Milieu d étalement préparé BBL servant aux tests de sensibilité de Neisseria gonorrhoeae GC II Agar with IsoVitaleX Enrichment= 8809031JAA(01) = APPLICATION La GC II Agar with IsoVitaleX Enrichment (gélose GC II avec supplément IsoVitaleX) sert à réaliser des tests de sensibilité 1 de N. gonorrhoeae aux agents antimicrobiens par la méthode de diffusion de disques. 2013-07 Français RESUME ET EXPLICATION En raison du problème grandissant posé par la résistance des gonocoques à la pénicilline et aux autres agents antimicrobiens, le CDC (Centers for Disease Control and Prevention) a publié en 1987 des directives réglementant la détection, la prise en charge et le contrôle des souches de N. gonorrhoeae antibio-résistantes. 1 Le milieu recommandé pour les tests de sensibilité aux agents antimicrobiens par la méthode de diffusion de disques était une base de gélose GC enrichie d un supplément chimiquement défini comme l IsoVitaleX Enrichment. Le CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) recommande également l emploi de la gélose GC avec un supplément chimiquement défini (équivalent à l IsoVitaleX Enrichment) pour réaliser les tests de sensibilité de N. gonorrhoeae aux agents antimicrobiens par la méthode de diffusion de disques. 2,3 PRINCIPES DE LA METHODE La GC II Agar Base contient des nutriments sous la forme de caséine et de peptones de viande, un tampon phosphate pour maintenir le ph et de la fécule de maïs, qui neutralise les acides gras toxiques pouvant être présents dans la gélose. L IsoVitaleX Enrichment est un supplément chimiquement défini, qui apporte le facteur V (nicotinamide-adéninedinucléotide ou NAD), les vitamines, les acides aminés, les co-enzymes, le dextrose, l ion ferrique et d autres facteurs qui favorisent la croissance des Neisseria pathogènes. REACTIFS GC II Agar with IsoVitaleX Enrichment Formule approximative* par litre d eau purifiée Digestion pancréatique de caséine... 7,5 g Bouillon peptoné sélectionné... 7,5 g Fécule de maïs... 1,0 g Phosphate bipotassique... 4,0 g Phosphate monopotassique... 1,0 g Chlorure de sodium... 5,0 g Gélose... 12,0 g Enrichissement IsoVitaleX... 10,0 ml * Ajustée et/ou complémentée en fonction des critères de performances imposés. Enrichissement IsoVitaleX Formule approximative* par litre d eau purifiée Vitamine B 12... 0,01 g L-glutamine... 10,0 g Adénine... 1,0 g Chlorhydrate de guanine... 0,03 g Acide p-aminobenzoïque... 0,013 g Nicotinamide-adénine-dinucléotide... 0,25 g Pyrophosphate de thiamine... 0,1 g Nitrate ferrique... 0,02 g Chlorhydrate de thiamine... 0,003 g Chlorhydrate de L-cystéine... 25,9 g L-cystine... 1,1 g Dextrose... 100,0 g * Ajustée et/ou complémentée en fonction des critères de performances imposés. Avertissements et précautions Réservé au diagnostic in vitro. En présence d une condensation excessive, poser de biais un rebord du fond sur un rebord du couvercle retourné pour sécher la condensation afin d empêcher la formation d un joint entre la partie supérieure et la partie inférieure de la boîte pendant l incubation. 1
Respecter les techniques d asepsie et prendre les précautions en vigueur contre les dangers microbiologiques. Après utilisation, stériliser à l autoclave les boîtes préparées, les récipients ayant contenu des échantillons et le matériel contaminé avant de les éliminer. Instructions pour la conservation : Dès réception, conserver les boîtes dans l obscurité, à une température comprise entre 2 et 8 C. Ne pas les congeler ni les surchauffer. Ne pas ouvrir prématurément. Maintenir à l abri de la lumière. Conservées dans leur emballage d origine, à une température comprise entre 2 et 8 C, jusqu au moment de l utilisation, les boîtes préparées peuvent être ensemencées jusqu à la date de péremption et incubées pendant les durées d incubation recommandées. Laisser le milieu s équilibrer jusqu à température ambiante avant de l ensemencer. Détérioration du produit : Ne pas utiliser les boîtes si elles présentent des signes de contamination microbienne, décoloration ou dessiccation, ou d autres signes de détérioration. PRELEVEMENT ET PREPARATION DES ECHANTILLONS Ce milieu n est pas conçu pour être ensemencé directement avec des échantillons cliniques ou des cultures mixtes. L antibiogramme par la méthode de diffusion de disques nécessite des cultures pures. Une coloration de Gram et une identification présomptive de N. gonorrhoeae sont indispensables. METHODE Matériaux fournis : GC II Agar with IsoVitaleX Enrichment Matériaux requis mais non fournis : 1. Un bouillon d ensemencement en tube de 5 ml, comme le bouillon Mueller Hinton (tube de 20 x 112 mm) ou le bouillon Mueller Hinton II (tube de 16 x 102 mm) pour la préparation d un inoculum standard. 2. Un standard au sulfate de baryum McFarland 0,5 pour l ajustement de l inoculum (préparé en ajoutant 0,5 ml de BaCl 2 0,048 M [1,175 % m/v BaCl 2 2 H 2 O ] à 99,5 ml de H 2 SO 4 [1 % v/v] 0,18 M [0,36 N]). 3. Dispositif photométrique pour comparer la turbidité du standard au sulfate de baryum à celle de la suspension d inoculum. 4. Culture de contrôle Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226. 5. Des disques de papier imprégnés de quantités connues d agents antimicrobiens, comme les disques de test de sensibilité BBL Sensi-Disc. 6. Un dispositif de distribution de disques, comme le distributeur auto-applicateur Sensi-Disc de 12 disques. 7. Dispositif de mesure ou d interprétation du diamètre des zones, comme le calibre d interprétation Sensi-Disc. 8. Réactif ou appareil permettant d effectuer un test rapide des β-lactamases, comme les disques BBL Cefinase Discs. 9. Un incubateur produisant une atmosphère contenant 5 à 7 % de CO 2, ou un autre dispositif produisant une atmosphère aérobie enrichie en CO 2. 10. Milieux de culture auxiliaires, réactifs et matériel de laboratoire requis. Mode opératoire du test Utiliser la méthode de suspension directe des colonies pour tester des souches de N. gonorrhoeae. Respecter les techniques d asepsie. La surface de la gélose doit être lisse et humide, mais sans excès d humidité. 1. Préparer une coloration de Gram et effectuer un test de l oxydase avant de lancer le test de sensibilité pour vérifier la pureté de la culture et confirmer l identification présomptive de N. gonorrhoeae. 2. Utiliser plusieurs colonies bien isolées, prélevées directement sur une boîte de gélose au chocolat de la veille comme source d inoculum. 3. Effectuer un test rapide des β-lactamases (disque Cefinase) pour évaluer l utilité clinique de la pénicilline. Ce test rapide fournit au clinicien des informations pertinentes concernant la sensibilité aux agents antimicrobiens avant le test de diffusion de disques. 4. Utiliser des colonies prélevées directement sur une boîte de gélose au chocolat de la veille pour préparer des suspensions du microorganisme à tester en bouillon de Mueller Hinton, bouillon de Mueller Hinton II ou sérum physiologique à 0,9 % et les diluer avec du bouillon ou du sérum physiologique pour obtenir une turbidité équivalente à un standard McFarland 0,5 (voir la rubrique «Matériaux requis mais non fournis»). Cette suspension contiendra approximativement de 1 à 2 x 10 8 UFC/mL. Procéder avec soin lors de la préparation de cette suspension car une concentration d inoculum plus élevée peut conduire à un résultat erroné de résistance, ou avec un inoculum trop peu concentré, à un résultat erroné de sensibilité. Réaliser périodiquement une dilution et une énumération sur boîte de Pétri des suspensions d inoculum pour s assurer qu elles contiennent environ 1 à 2 x 10 8 UFC/mL. 5. Dans les 15 min qui suivent l ajustement de la turbidité de l inoculum, tremper un écouvillon stérile dans l inoculum dilué et le faire tourner plusieurs fois en le pressant fermement contre la paroi interne du haut du tube pour en exprimer l excès de bouillon. 6. Ensemencer à trois reprises la totalité de la surface de la gélose, en faisant pivoter la boîte de 60 à chaque fois de façon à assurer un ensemencement uniforme. 7. Replacer le couvercle et laisser la boîte à température ambiante pendant 3 à 5 min, sans dépasser 15 min, pour que toute humidité présente en surface soit résorbée avant la pose des disques imprégnés d antibiotiques. 2
8. Déposer les disques avec un distributeur de disques antimicrobiens en respectant les précautions d asepsie habituelles. La plupart des agents antimicrobiens créent des zones d inhibition plus étendues avec N. gonorrhoeae comparativement à d autres microorganismes, ce qui limite dans certains cas le nombre de disques à 9 par boîte de 150 mm. Après avoir placé les disques sur la gélose, les plaquer avec une aiguille stérile ou une pince pour assurer un contact étroit avec la surface du milieu. Cette étape n est pas nécessaire si les disques sont déposés avec le distributeur auto-applicateur Sensi-Disc de 12 disques (les dispositifs servant à plaquer les disques ne fonctionnent pas en l absence de cartouche). 9. Dans les 15 min suivant l application des disques, retourner et incuber les boîtes de 20 à 24 h à 35 C en atmosphère aérobie enrichie de 5 à 7 % de dioxyde de carbone. Contrôle de qualité par l utilisateur : 1. S assurer que les boîtes ne présentent aucun signe de détérioration, comme indiqué à la rubrique «Détérioration du produit». 2. Inclure la culture témoin Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226 à chaque test de sensibilité. Les limites de contrôle des zones d inhibition sont récapitulées dans le tableau 1 et attestent le respect de la méthode. TABLEAU 1. Limites de contrôle de N. gonorrhoeae* N. gonorrhoeae Agent antimicrobien Contenu du disque ATCC 49226 Céfépime 30 µg 37-46 Céfiximine 5 µg 37-45 Céfotaxime 30 µg 38-48 Céfotétan 30 µg 30-36 Céfoxitine 30 µg 33-41 Cefpodoxime 10 µg 35-43 Ceftazidime 30 µg 35-43 Ceftizoxime 30 µg 42-51 Ceftriaxone 30 µg 39-51 Céfuroxime 30 µg 33-41 Ciprofloxacine 5 µg 48-58 Enoxacine 10 µg 43-51 Gatifloxacine 5 µg 45-56 Lomefloxacine 10 µg 45-54 Ofloxacine 5 µg 43-51 Pénicilline 10 unités 26-34 Spectinomycine 100 µg 23-29 Trovafloxacine 10 µg 42-55 * Extrait du document M100 du CLSI, Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Tests; Approved standard. Reproduit avec autorisation. Effectuer les contrôles de qualité conformément aux réglementations nationales et/ou internationales, aux exigences des organismes d homologation concernés et aux procédures de contrôle de qualité en vigueur dans l établissement. Il est recommandé à l utilisateur de consulter les directives CLSI et la réglementation CLIA concernées pour plus d informations sur les modalités de contrôle de qualité. RESULTATS 1. Examiner les boîtes après 20 à 24 h d incubation. Un «tapis» de croissance agglomérée doit être obtenu. Si seules des colonies isolées se développent, l inoculum était trop faible et il faut répéter le test. 2. A l aide d un compas, d une règle ou d un calibre spécialement conçu, mesurer le diamètre de la zone d inhibition complète (appréciée à l œil nu) arrondi au millimètre le plus proche, en y incluant le diamètre du disque. Placer le dispositif de mesure au dos de la boîte de Pétri, préalablement retournée sur un fond noir mat sous éclairage zénithal. Le point de transition doit être situé au niveau de la région ne montrant aucune croissance visible à l œil nu. Ne pas tenir compte des colonies minuscules pouvant être détectées avec difficulté près du bord de la zone d inhibition manifeste. 3. Consulter le tableau des critères d interprétation du diamètre des zones (tableau M2) pour interpréter les résultats obtenus avec des isolats cliniques de N. gonorrhoeae. Les résultats peuvent être rapportés comme «résistant», «intermédiaire» ou «sensible» en fonction du diamètre des zones d inhibition observées. Les microorganismes testés positifs pour la production de β-lactamases doivent être considérés comme résistants à la pénicilline quels que soient les diamètres de zone obtenus. 3
TABLEAU 2. Critères d interprétation du diamètre des zones pour N. gonorrhoeae* Diamètre de la zone (arrondi au mm le plus proche) Agent antimicrobien Contenu du disque Résistant Intermédiaire c Sensible Céfipime a 30 µg 31 Céfixime a 5 µg 31 Céfotaxime a 30 µg 31 Céfotétan 30 µg 19 20-25 26 Céfoxitine 30 µg 23 24-27 28 Cefpodoxime a 10 µg 29 Ceftazidime a 30 µg 31 Ceftizoxime a 30 µg 38 Ceftriaxone a 30 µg 35 Céfuroxime 30 µg 25 26-30 31 Ciprofloxacine 5 µg 27 28-40 41 Enoxacine 10 µg 31 32-35 36 Gatifloxacine 5 µg 33 34-37 38 Lomefloxacine 10 µg 26 27-37 38 Ofloxacine 5 µg 24 25-30 31 Pénicilline b 10 unités 26 27-46 47 Spectinomycine 100 µg 14 15-17 18 Trovafloxacine a 10 µg 34 * Extrait du document M100 du CLSI, Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Tests; Approved standard. Reproduit avec autorisation. a Pour ces agents antimicrobiens, l absence de souches résistantes empêche de définir des classes autres que «sensible». Les souches dont les résultats évoquent une «non-sensibilité» doivent être transmises à un laboratoire de référence pour des examens complémentaires. b Les gonocoques produisant des diamètres de zone 19 mm avec des disques de 10 unités de pénicilline sont probablement des souches productrices de β-lactamases. Toutefois, le test des β-lactamases demeure préférable aux autres méthodes de test de sensibilité pour une identification rapide et exacte de la résistance à la pénicilline à médiation plasmidique. c L obtention d un résultat intermédiaire avec un agent antimicrobien indique, soit un problème technique que la répétition du test doit résoudre, soit un manque d expérience clinique dans le traitement des microorganismes donnant de tels résultats. La dernière hypothèse semble se vérifier pour le céfotétan, la céfoxitine et la spectinomycine (voir M2). Les souches présentant des zones intermédiaires avec les autres agents antimicrobiens ont un taux de guérison clinique documenté inférieur (85 à 95 %) à celui des souches sensibles (> 95 %). LIMITES DE LA PROCEDURE L aptitude à détecter une résistance des Neisseria gonorrhoeae au céfixime, au céfotaxime, au céfotétan, à la céfoxitine, au cefpodoxime, à la ceftazidime, au ceftizoxime, à la ceftriaxone, au céfuroxime, à la ciprofloxacine, à l énoxacine, à la loméfloxacine et à l ofloxacine est indéterminée car aucune souche résistante n était connue au moment du test. Les contours de la zone d inhibition sont parfois mal définis pour certaines associations d agents antimicrobiens et de microorganismes, ce qui peut conduire à une interprétation erronée. Ce milieu est contre-indiqué pour les tests de sensibilité au cefmétazole et à la tétracycline en raison de résultats non reproductibles pour le cefmétazole et d un nombre d erreurs mineures supérieur à 10 avec la tétracycline. Une concentration d inoculum incorrecte peut entraîner des résultats erronés. Les zones d inhibition risquent d être trop petites si l inoculum est trop concentré ou trop grandes et difficiles à mesurer s il ne l est pas assez. Une conservation inappropriée des disques antimicrobiens peut entraîner une perte d activité et un résultat erroné de résistance. La sensibilité in vitro d un microorganisme vis-à-vis d un agent antimicrobien spécifique ne veut pas forcément dire que l agent sera efficace in vivo. Consulter les publications citées en référence pour plus d informations sur l interprétation des résultats. 4,5 4
CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCES Les caractéristiques de performances de tous les lots de GC II Agar with IsoVitaleX Enrichment sont testées en usine. Des échantillons représentatifs du lot à tester sont ensemencés avec des suspensions de Neisseria gonorrhoeae ATCC 43069 diluées dans du sérum physiologique à une concentration finale de 10 3 à 10 4 UFC par boîte. Les échantillons sont également testés avec Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226 en ensemençant à l écouvillon la surface du milieu avec une suspension de turbidité équivalente à un standard McFarland 0,5. Des disques contenant des quantités connues d agents antimicrobiens sont ajoutés. Les boîtes sont incubées à une température de 35 à 37 C en atmosphère aérobie enrichie en CO 2. Une croissance modérée à importante est observée pour N. gonorrhoeae ATCC 43069. Les zones d inhibition observées autour des disques ont le diamètre attendu pour N. gonorrhoeae ATCC 49226. CONDITIONNEMENT N o réf. Description 221240 BBL GC II Agar with IsoVitaleX Enrichment, coffret de 100 boîtes de taille 8 (150 x 15 mm) REFERENCES 1. Centers for Disease Control. 1987. Antibiotic-resistant strains of Neisseria gonorrhoeae: policy guidelines for detection, management, and control. Morbid. Mortal. Weekly Rep. 36(Suppl.):1S-18S. 2. Clinical and Laboratory Standards Institute. Approved standard: M2. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. CLSI, Wayne, Pa. Consult latest version. 3. Clinical and Laboratory Standards Institute. Disk Diffusion Supplemental Tables: M100. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. CLSI, Wayne, Pa. Consult latest version. 4. Neumann, M.A., D.F. Sahm, C. Thornsberry, J.E. McGowan, Jr. 1991. Cumitech 6A, New developments in antimicrobial agent susceptibility testing: a practical guide. Coordinating ed., J.E. McGowan, Jr. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 5. Jorgensen, J.H. and J.D. Turnidge. 2003. Susceptibility test methods: dilution and disk diffusion methods, p. 1108-1127. In Murray, P.R., E.J. Baron, J.H. Jorgensen, M.A. Pfaller and R.H. Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 5
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