles sont isolés à partir de tractus intestinal et vaginal de l'homme et des animaux, où le milieu peut être très acide. [29] L. acidophilus est l'une des espèces les plus communément reconnues du genre Lactobacillus. Ceci est principalement dû à la commercialisation de cette espèce dans divers promotions de la santé, des aliments fermentés et des compléments alimentaires. [28] Les lactobacilles sont des bacilles rectilignes ou incurvés de longueur et d épaisseur variables. Ils sont immobiles, à Gram positif, asporulés et acapsulés le plus souvent (Figure 1). Les espèces les plus fréquemment
- 14 - isolées dans la cavité buccale sont : L. acidophilus, L. casei, L. fermentum, L. crispatus, L. grasseri. [79] Le genre Lactobacillus est classé dans les bactéries lactiques. Leur caractère fortement acidogène les a fait classer en bactéries cariogènes. En fait, les lactobacilles sont des colonisateurs secondaires des cavités carieuses. Leur faible capacité d adhésion aux surfaces lisses explique leur localisation préférentielle dans les sillons et les faces occlusales. Dans les conditions normales, la salive et les tissus mous sont l habitat préférentiel des lactobacilles. [79] Le nombre de L. acidophilus décroit avec l âge, selon l étude de Gizani et coll. (2009) réalisée sur 93 enfants, de 3 à 12 ans. [72] Comme lactobacillus préfère des conditions microaérophiles, il est retrouvé en nombre important au niveau des canaux radiculaires. [80]
- 15 - Figure 1 : Photos de Lactobacillus acidophilus : (a et b) culture sur gélose au sang, (c) microscopie optique après coloration de Gram, (d) microscopie électronique à balayage. Pr. T. Rochd
- 16-1-2-2-2 Streptococcus mutans : S. mutans est l un des streptocoques quantitativement dominants de la flore orale humaine. Il synthétise des polysaccharides extracellulaires à partir du saccharose salivaire. De nombreuses études ont montré le rôle étiologique de ce microorganisme dans la carie. Dans l espoir de mettre au point un vaccin anti carie. L antigénicité de S. mutans a fait l objet de nombreuses études. Cette espèce bactérienne a également été fortement impliquée dans l étiologie des endocardites infectieuses chez l Homme. [In 79] (Mitchell 2003; Banas 2004; Kuramitsu 2006) Le genre Streptococcus est constitué de petits cocci, de forme sphérique ou ovoïde, dont le diamètre varie entre 0.5 et 2 µm, ils sont immobiles, asporulés et à Gram positif, se retrouvent en paires (culture en boîte de Pétri) ou en chaînettes (milieu liquide) (Figure 2). Ce sont des bactéries anaérobies facultatives qui nécessitent un milieu de culture enrichi (gélose Columbia), additionné de sang de mouton 5% et une atmosphère avec 10% de CO 2. Leur métabolisme est de type fermentatif. (Schelgel et Bouvet, 2000) [74] Les streptocoques sont classés en quatre groupes ; les streptocoques de groupe D, les streptocoques pyogènes, généralement pathogènes pour l Homme, les streptocoques oraux peu ou pas pathogènes pour l Homme et les streptocoques non classés (Schelgel et Bouvet, 2000). [74] oraux. Les streptocoques mutans appartiennent au groupe des streptocoques
- 17 - Les streptocoques mutans sont les bactéries prédominantes du biofilm cariogène, car ils sont les plus armés pour utiliser les glucides fermentescibles, en particulier, le saccharose de l alimentation. Ils possèdent de nombreux facteurs de virulence (Burne 1998, Banas 2004): [10,19] Leur seul habitat naturel est la surface dentaire. Ce sont des bactéries acidogènes; ils produisent des acides. Ils synthétisent des polysaccharides extracellulaires produits à partir du saccharose de l alimentation. Ces polysaccharides jouent un rôle prépondérant dans la cohésion des bactéries entre elles et dans leur adhérence à la surface de l émail. Ils possèdent de nombreuses adhésines, permettant une meilleure fixation aux surfaces dentaires et aux autres espèces bactériennes.
- 18 - Figure 2 : Photos de Streptococcus mutans (a et b) culture sur gélose au sang, (c) microscopie optique après coloration de Gram, (d) microscopie électronique à balayage. Pr. T. Rochd
- 19-1-2-2-3 Actinomyces naeslundii : Le genre Actinomyces est constitué d'un groupe diversifié d'espèces à croissance lente qui sont à Gram positif, non sporulés, en forme de bacilles. Ce sont généralement, des bâtonnets droits ou légèrement incurvés de 0.2 à 1 µm de diamètre, de longueur variable, présentant parfois des renflements terminaux les faisant confondre avec les champignons. Ils peuvent se rencontrer seuls ou par paires avec des arrangements en V, You L, en palissade ou en petits groupes, ils sont catalase-négatifs. [30, 60] (Figure 3) Au microscope, les cellules semblent polymorphes, allant de courtes tiges aux longues formes filamenteuses avec une vraie ramification. Bien qu elles soient généralement classées dans les bactéries anaérobies, elles sont couramment décrites comme étant anaérobies facultatives, microaérophiles ou anaérobies obligatoires (Sarkonen et coll. 2001), (Forbes et coll. 2002). [73, 24] Certaines espèces se développent en présence d'oxygène, car ils sont fermentaires, elles n'utilisent pas l'oxygène comme accepteur terminal d'électrons et sont probablement mieux décrites comme étant anaérobies aérotolérants. La croissance de la plupart des espèces d Actinomyces est améliorée quand elles sont incubées avec l'augmentation de dioxyde de carbone dans l'atmosphère ou le bicarbonate dans le milieu (Schaal 1986). [In 16]
- 20 - Le genre Actinomyces est fortement représenté dans la cavité buccale et est présent sur l ensemble des surfaces orales. Il apparait chez le jeune enfant dès l éruption des dents et est capable de coloniser les surfaces dures ainsi que les espaces gingivo-dentaires. La colonisation de la cavité buccale par les espèces pionnères S. salivarus puis S. sanguis, S. mutans et Actinomyces va permettre l établissement de 200 à 300 espèces. On les retrouve essentiellement dans le biofilm dentaire, la salive, le tartre et les amygdales. (M. Sixou et coll. 2006) [79] Ces bactéries jouent un rôle important dans l étiologie des caries chez l Homme. en particulier A. naeslundii, et A. odontolyticus (Shuster 2002), (Trümmel et Behnia, 2002). Elles ont été plus spécifiquement impliquées dans les caries cémentaires (caries des racines généralement rencontrées chez des sujets de plus de 50 ans), (M. Sixou et coll. 2006). [71, 78, 82]
- 21 - Figure 3 : Photos d Actinomyces naeslundii (a et b) : culture sur gélose au sang, (c) : microscopie optique après coloration de Gram et (d) : microscopie électronique à balayage. Pr. T. Rochd
- 22-2- DIFFERENTS COMPOSANTS DES BAINS DE BOUCHE: Un bain de bouche est une préparation médicamenteuse d utilisation locale externe. Il joue un rôle dans le traitement préventif, curatif et dans la maintenance de l hygiène dans diverses affections stomatologiques et pharyngées. être : Les bains de bouche possèdent des actions principales qui peuvent Anti-carieuse. Antibiotique. Antiseptique. Anti-inflammatoire. Antalgique. Cicatrisante Ils peuvent également avoir des effets adjuvants tel que l effet désodorisant.
- 23-2-1 LES BAINS DE BOUCHE ANTISEPTIQUES : 2-1-1 Biguanides : Cette famille comprend principalement la chlorhexidine. La chlorhexidine est un biguanide chloré, découverte en 1950 en Angleterre. De part son efficacité clinique et microbiologique, la chlorhexidine «CHX» fait figure de «gold standard» ou la norme d or de l antisepsie orale. (Segreto et coll. 1970 [75] ; Lang et Brecx. 1986 [In17] ; Addy et coll. 1991a [1] ; Franco Neto et coll. 1994 [In 86] ). Structure chimique : La formule développée de la chlorhexidine se compose de deux anneaux symétriques 4-chlorophényl et deux groupes biguanide reliés par une chaine centrale d hexaméthylène, comme illustré dans la figure 4. Spectre d activité : Les concentrations d efficacité optimale étant comprises entre 0.10% et 0.20%. Selon Sixou et Hamel 2002 [18], elle serait bactériostatique à faible dose et bactéricide à forte dose. En effet, à faible concentration la membrane cellulaire sera lésée, tandis qu à forte concentration les protéines et les acides nucléiques précipiteraient. (O. Jame et coll. 2004) [41]
- 24 - Son action est très puissante sur les bactéries à Gram positif, en particulier les streptocoques (P. Agarwal, L. Nagesh 2011) [67], tandis qu elle a une activité plus faible et variable sur les bactéries à Gram négatif et les lactobacilles lui seraient résistants. Il en est de même pour les spores, mycobactéries et virus. Cet antiseptique possède également une activité fongistatique sur Candida albicans et est faiblement virucide in vivo. Propriétés et indications : Son pouvoir de fixation sur les tissus de la cavité buccale est à l origine de : la persistance de son effet bactéricide dans le temps (effet de rémanence). Sa capacité à prévenir la formation du biofilm dentaire supragingival et l apparition de gingivite «action anti-biofilm». Segreto et coll. 1986 ont montré qu une concentration à 0.12% a la même efficacité que celle à 0.20% en termes de réduction du biofilm dentaire et gingivite, mais associée à une moindre fréquence d effets indésirables. [75]
- 25 - Figure 4 : Structure chimique de la Clorhexidine. [48]
- 26 - Les solutions pour bains de bouche (0.1% à 0.2%) peuvent se présenter seules «Corsodyl, Parodex, Prexidine..» ou associées à d autres principes actifs qui ont un effet analgésique ou anesthésique local : chlorobutanol, chloroforme, menthol «Exemple : Eludril». Ces bains de bouche sont utilisés dans la prévention de la formation du biofilm dentaire et l apparition des gingivites (réduction du biofilm de 40 à 60% selon les études) et aussi dans le traitement d appoint des infections bucco-dentaires et dans les soins pré- et post-opératoires lors de chirurgie parodontale ou extraction dentaire. Inconvénients et effets indésirables : On peut noter : [54] Coloration brunâtre superficielle réversible du dos de la langue, des dents, et des restaurations composites. Dysgueusie, sensation de brûlure ou de picotement de la langue. Desquamation de la muqueuse buccale. Allergie de contact. Incompatibilité chimique avec les dérivés anioniques (savon). 2-1-2 Ammoniums quaternaires : Ce sont des agents tensio-actifs, ils possèdent un pôle hydrophobe et un pôle hydrophile, ce dernier étant chargé positivement, on parle de «surfactifs cationiques». Ils sont le plus souvent associés à d autres principes actifs : alcool, anesthésique local
- 27 - Le chlorure de benzalkonium est le plus connu des ammoniums quaternaires, mais d autres existent tels que le cétrimide, le chlorure de miristalkonium, le chlorure de cétalkonium et le chlorure de cétylpyridinium. Ces deux derniers étant destinés aux affections buccodentaires. 2-1-3 Hexahydropyrimidines : L hexétidine est un antiseptique de synthèse dérivé de la pyrimidine, fréquemment rencontré dans les préparations à usage pharyngé et buccodentaire. [61, 54, 5] (Figure 5)
- 28-1,3-bis (2-ethylhexyl)-5-methyl-1,3-diazinan-5-amine Figure 5 : Structure chimique de l Hexétidine. [59]
- 29 - Spectre d activité : La solution à 0.1% est plus active sur les bactéries à Gram positif que sur celles à Gram négatif, son action serait antibactérienne en bloquant la synthèse d adénosine triphosphate (ATP). [42] A concentration thérapeutique l Hexétidine n a pas d activité sur Candida albicans et les virus. [54] D autres études ont prouvé l activité de l Hexétidine in vivo et in vitro contre les bactéries à Gram positif, à Gram négatif ainsi que les levures (Candida. albicans). (Roberts & Addy 1981, Ashley 1984, Wile et coll. 1986) [In5] Propriétés et indications : L Hexétidine utilisé sous forme de bain de bouche «Exemple : Hextril» a un effet anti-plaque mais inférieur à celui de la chlorhexidine. Elle présente une activité in vitro au mieux égale à celle de la chlorhexidine (Roberts & Addy 1981, Ashley 1984). [57] Sa capacité à réduire la plaque dentaire supra-gingivale et l inflammation gingivale a été prouvée. (Sharma et coll. 2003) [70] Proposée dans le traitement des infections bucco-dentaires comme la gingivite, stomatite, les aphtes buccaux et en cas de mauvaise haleine.[5] L Hexétidine peut réduire jusqu'à 98% le nombre des germes de la salive directement après le rinçage, mais à raison de sa faible rétention
- 30 - sur les surfaces buccales, les bactéries retournent à leur chiffre initial après 70 à 90 min (Roberts & Addy 1981)[ 57]. Inconvénients et effets indésirables [61, 42, 11] : Son action reste inférieure à celle des autres antiseptiques et sa durée d action est limitée. L Hexétidine possède une faible capacité de rétention aux surfaces dentaires par rapport à la Chlorhexidine. Contre indiqué chez les enfants de moins de 6 ans. Elle a comme effet indésirable une altération temporaire du goût et un engourdissement buccal. 2-1-4 Alcools : Les alcools sont des agents bactéricides pouvant être utilisés comme antiseptiques ou désinfectants, sont généralement peu toxiques lorsqu ils sont utilisés localement. Les composés les plus utilisés sont : l éthanol et le chlorobutanol, qui sont des agents bactéricides et servent aussi de solvants à de nombreux antiseptiques. Le chlorobutanol a un effet anesthésique local et commercialisé sous forme d association. (Exemple : Eludril qui associe le chlorobutanol et le digluconate de chlorhexidine) 2-1-5 Dérivés halogénés : Les dérivés iodés et les dérivés chlorés sont les principaux dérivés halogénés utilisés comme antiseptiques en odontostomatologie, ce sont des agents oxydants très actifs.
- 31-2-1-6 Phénols et dérivés phénoliques : Le phénol fut le premier antiseptique utilisé pendant les interventions chirurgicales. Les principaux dérivés phénoliques retrouvés dans les bains de bouche : l eugénol, thymol, menthol, et le triclosan qui est un bis-phénol. 2-1-7 Aldéhydes : Les aldéhydes sont des substances résultant de l oxydation d un alcool. Les principaux dérivés sont l aldéhyde formique ou formaldéhyde et le glutaraldéhyde. Ce dernier est utilisé pour la désinfection du matériel médical qui ne peut supporter la chaleur comme les endoscopes. 2-1-8 Dérivés métalliques : Les métaux lourds sont les «vieux» antiseptiques dont l utilisation est considérablement restreinte ces dernières années, compte tenu de leur rapport efficacité/tolérance souvent défavorable. Représentés par l argent, le sulfate de cuivre et de zinc. 2-1-9 Agents oxydants non halogénés : Les oxydants sont très hautement réactifs, ils ont des propriétés antiseptiques par libération d oxygène. Le plus utilisé aujourd hui est le peroxyde d hydrogène (H 2 O 2 ). 2-1-10 Acides : Ce sont des antiseptiques représentés par l acide acétique, l acide benzoïque et l acide borique.
- 32-2-1-11 Colorants : Les colorants sont des antiseptiques faibles qui sont de moins en moins utilisés : rouge à l éosine, vert de méthyle, cristal violet, ils peuvent être prescrits en solution aqueuse ou faiblement alcoolique. 2-1-12 Dérivés mercuriels : En raison de leur toxicité et de leurs effets indésirables importants, ils ont été retirés du marché. 2-1-13 Sanguinarine : C est un alcaloïde de synthèse extrait de Sanguinaria canadensis qui a des propriétés antibactériennes et anti-inflammatoires. Il inhibe les mécanismes d adhésion des bactéries à la pellicule exogène acquise. Malgré tout, cet agent tend à disparaître de la plupart des spécialités, car son activité in vivo reste faible. En effet, certains auteurs ont démontré une activité tant sur les bactéries que sur l inflammation gingivale, d autres semblent mettre en doute l efficacité du produit. [43] 2-1-14 Récapitulatif des principaux antiseptiques cf. tableaux 1 et 2 :
- 33 - Tableau 1 : Spectre d activité théorique des principaux antiseptiques (d après Plats et coll. 2002) : Bactéries à Gram positif Bactéries à Gram négatif Champignons Spores Virus VE Virus VN et Pox V Biguanides +++ ++ + 0 ± 0 Chlorhexidine Halogénés Dérivés iodés +++ +++ ++ ++ ++ ++ Dérivés chlorés +++ +++ ++ ++ ++ ++ Alcools ++ ++ + 0 + ± Alcool éthylique 70 Alcool isopropylique Tensioactifs +++ + + 0? 0 Ammoniums quaternaires Diamidines + 0 + 0 0 0 Carbanilides ++ ± 0?? 0 Triclocarban Dérivés métalliques ± ± 0 0 0 0 Oxydants + ++ ± + ± 0 Péroxyde d hydrogène 10 Vol Anaérobies Lentement levuricide Lentement virucide Colorants ± ± 0 0 0 0 Activité létale : forte : +++ ; moyenne : ++ ; faible : + ; nulle : 0 ; non précisée :? ; VE = virus enveloppés : Herpes virideae (cytomégalovirus, varicelle-zona, herpès simplex, Epstein- Barr), virus des oreillons, de la rougeole, de la rubéole, de la fièvre jaune, de la rage, virus respiratoire syncytial, influenzae (grippe) et para influenzae, rétrovirus : VIH, HTLV, hépatite C, hépatite B (± hépatite D). VN = virus nus : entérovirus, polio, coxsackie, écho-virus, adénovirus, papillomavirus (verrues, condylomes), parvovirus, calcivirus, astrovirus ; Pox V = poxvirus (variole, vaccine, Molluscum contagiosum, ) virus enveloppé très résistant.
- 34 - Tableau 2 : Adaptation des spectres d activité antibactérienne des antiseptiques à diverses pathologies buccales (d après Feki et coll. 2006) : Alcool Dérivés oxygénés Formaldéhyde Triclosan Listérine Sanguinarine Dérivés iodés Ammonium Hexétidine Chlorhexidine à 0,20% Chlorhexidine à 0,12% Gingivite ++ + + + + + + + - Parodontite Flore agressive Flore perturbée Flore stabilisée ++ ++ + ++ + + ++ ++ + + + + + Halitose + + + - - + + + - candidose + + - ++ - - Complicatio ns post chirurgicales + + ++ - ++: Spectre adapté ; + : spectre moyennement adapté ; - : spectre inadapté.
- 35-2-2 LES BAINS DE BOUCHE ANTI-INFLAMMATOIRES: Ils sont utilisés en cas d inflammation et de saignement gingival provoqués ou non par le port d appareils orthodontiques. Ils contiennent souvent l énoxolone «Arthrodont» ou de l acide salicylique «Synthol». L absence de fluor et d antiseptique dans leur formule doit cependant limiter leur utilisation à usage ponctuel symptomatique destiné seulement à soulager l irritation. En effet, la cause de l inflammation ou du saignement est le plus souvent liée à une surcharge bactérienne buccale due à une accumulation du biofilm dentaire, et doit être prise en charge par un antiseptique. [15] 2-3 LES BAINS DE BOUCHE ANTIBIOTIQUES : La tétracycline est utilisée en bains de bouche de 2 minutes, quatre fois par jour, dans le traitement des aphtes, les aphtoses herpétiformes ou majeures en association avec la triamcinolone acétonide ou la nystatine. La tétracycline inhiberait l activité de la collagénase et son application locale semble agir également par action caustique en raison du ph très basique du chlorhydrate de tétracycline. [62] 2-4 LES BAINS DE BOUCHES AUX CORTICOÏDES : La prednisolone (Solupred 20 mg) en comprimés effervescents permet de réaliser un bain de bouche prescrit à raison de deux ou trois fois par jour, pur ou associé à l Eludril (si on veut éviter qu il soit avalé), essentiellement dans les cas de lichen érosif ou d ulcérations aphtoïdes. [62]
- 36-2-5 LES BAINS DE BOUCHE FLUORES : Ils participent à la lutte contre les caries dentaires, grâce à l action reminéralisante. Le fluor permet de diminuer la déminéralisation de l émail dentaire, il agit sur le métabolisme du biofilm bactérien par inhibition de la glycolyse et de la production d acides et de polysaccharides, exemple de bains de bouche fluorés : «Fluocaril, Elmex». [15] 2-6 LES BAINS DE BOUCHE NEUTRALISANT DE LA MAUVAISE HALEINE : Ils agissent principalement sur le développement des bactéries au niveau de la langue et des gencives. Les antiseptiques sont souvent associés aux agents neutralisant les enzymes qui produisent les composés sulfurés volatils comme les huiles essentiels «Listérine» et le lactate de zinc «Halita, Méridol Halitosis», ces derniers neutralisent les composés sulfurés volatils. [15] 2-7 LES BAINS DE BOUCHE UTILISES DANS NOTRE ETUDE On entend souvent dire que les médicaments fabriqués et commercialisés au Maroc sont moins efficaces que ceux fabriqués en France.
- 37 - Les médias aussi parlent souvent de médicaments en circulation en Afrique et passant les barrières douanières marocaines, seraient de faux médicaments et contiendraient moins de principe actif ou pas du tout. Le but de notre travail est de confirmer ou d infirmer cette rumeur en réalisant une étude comparative de l effet bactéricide de deux bains de bouche fabriqués et commercialisés en France avec les mêmes fabriqués et commercialisés au Maroc. Les bains de bouche choisis pour cette étude sont (Figure 6): 1. Hextril : 0,1% d héxétidine 2. Eludril : 0,1% de Chlorhexidine gluconate
- 38 - Figure 6 : Photo des bains de bouche antiseptiques choisis pour l étude
- 39-2-7-1 ELUDRIL : ELUDRIL est une solution pour bain de bouche. Il se présente sous la forme de flacon de 90ml. Composition : 0.5 ml de solution de digluconate de chlorhexidine à 20% pour 100ml de solution de bain de bouche. 0.5 g de chlorobutanol hémihydraté pour 100ml de solution de bain de bouche. Excipient aromatisé q.s.p : éthanol, glycérine, dioctylfosuccinate de sodium, nipagine, nipasol, rouge de cochenille, menthol naturel, essence de menthe, eau). Indications : ELUDRIL est utilisé depuis 40 ans pour le traitement local d appoint des affections de la cavité buccale et lors de soins postopératoires en odonto-stomatologie. Contre-indications : En cas d allergie connue à la chlorhexidine, au chlorobutanol ou aux autres constituants de la solution.
- 40 - Posologie et mode d administration : Eludril est réservé à l adulte et à l enfant de plus de 6 ans. Il s utilise localement en bain de bouche (il ne faut pas l avaler). Sa posologie usuelle est de 10 à 15 ml de solution à diluer dans le gobelet doseur en complétant jusqu au trait supérieur avec de l eau tiède. 2 à 3 fois par jour pendant 30 secondes à chaque fois, sachant que la dose maximale est de 20ml (à diluer), 3 fois par jour. Il est nécessaire de se brosser les dents et de rincer la bouche à l eau avant chaque utilisation d Eludril. Interactions médicamenteuses : L utilisation simultanée ou successive d autres antiseptiques est à éviter compte tenu des interférences possibles (antagonisme, inactivation ). Surdosage et mise en garde : Un surdosage n est pas attendu dans les conditions normales d utilisation de cette solution en bain de bouche. Toutefois, en cas de passage systémique, des manifestations de toxicité neurologique peuvent apparaître. Elles seraient à traiter en milieu spécialisé. L usage prolongé de ce médicament peut modifier l équilibre microbien naturel de la bouche et de la gorge.
- 41 - Durée de conservation : 3ans 2-7-2 Hextril : Hextril est une solution pour bain de bouche, il se présente sous forme de flacon de 200 ou 400ml. Composition : 0.1g d Hexétidine pour 100ml de solution bain de bouche les autres composants sont : Polysorbate 60, saccharine sodique, salicylate de méthyle, huile essentielle de girofle, menthol, huile essentielle d anis, huile essentielle de menthe poivrée, huile essentielle d eucalyptus, azorubine 85% (E122) acide citrique monohydraté, éthanol à 96%, eau purifiée. Indications : Hextril est indiqué dans le traitement local d appoint des affections buccales la gingivite, stomatite, les aphtes buccaux et en cas de mauvaise haleine. Contre-indications : En cas d allergie à l Hexétidine ou de l un des autres composants contenus dans la solution bain de bouche. Posologie et mode d administration : Hextril est réservé à l adulte et à l enfant de plus de 6ans. Utilisation locale en bain de bouche (ne pas l avaler).
- 42 - Hextril s emploie pur ou dilué en versant la solution bain de bouche dans le gobelet doseur jusqu'à l encoche indiquant 15ml et en complétant par de l eau en cas d utilisation d Hextril dilué, une dose 2 à 3 fois par jour. Il est nécessaire de se brosser les dents et de rincer la bouche avant utilisation d Hextril. Interactions médicamenteuses et surdosage : L utilisation simultanée ou successive d autres antiseptiques est à éviter. Certains constituants d Hextril (huiles essentielles) peuvent entraîner à doses excessives, des accidents neurologiques à type convulsion chez l enfant. Durée de conservation : 3ans à une température ne dépassant pas +25 C.
- 43 - Partie 2 : Matériels et méthodes
- 44-1- DETERMINATION DES CMI DES BAINS DE BOUCHE PAR MICROMETHODE : Les souches bactériennes : Souches bactériennes testées : Streptococcus mutans (Prélevé et identifié dans notre laboratoire FMDC) Lactobacillus acidophilus (Prélevé et identifié dans notre laboratoire FMDC) Actinomyces naeslundii IP 100654 (souche référencée) Milieu de culture : Gélose trypticase soja (GTS) (Biokar Diagnostics) Bouillon trypticase soja (BTS) (Biokar Diagnostics) Neutralisant de l activité bactéricide : Thiosulfate de sodium 0.5% Tween 80 2% Lécithine 2 % Bouillon TS qsp Appareillage : Microplaques stériles à 96 puits (TPP, Suisse) Tubes à essais en verre stériles à fond rond
- 45 - Boîtes de Pétri en plastique stériles pour culture (90 mm de diamètre) Etuve à 37 C (Binder) Hotte à flux laminaire vertical (Telstar Bio-II-A) Spectrophotomètre lumière visible (Jenway 6300) Micropipettes (100µl, 1000µl et multicanaux) Produits : Les solutions de bains de bouche utilisées sont : Eludril Maroc : (Laboratoire Inava, Pierre Fabre Médicament) Flacon de 90 ml : Chlorhexidine à 0.10% Eludril France : (Pierre Fabre, Oral Care) Flacon de 200 ml Chlorhexidine à 0.10% Hextril Maroc : (laboratoire Pfizer) Flacon de 200 ml : Hexétidine 0.1% Hextril France : (Laboratoire Famar Orléans) Flacon de 200 ml : Hexétidine 0.1%
- 46 - Description de la méthode AFNOR : Pour la détermination des CMI et CMB, nous avons choisi d appliquer la microméthode en suivant les normes de l AFNOR (Association Française de Normalisation). L'activité bactéricide d'un agent antimicrobien est mesurée en mettant en contact les germes et le produit à tester pendant une durée de 5 minutes. L'action bactéricide est alors stoppée par transfert dans un mélange neutralisant (10 min) qui va inactiver l antiseptique et le diluer (méthodes de dilution neutralisation selon les normes AFNOR NF T72-150). D'après les normes AFNOR, la concentration minimale bactéricide est la plus petite concentration à laquelle le produit est capable de réduire d'au moins 10 5 fois (= réduction de 5log) le nombre de cellules vivantes après 5 minutes de contact germes-antiseptique. Au préalable, un test de validité du neutralisant doit être effectué. Le neutralisant doit stopper l'activité du désinfectant sans avoir d'effet bactéricide, il doit être capable de disperser les produits en émulsion, de stabiliser les cellules atteintes et les préserver de la mort jusqu'à leur mise en culture. On se doit alors de : * vérifier d'une part son innocuité sur les germes testés. Le neutralisant est alors mis en présence des germes pendant 10 mn de contact.
- 47 - S'il n'a aucun effet létal, le nombre de germes/ml viables restant (N') doit être proche du nombre de germes/ml inoculé au départ (N). * s'assurer d'autre part de la bonne neutralisation de l antiseptique et de l'innocuité du ou des produits formés : un contact préalable de l'antiseptique avec le neutralisant pendant 10min, est nécessaire avant l'inoculation des germes. Si l'antiseptique est bien neutralisé et si les produits formés ne sont pas bactéricides, une quantité voisine de germes viables (n') doit être retrouvée après la mise en contact avec le mélange antiseptique/neutralisant. Détermination des CMI (Concentrations Minimales Inhibitrices): La CMI est la plus faible concentration d un antiseptique ou antibiotique capable de provoquer une inhibition complète de la croissance d une bactérie donnée, appréciable à l œil nu, après une période d incubation donnée. La microméthode est largement utilisée, notamment pour la détermination des Concentrations Minimales Inhibitrices (CMI) de divers produits antiseptiques et antibiotiques. Elle permet en effet de tester rapidement une plus large gamme de concentrations, ce qui serait difficilement réalisable avec la macrométhode de l'afnor; méthode trop lourde pour tester plusieurs paramètres dans des conditions strictement identiques.
- 48 - Préparation des suspensions bactériennes : Les concentrations minimales inhibitrices et les concentrations minimales bactéricides ont été déterminées sur des bactéries en suspension. Les souches ayant été préalablement repiquées la veille sur gélose Trypticase Soja. Après vérification de la pureté des souches par coloration de Gram et observation de la morphologie microscopique. Les suspensions bactériennes ont été obtenues par écouvillonnage de la surface des géloses et dispersion dans le milieu de culture bouillon Trypticase Soja. Elles sont ajustées par la suite à environ 10 9 bactéries/ml correspondant à une mesure de la densité optique (DO : transmission optique : 40% à la longueur d onde 640 nm). Une dilution de 1/10 a été réalisée dans le bouillon TS pour l obtention d une concentration de 10 8 bactéries/ml. La microméthode utilisée est la suivante : Une distribution de 100 µl de bouillon Trypticase soja a été réalisée dans chaque cupule d une microplaque stérile à 96 puits à l aide d une pipette multicanaux. (Figure 7) Les dilutions de l'antiseptique sont réalisées de la 1 ère colonne à la 10 ème. 100 µl de la solution mère du produit testé sont ajoutés à la 1 ère colonne. A l'aide d'une pipette multicanaux, une homogénéisation est assurée, puis 100 µl sont transférés de la 1 ère à la 2 ème colonne, et ceci jusqu'à la 10 ème colonne (dilutions de raison 1/2).
- 49 - Les colonnes 11 et 12 représentant respectivement les témoins positif et négatif, contiennent uniquement 100µl de bouillon TS. 100µl de suspension bactérienne ajustée à 108 bactéries/ml, a été introduite dans toutes les cupules de la microplaque à l exception de ceux de la 12ème colonne (témoin négatif). Les microplaques sont ensuite placées dans l étuve à 37 C sous anaérobiose. la procédure a été réalisée pour chaque souche bactérienne. La lecture des résultats se fait visuellement : après 48h d incubation. La plus grande dilution donnant lieu a une clarté identique au témoin négatif, représente la concentration minimale inhibitrice.
- 50 - Figure 7 : Préparation de la microplaque pour la CMI.
- 51-2- DETERMINATION DES CMB DES BAINS DE BOUCHE PAR MICROMETHODE : Préparation des souches bactériennes : Les souches ayant été préalablement repiquées la veille sur gélose Trypticase soja. Une vérification microscopique de la morphologie des souches a été réalisée. Les CMB ont été déterminées sur les bactéries en suspension obtenues par écouvillonnage de la surface des géloses et dispersion dans le milieu de culture bouillon TS. Elles sont ajustées ensuite à 10 9 bactéries /ml, correspondant à une mesure de la densité optique (DO : 640nm, transmission optique 40%). La détermination des CMB par microméthode a été le plus rigoureusement possible, adaptée à celle préconisée par la norme AFNOR NF T 72-152, en respectant les concentrations, les temps de contact et les interprétations des résultats. La microméthode par dilution neutralisation utilisée est la suivante : Dans une 1 ère microplaque stérile à 96 puits, 100 µl d eau distillée stérile ont été distribués dans chaque puits de la microplaque. une distribution de 100µl des produits bains de bouche a eu lieu dans les puits de la 1ère colonne (deux cupules par produit).
- 52 - les dilutions des bains de bouche (100µl) ont été réalisées de la 1ère colonne vers la 10ème (raison de ½) à l aide de pipette multicanaux. Les colonnes 11 et 12 présentant respectivement les témoins positif et négatif contiennent uniquement 100µl d eau distillée. 20 µl de suspension bactérienne ajustée à 109 bactéries/ml sur bouillon TS ont été introduits dans tous les puits de la microplaque à l exception de ceux de la 12ème colonne (témoin négatif). Après 5min de contact (± 10sec), 50µl de chaque puits a été transféré dans les puits correspondants d une 2ème microplaque contenant 150µl de neutralisant par puits à l aide d une pipette multicanaux. Après 10 min de contact avec le neutralisant, un repiquage de 1.5µl a été réalisé à l aide d un ensemenceur multipoint vers une 3ème microplaque contenant 200µl de milieu de culture bouillon TS. Les microplaques sont ensuite placées dans l étuve à 37 C sous anaérobiose pendant 48h. testée. La procédure a été réalisée pour chaque souche bactérienne Les résultats sont ensuite lus en observant la turbidité de chaque puits. L absence de croissance bactérienne correspond à une destruction supérieure ou égale à 10 5 bactéries/ml.
- 53 - Figure 8 : Schéma illustrant la réalisation de la CMB par microméthode.
- 54-3- BIOFILMS DENTAIRES ET LEUR TRAITEMENT AVEC LES BAINS DE BOUCHE: Les biofilms ont été établis selon le modèle de biofilm Zürich (Guggenheim et coll. 2001) [73], qui a décrit un modèle de biofilm supragingival dans lequel les cellules sont cultivées en anaérobiose dans un milieu à base de la salive sur des disques d'hydroxyapatite revêtus d'une pellicule salivaire, avec un matériau, des pièces et des appareils communes à tous les laboratoires de microbiologie. Dans notre étude nous avons choisi d utiliser des incisives de bœuf comme support pour la formation du biofilm. Traitement des dents : Après leur extraction, les dents ont été raclées puis trempées dans une solution NaOCl à 5% pendant 2 heures, afin d éliminer les débris organiques attachés à la racine. (Perez F et coll. 1996) [66] La solution NaOCl a été renouvelée toutes les 30min (3 renouvellements ont été réalisés). La standardisation de la surface de l émail vestibulaire a été réalisée à l aide d un microtour et une fraise métallique en taillant les bords, afin d obtenir une surface d émail de 5 mm sur 5 mm (25mm 2 ). Une concavité au niveau du collet anatomique a été faite pour faciliter le raclage du biofilm par la suite.
- 55 - Après leur standardisation, les dents ont été trempées dans une solution NaOCl à 5% pendant 1h avec un renouvellement de la solution après 30min. Les dents sont ensuite rincées abondamment à l eau distillée et stérilisées dans de l eau distillée (à 120 C pendant 20min) puis conservées à 4 C jusqu'à utilisation.(figure 9)