Carbaplex IVD PCR Kit

1849975 Instructions d utilisation Carbaplex IVD PCR Kit Pour une identification des gènes de carbapénèmases directement à partir d un prélèvement rectal ou à partir de colonies Les produits CARE ont été conçus pour fournir à nos clients dans le monde entier, des consommables, des accessoires et des kits dédiés de haute qualité. www.bruker.com/care Langue: fr Révision B (Mai 2017)

1 Utilisation prévue 3 2 Description du produit 3 2.1 Composants du kit 5 3 Inspection, conservation et stabilité 6 3.1 Inspection dès réception 6 3.2 Température de stockage 6 3.3 Lieu de stockage adapté 6 3.4 Stabilité 6 4 Informations relatives aux risques et à la sécurité 7 4.1 Précautions d ordre général 7 4.2 Risques biologiques 8 4.3 Limitations de la procédure 8 5 Matériel requis mais non fourni 9 5.1 Équipement général 9 5.2 Équipement pour l échantillonnage 9 5.3 Instrumentation de PCR en temps réel 10 6 Collecte d échantillons et extraction d ADN 11 6.1 Protocoles d extraction recommandés (plateformes commerciales) 11 6.2 Protocoles d extraction recommandés (à n utiliser qu avec des bactéries mises en culture) 12 7 Procédure du test 13 7.1 Configuration de la PCR 13 8 États du thermocycleur 16 8.1 ABI 7500 16 8.2 Rotor-Gene Q 18 8.3 CFX96 20 8.4 QuantStudio 5 22 9 Interprétation des résultats 23 9.1 Témoin interne 23 9.2 Témoins positifs et négatifs 23 9.3 Échantillons de patients / d origine inconnue 23 10 Caractéristiques de performance 25 11 Élimination 26 12 Explication des symboles 27 13 Fabricant 28 Page 2 sur 28 Carbaplex IVD PCR Kit Instructions d utilisation Révision B

1 Utilisation prévue Le Dosage de PCR en temps réel Carbaplex est un test de diagnostic in vitro (IVD) utilisant la technique de réaction de polymérisation en chaîne (PCR) multiplex et permettant la détection qualitative des cinq familles les plus répandues de gènes de carbapénèmases. Le dosage détecte et identifie les cibles génétiques de KPC, de NDM, de VIM, d IMP et de type OXA-48, en détectant l acide nucléique extrait directement à partir de prélèvements d échantillons rectaux et de cultures bactériennes. Le dosage est prévu pour être utilisé par un personnel de laboratoire qualifié et comme outil d aide à l identification des entérobactéries productrices de carbapénèmases (CPE) qui sont susceptibles de coloniser des patients dans les milieux hospitaliers. Des cultures parallèles sont nécessaires pour récupérer des organismes dans un but de typage épidémiologique, de tests de sensibilité et d identification ultérieure confirmative. 2 Description du produit Résistance aux carbapénèmes Les bactéries multi-résistantes représentent une menace transnationale pour la santé publique. Les infections causées par ces organismes sont associées à une mortalité élevée chez les patients recevant des soins intensifs prolongés. Les entérobactériacées productrices de carbapénèmases sont particulièrement préoccupantes : elles représentent un risque accru de santé publique en raison de leur transmissibilité facile et rapide entre les patients et leur environnement. Ces organismes sont résistants aux antibiotiques carbapénèmes, souvent envisagés en «dernier recours» dans le traitement d un certain nombre d infections bactériennes. Les familles de gènes de carbapénèmases les plus répandues en Europe sont : la carbapénèmases de type Klebsiella pneumoniae (KPC), la New Delhi metallo- bêta- lactamase (NDM), la Verona Integron encoded Metallo- bêta- lactamase (VIM), l imipénémase ou métallo β- lactamase de type IMP (IMP) et les oxacillinases hydrolysant les carbapénèmes de type OXA-48 1. Les CPE limitent les options thérapeutiques efficaces, ce qui entraîne une hausse de la morbidité et de la mortalité associées 2,3. Elles se transmettent facilement par les personnes colonisées en milieu hospitalier. Certaines catégories de CPE sont déjà considérées comme endémiques dans certains pays. En conséquence, une détection fiable et rapide de ces organismes est vitale pour assurer la mise en place en temps voulu des précautions à prendre en cas de contact avec le patient et si besoin, orienter les protocoles d isolement et le choix du traitement lorsque l infection est déclarée 4. Dosage de PCR en temps réel Carbaplex Le Dosage de PCR en temps réel Carbaplex fournit un test de diagnostic basé sur la PCR pour les familles de gènes de carbapénèmases les plus répandues. Le dosage est conçu pour être utilisé sur divers équipements de PCR que l on trouve communément en laboratoire et peut traiter jusqu à 96 échantillons de l étape suivant l extraction aux résultats en moins de 3 heures. Le dosage détecte et identifie les cibles de type KPC, NDM, VIM, IMP et OXA-48, en détectant l acide nucléique extrait directement à partir d échantillons prélevés à l aide d un écouvillon anal ou de cultures bactériennes. Les variantes génétiques connues détectées par ce dosage sont détaillées dans le Tableau 1. La détection rapide et fiable proposée par ce test rend possible une identification précoce, facilitant une gestion appropriée des patients colonisés tout en permettant la mise en place rapide des mesures de contrôle et de prévention des infections. Révision B Carbaplex IVD PCR Kit Instructions d utilisation Page 3 sur 28

Tableau 1 Gènes et variantes de carbapénèmases identifiés en utilisant le Dosage de PCR en temps réel Carbaplex Famille des carbapénèmases KPC NDM VIM IMP OXA-48 Variantes KPC-1-19, KPC-21, KPC-22, KPC-24 NDM-1-16 VIM-1-6, VIM-8-45 IMP-1, IMP-3, IMP-6, IMP-10, IMP-25, IMP-30, IMP-34, IMP-40, IMP-42, IMP-52 OXA- 48, OXA- 162, OXA- 163, OXA- 181, OXA- 199, OXA- 204, OXA-232, OXA-244, OXA-245, OXA-247, OXA-370, OXA- 405, OXA-416, OXA-438, OXA-439, OXA-484 Références 1. Centre européen de prévention et de contrôle des maladies. Carbapenemase-producing bacteria in Europe: interim results from the European Survey on carbapenemase- producing Enterobacteriaceae (EuSCAPE) project. Stockholm: CEPCM; 2013 2. M. E. Falagas et al., Emerg. Infect. Dis., 2014, 20, 1170 1175 3. D. Ben-David et al., Clin. Microbial. Infect., 2012, 18, 54-60 4. Centre européen de prévention et de contrôle des maladies. Evidence brief: Update on the spread of carbapenemase-producing Enterobacteriaceae in Europe, Stockholm: CEPCM; 2015 Page 4 sur 28 Carbaplex IVD PCR Kit Instructions d utilisation Révision B

2.1 Composants du kit La quantité de réactifs fournie permet l exécution de 100 tests. Carbaplex PCR Kit Réactif Volume par tube Nombre de tubes Couleur du bouchon PCR MM Carbaplex 1,5 ml 2 Orange 100 Carbaplex MM 1 150 µl 1 Violet 100 Carbaplex MM 2 150 µl 1 Jaune 100 Eau pour PCR 800 µl 1 Blanc 200 Réactions par tube Kit témoin Carbaplex Control Kit Réactif Volume par tube Nombre de tubes Couleur du bouchon Témoin interne 135 µl 3 Rouge Témoin positif Carbaplex 240 µl 3 Bleu Témoin négatif 240 µl 3 Blanc Informations concernant les commandes Produit Référence Carbaplex IVD PCR Kit 1849975 Révision B Carbaplex IVD PCR Kit Instructions d utilisation Page 5 sur 28

3 Inspection, conservation et stabilité 3.1 Inspection dès réception Vérifiez le Carbaplex IVD PCR Kit dès réception. Si l emballage est endommagé, le kit ne doit pas être utilisé. En outre, tous les réactifs inclus dans le Carbaplex IVD PCR Kit sont expédiés congelés et doivent arriver congelés. Si les réactifs sont décongelés à la réception ou si les tubes ont été abîmés lors du transport, veuillez contacter Bruker Daltonik GmbH pour obtenir de l aide. 3.2 Température de stockage -25 C -15 C Le Carbaplex IVD PCR Kit est expédié dans de la neige carbonique et doit être stocké dès réception à une température comprise dans la gamme de températures conseillée. 3.3 Lieu de stockage adapté Le coffret de réactifs internes intitulé «Carbaplex PCR Kit» doit être stocké dans un laboratoire exempt d amplicon. Le coffret de réactifs internet intitulé «Kit témoin Carbaplex Control Kit» qui comprend un témoin interne ainsi que des témoins de dosage positifs et négatifs doit être stocké à l endroit où le modèle d ADN / modèle d échantillon est ajouté. 3.4 Stabilité Il a été démontré que les performances du Dosage de PCR en temps réel Carbaplex ne sont pas amoindries lorsqu il est utilisé sur 10 cycles de congélation-décongélation. Tous les réactifs contenus dans le Carbaplex IVD PCR Kit sont homologués pour une utilisation dans un délai limité par la date de péremption indiquée sur l étiquette du kit, ce délai ne devant pas être dépassé. Page 6 sur 28 Carbaplex IVD PCR Kit Instructions d utilisation Révision B

4 Informations relatives aux risques et à la sécurité Aucune substance dangereuse n a été utilisée lors de la fabrication du Carbaplex IVD PCR Kit. La composition de tous les réactifs du kit ne présente aucun risque particulier pour l utilisateur ou son matériel. D autres produits et matériaux chimiques peuvent être nécessaires à l exécution des procédures décrites dans ces Instructions d utilisation. Lisez attentivement les avertissements, instructions ou fiches de données de sécurité du produit fournis par le fournisseur et suivez les règles de sécurité relatives à la manipulation de produits chimiques, risques biologiques ou autres matériaux. 4.1 Précautions d ordre général Ce Dosage de PCR en temps réel Carbaplex est destiné à des fins de diagnostic in vitro. Ce test ne doit être utilisé qu avec des plateformes de PCR sur lesquelles le processus a été validé. Les résultats générés à partir du Dosage de PCR en temps réel Carbaplex doivent être interprétés par un professionnel qualifié et mis en parallèle avec d autres tests de diagnostic ainsi qu avec la présentation clinique correspondante. La procédure d application du test doit respecter les instructions contenues dans ce Instructions d utilisation. Toute divergence par rapport aux protocoles indiqués risque d entraîner une erreur de dosage et de générer des résultats erronés. Ce test est conçu pour être utilisé avec de l ADN extrait à partir de prélèvements rectaux ainsi que de bactéries mises en culture issues d autres échantillons cliniques. La manipulation de l ensemble des échantillons doit se faire conformément aux précautions d usage et aux recommandations de l établissement. L ADN en faible concentration peut devenir instable lorsqu il est stocké sur une période prolongée. Bruker recommande une durée de stockage des échantillons réduite au minimum avant de procéder aux tests. N utilisez pas les réactifs après la date de péremption indiquée. Ne mélangez pas les réactifs issus de tubes ou de kits différents, même s ils proviennent du même lot. Ne remplacez pas les réactifs avec ceux d un autre fabricant. Veuillez à ce que les kits de réactifs restent purs. Évitez toute contamination par les témoins et les échantillons positifs en respectant les bonnes pratiques de laboratoire et isolant judicieusement les flux de travail. Veillez à ce que tous les consommables complémentaires requis soient exempts d ADNase/ARNase. Portez des vêtements de protection et des gants jetables lors de la manipulation des réactifs d un kit. N utilisez pas les réactifs d un kit si le sceau d étanchéité est déjà brisé dès réception de la livraison du kit. Ne mangez pas, ne buvez pas et ne fumez pas dans les zones où l on manipule les échantillons et les réactifs d un kit. Éliminez les réactifs non utilisés et les déchets conformément à la réglementation nationale, régionale ou locale en vigueur. Révision B Carbaplex IVD PCR Kit Instructions d utilisation Page 7 sur 28

4.2 Risques biologiques Le Dosage de PCR en temps réel Carbaplex implique de travailler avec du matériel biologique potentiellement dangereux et pouvant présenter un risque de transmission. Il incombe au personnel utilisant ces systèmes de lire toutes les précautions d hygiène et de sécurité nécessaires et de les respecter. Il est impératif de porter en permanence un équipement individuel de protection qui doit inclure au minimum une blouse, des gants de protection et des lunettes de sécurité. 4.3 Limitations de la procédure D autres gènes de carbapénèmases non énumérés dans le Tableau 1 sont susceptibles d être responsables de la production de carbapénèmases dans les entérobactériacées et ne seront pas détectés par le Dosage de PCR en temps réel Carbaplex. Un résultat négatif obtenu par le Dosage de PCR en temps réel Carbaplex n implique pas que la bactérie soit résistante aux carbapénèmes. La résistance aux carbapénèmes peut être due à divers autres mécanismes non détectés par ce dosage. En conséquence, le résultat du test du Dosage de PCR en temps réel Carbaplex ne doit pas être utilisé comme élément principal pour déterminer un traitement. Le rendement de l extraction peut avoir une influence sur les résultats et pourrait engendrer des résultats faussement négatifs. Des données préliminaires indiquent que la stabilité de l ADN extrait peut être influencée par la congélation et le stockage de longue durée. Il est donc recommandé que les échantillons soient traités dans les meilleurs délais suivant le prélèvement. Des résultats faussement positifs peuvent résulter d une contamination externe de l échantillon d origine ou d une contamination au cours de la configuration de la PCR. Ce dosage est un test qualitatif et ne fournit aucune donnée quantitative sur l un quelconque des organismes détectés. Page 8 sur 28 Carbaplex IVD PCR Kit Instructions d utilisation Révision B

5 Matériel requis mais non fourni 5.1 Équipement général Équipement Réactifs Plateforme recommandée pour l extraction des acides nucléiques Thermocycleur en temps réel homologué Hotte de classe II / station de travail pour PCR Agitateur à vortex Mini centrifugeuse Centrifugeuse pouvant prendre en charge des microplaques (recommandé) Réfrigérateur (2 8 C) et congélateur (entre -25 C et -15 C) Micropipettes pour des volumes compris entre 1 et 1 000 µl Réactifs d extraction Témoin positif d extraction (recommandé, par ex. échantillons préalablement identifiés comme étant positifs) Témoin négatif d extraction (recommandé, par ex. eau exempte de nucléases) Consommables Matériel en plastique exempt de ADNase/ARNase adapté aux préparatifs de la PCR Embouts de pipette exempts d ADNase/ARNase Gants jetables, non poudrés Matériel en plastique pour PCR compatible avec le thermocycleur choisi 5.2 Équipement pour l échantillonnage Écouvillons rectaux Écouvillons pour le prélèvement d échantillons, par ex. Eswab (Copan Diagnostics) ou Sigmatranswabs (Medical Wire and Equipment) dans un milieu de transport liquide Amies Cultures bactériennes Eau de qualité PCR Tubes Eppendorf Densitomètre ou normes McFarland pour la mesure des suspensions bactériennes Centrifugeuse pour microtubes de 1,5 ml Bloc chauffant pour microtubes de 1,5 ml Agitateur à vortex Révision B Carbaplex IVD PCR Kit Instructions d utilisation Page 9 sur 28

5.3 Instrumentation de PCR en temps réel L utilisation du Dosage de PCR en temps réel Carbaplex a été validée sur plusieurs instruments de PCR en temps réel. Les instruments homologués et la liste des consommables utilisés pour les études de vérification et de validation sont indiqués dans le Tableau 2 ci-après. Tableau 2 Détails spécifiques à l instrumentation de PCR en temps réel Fabricant d instrumentation de PCR en temps réel Modèle de plateforme de PCR en temps réel Applied Biosystems ABI 7500 Fast 2.3 Bio-Rad CFX96 3.1 Qiagen Rotor-Gene Q 5plex HRM Applied Biosystems QuantStudio 5 1.3.1 Version logicielle de l instrument de PCR en temps réel Q-Rex 1.0.0 (y compris le module de détection de cibles Target Detection) Consommables homologués MicroAmp Fast Optical 96-Well MicroAmp Optical 8-Cap Strips MicroAmp Fast Optical 96-Well MicroAmp Optical 8-Cap Strips Barrette de tubes Qiagen et bouchons, 0,1 ml MicroAmp Fast Optical 96-Well MicroAmp Optical 8-Cap Strips Page 10 sur 28 Carbaplex IVD PCR Kit Instructions d utilisation Révision B

6 Collecte d échantillons et extraction d ADN La qualité de l ADN extrait est intrinsèquement liée à la sensibilité obtenue par les dosages de PCR en temps réel. Les échantillons doivent en conséquence être recueillis et stockés de manière appropriée en respectant les recommandations formulées ci-après. Les échantillons doivent être recueillis et manipulés conformément aux recommandations locales. L ADN doit être extrait des prélèvements rectaux en utilisant une plateforme et une procédure d extraction de l acide nucléique homologuées. L ADN peut être extrait de bactéries mises en culture grâce à un protocole d extraction par lysat bouilli décrit dans la section 6.2. Les bonnes pratiques de laboratoire recommandent l inclusion de témoins d extraction (au moins un positif et un négatif) par analyse. Les échantillons extraits doivent être conservés entre -80 C et -20 C lorsque la durée de stockage est prolongée. Remarque : L ADN en faible concentration peut devenir instable lorsqu il est stocké sur une période prolongée. 6.1 Protocoles d extraction recommandés (plateformes commerciales) Les protocoles utilisés sur les plateformes d extraction disponibles dans le commerce sont fournis pour être utilisés directement sur les prélèvements mais sont également adaptés aux échantillons de bactéries mises en culture. Les plateformes et paramètres associés sont fournis dans le Tableau 3. Tableau 3 Protocoles d extraction effectués sur des plateformes d extraction commerciales Plateforme d extraction Qiagen EZ1 Qiagen QIAsymphony Protocole de prélèvement Introduisez le prélèvement dans 1 ml de milieu de transport Amies et agitez au vortex pendant 30 s avant de l utiliser. Introduisez le prélèvement dans 1 ml de milieu de transport Amies et agitez au vortex pendant 30 s avant de l utiliser. Kit d extraction utilisé DSP Virus kit (1) Kit QIAsymphony DSP Virus / Pathogen Midi kit (2) Qiagen Midi kit Volume de départ pour l extraction 400 µl de milieu de transport Amies inoculé directement dans la plate-forme d extraction. 400 µl de milieu de transport Amies inoculé directement dans la plate-forme d extraction. Volume d élution pour l extraction 60 µl 60 µl Révision B Carbaplex IVD PCR Kit Instructions d utilisation Page 11 sur 28

Plateforme d extraction Protocole de prélèvement Kit d extraction utilisé Volume de départ pour l extraction Volume d élution pour l extraction biomérieux NucliSENS easymag Introduisez le prélèvement dans 2 ml de tampon de lyse NucliSENS easymag lysis buffer, et agitez au vortex pendant 30 s avant de l utiliser. Extraction d acide nucléique total 2 ml de tampon de lyse NucliSENS easymag lysis buffer inoculé directement dans la plate-forme d extraction. 70 µl 6.2 Protocoles d extraction recommandés (à n utiliser qu avec des bactéries mises en culture) Protocole pour extraction d ADN avec lysat bouilli à partir de suspensions de cellules bactériennes Préparez une suspension de cellules bactériennes à partir d un bouillon ajusté à un étalon de 0,5 McFarland (environ 1x10 8 UFC/mL) dans de l eau de qualité PCR. Transférez 200 µl de chaque suspension cellulaire dans des microtubes individuels de 1,5 ml. Faites chauffer les tubes à 98 C pendant 10 minutes. Après incubation, agitez par vortex les tubes pendant 30 secondes. Centrifugez les tubes à vitesse maximale pendant 2 minutes, puis transférez le surnageant dans un nouveau tube. Utilisez ce surnageant pour immédiatement préparer la réaction de PCR ou stockez-le à -80 C pour une conservation de longue durée ou à -20 C s il doit être utilisé dans un délai rapproché. Page 12 sur 28 Carbaplex IVD PCR Kit Instructions d utilisation Révision B

7 Procédure du test 7.1 Configuration de la PCR ATTENTION Bruker recommande l utilisation d une salle propre (suite PCR) pour configurer toutes les réactions de PCR. L ajout des modèles peut se faire à l extérieur de la salle propre. Afin d éviter tout risque de contamination, les utilisateurs doivent en permanence respecter les bonnes pratiques de laboratoire et isoler les flux de travail de manière pertinente. Le matériel en plastique utilisé doit être exempt d ADNase/ARNase. Remarque Le Dosage de PCR en temps réel Carbaplex est un dosage PCR à 2 puits où l amorce et la sonde du mélange réactionnel «mastermix» diffèrent entre les 2 puits, ce qui permet d obtenir des résultats identifiables pour chaque famille de gènes de carbapénèmase. Il est conseillé de doser chaque échantillon avec témoin positif ou négatif avec chaque amorce/sonde «mastermix» dans des puits voisins, par ex. l échantillon 1 sera testé dans les puits réactionnels A1 et B1. Avant de démarrer la configuration de la PCR, il incombe à l utilisateur d assigner les échantillons aux puits appropriés, en utilisant du matériel en plastique approprié. Ces informations doivent être consignées dans un souci de traçabilité. Dans une zone exempte d amplicon, sortez le Carbaplex PCR Kit du congélateur et laissez les réactifs se décongeler. Agitez au vortex et centrifugez brièvement le mélange réactionnel «mastermix» pour PCR fourni, PCR MM Carbaplex, ainsi que chacune des amorces/sondes mastermix fournies, Carbaplex MM 1 et Carbaplex MM 2. Préparez 2 mélanges réactionnels «mastermix» pour PCR ; l un utilisant le Carbaplex MM 1, et l autre le Carbaplex MM 2, avec les réactifs et les volumes indiqués dans le Tableau 4. Les volumes sont indiqués par puits réactionnel et doivent être multipliés par le nombre de puits réactionnels en tenant compte du nombre d échantillons et des témoins positifs et négatifs pour l analyse. Les mélanges réactionnels «mastermix» pour PCR ainsi préparés doivent être rigoureusement mélangés et centrifugés pendant 10 secondes. Tableau 4 Volumes indiqués pour la préparation des mélanges réactionnels «mastermix» pour PCR dans une zone exempte d amplicon Réactifs du kit de dosage Réaction de PCR mastermix 1 Réaction de PCR mastermix 2 PCR MM Carbaplex 12,5 µl 12,5 µl Carbaplex MM 1 1,25 µl - Carbaplex MM 2-1,25 µl Eau pour PCR 0,25 µl 0,25 µl Volume total (par puits) 14 µl 14 µl Exemple : pour 8 échantillons, 1 témoin positif et 1 témoin négatif, le volume final du PCR n 1 sera 10 14 = 140 µl et le volume final du PCR n 2 sera 10 14 = 140 µl. Révision B Carbaplex IVD PCR Kit Instructions d utilisation Page 13 sur 28

Avant de procéder à la distribution dans les puits réactionnels, transférez les mélanges réactionnels «mastermix» pour PCR vers la zone d ajout de modèle/échantillon pour y inclure le témoin interne. Sortez le Kit témoin Carbaplex Control Kit du congélateur et laissez les réactifs se décongeler. Le témoin interne doit être ajouté à chaque mélange réactionnel «mastermix» pour PCR. L ajout du témoin interne se fait à hauteur de 1 µl par puits réactionnel (reportez- vous au Tableau 5). Tableau 5 Volumes finaux des mélanges réactionnels «mastermix» pour PCR avec inclusion d un témoin interne Réactifs de mastermix + témoin interne Réaction de PCR mastermix 1 PCR (issu du Tableau 4) 14 µl 14 µl Témoin interne 1 µl 1 µl Volume total (par puits) 15 µl 15 µl Réaction de PCR mastermix 2 Exemple : pour 10 puits réactionnels (8 échantillons, 1 témoin positif et 1 témoin négatif), 10 µl de témoin interne doit être ajouté à chaque mélange réactionnel «mastermix». Ceci donnera des volumes finaux de mélange réactionnel «mastermix» pour PCR d une valeur de 150 µl pour 10 puits réactionnels. Pour chaque échantillon ou témoin, distribuez 15 µl de chaque mélange réactionnel «mastermix» pour PCR, 1 et 2, dans les puits requis du matériel en plastique approprié. Les échantillons et les témoins doivent être analysés de manière séparée avec le mélange réactionnel «mastermix» pour PCR n 1 et le mélange réactionnel «mastermix» pour PCR n 2. Pour chaque échantillon, ajoutez 10 µl d échantillon extrait dans un puits contenant du mélange réactionnel «mastermix» pour PCR n 1 et dans un autre puits contenant du mélange réactionnel «mastermix» pour PCR n 2 (reportez-vous au Tableau 6) Pour chaque réaction du témoin positif, ajoutez 10 µl de Positive Control Carbaplex à un puits contenant du mélange réactionnel «mastermix» pour PCR n 1 et 10 µl de Positive Control Carbaplex à un puits contenant du mélange réactionnel «mastermix» pour PCR n 2. Au moins une réaction témoin positive doit être incluse avec chaque mastermix afin de connaître les détails concernant l efficacité de la réaction. Pour chaque réaction témoin négative, ajoutez 10 µl de témoin négatif à un puits contenant du mélange réactionnel «mastermix» pour PCR n 1 et à un puits contenant du mélange réactionnel «mastermix» pour PCR n 2. Au moins une réaction témoin négative doit être incluse avec chaque mastermix afin de connaître les détails d une contamination éventuelle. Page 14 sur 28 Carbaplex IVD PCR Kit Instructions d utilisation Révision B

Tableau 6 Volumes distribués de mélange réactionnel «mastermix» 1 et 2 pour PCR par puits réactionnel Composition du puits réactionnel pour PCR Mélange réactionnel «mastermix» pour PCR + témoin interne Réaction de PCR mastermix 1 15 µl 15 µl Modèle d échantillon/témoin 10 µl 10 µl Volume final (par puits) 25 µl 25 µl Réaction de PCR mastermix 2 Le matériel en plastique doit maintenant être fermé de manière hermétique et placé dans un thermocycleur homologué pour procéder à l amplification. Veillez à ce que les échantillons soient brièvement centrifugés avant d être placés dans le thermocycleur. Veuillez consulter le mode d emploi de l appareil pour savoir comment configurer et procéder à une séquence d amplification. L amplification doit être effectuée conformément aux paramètres spécifiques à l appareil, indiqués dans la section 8. Révision B Carbaplex IVD PCR Kit Instructions d utilisation Page 15 sur 28

8 États du thermocycleur 8.1 ABI 7500 Consultez le mode d emploi pour savoir comment faire fonctionner l appareil de PCR en temps réel et procéder à des analyses de données. Il est important de contrôler visuellement les courbes d amplification pour chaque échantillon afin de s assurer que les résultats enregistrés sont bien dus à une amplification réelle et ne correspondent pas au bruit de fond enregistré au-dessus des seuils définis. Sélectionnez le fluorophore approprié à l intérieur de chaque canal et assignez-lui la cible pertinente, comme indiqué dans le Tableau 7. Tableau 7 Canaux de détection utilisés pour détecter la présence des gènes cibles des carbapénèmases en utilisant l ABI 7500 GREEN YELLOW ORANGE RED Canal du colorant rapporteur FAM JOE Texas Red Cy5 Changement d état Aucun Aucun Aucun Aucun Cible détectée avec Carbaplex MM 1 Cible détectée avec Carbaplex MM 2 Configurez l ABI 7500 en utilisant les paramètres suivants : Témoin interne KPC NDM Type OXA-48 Témoin interne IMP VIM N/A Type d expérience : Analyse quantitative Courbe standard Réactifs utilisés : réactifs TaqMan Vitesse de la rampe : Standard Volume réactionnel : 25 µl Colorant de référence passif : Aucun Consultez le Tableau 8 pour les paramètres du profil thermique. Les données doivent être recueillies pour l ensemble des 45 cycles. Tableau 8 Paramètres de PCR pour le Dosage de PCR en temps réel Carbaplex Étape Température ( C) Durée Nombre de cycles Collecte de données Activation 95 15 min 1 Inactif Dénaturation 94 30 s Inactif 45 Annelage / extension 60 60 s Actif Pour analyser les données, assurez-vous que le colorant de référence passif ROX est désactivé. Dans Options, décochez la case de seuil automatique pour chaque cible. Le calcul automatique de la ligne de base doit continuer à se faire. Utilisez les informations fournies dans le Tableau 9 pour définir les seuils de chaque canal de détection dans la fenêtre Analysis settings. Page 16 sur 28 Carbaplex IVD PCR Kit Instructions d utilisation Révision B

Tableau 9 Valeurs seuils de l ABI 7500 pour le Dosage de PCR en temps réel Carbaplex Canal FAM JOE TEXAS RED Cy5 KPC NDM Type OXA-48 Target(s) Témoin interne IMP VIM - Threshold 6 000 20 000 30 000 25 000 Révision B Carbaplex IVD PCR Kit Instructions d utilisation Page 17 sur 28

8.2 Rotor-Gene Q Consultez le mode d emploi pour savoir comment faire fonctionner l appareil de PCR en temps réel et procéder à des analyses de données. Il est important de contrôler visuellement les courbes d amplification pour chaque échantillon afin de s assurer que les résultats enregistrés sont bien dus à une amplification réelle et ne correspondent pas au bruit de fond enregistré au-dessus des seuils définis. Sélectionnez le fluorophore approprié à l intérieur de chaque canal et assignez-lui la cible pertinente, comme indiqué dans le Tableau 10. Tableau 10 Canaux de détection utilisés pour détecter la présence des gènes cibles des carbapénèmases en utilisant le Rotor-Gene Canal du colorant rapporteur GREEN YELLOW ORANGE RED Cible détectée avec Carbaplex MM 1 Cible détectée avec Carbaplex MM 2 Témoin interne KPC NDM Type OXA-48 Témoin interne IMP VIM N/A Configurez le Rotor-Gene Q en utilisant les paramètres suivants : Sélectionnez 72-well rotor Volume réactionnel : 25 µl Effectuez Auto Gain (acquisition automatique) sur tous les puits avant de procéder à la première acquisition Consultez le Tableau 11 pour les paramètres du profil thermique. Les données doivent être recueillies pour l ensemble des 45 cycles. Tableau 11 Paramètres de PCR pour le Dosage de PCR en temps réel Carbaplex Étape Température ( C) Durée Nombre de cycles Collecte de données Activation 95 15 min 1 Inactif Dénaturation 94 30 s Inactif 45 Annelage / extension 60 60 s Actif Pour analyser les données à l aide de l option de détection des cibles, utilisez les paramètres suivants : Filtrage des données : Sélectionnez remove non- amplified curves with et saisissez le pourcentage de fluorescent change (modification de fluorescence) pour chaque canal comme indiqué dans le Tableau 12 Normalisation : sélectionnez Dynamic Tube et Use Noise Slope Correction Calcul du Cq : Utilisez 5 comme valeur seuil du cycle de départ et saisissez le seuil pour chaque canal comme indiqué dans le Tableau 12 Compensation de la diaphonie : Dans Settings, ajoutez les compensations Orange bleeding into Red et Yellow bleeding into Green, cliquez sur OK puis cochez la case Compensate crosstalk Page 18 sur 28 Carbaplex IVD PCR Kit Instructions d utilisation Révision B

Tableau 12 Valeurs seuils du Rotor-Gene Q pour le Dosage de PCR en temps réel Carbaplex Canal GREEN YELLOW ORANGE RED Target(s) Témoin interne KPC NDM Type OXA-48 IMP VIM - Threshold 0,02 0,03 0,02 0,03 Fluorescent change 0 % 2 % 2 % 5 % Révision B Carbaplex IVD PCR Kit Instructions d utilisation Page 19 sur 28

8.3 CFX96 Consultez le mode d emploi pour savoir comment faire fonctionner l appareil de PCR en temps réel et procéder à des analyses de données. Il est important de contrôler visuellement les courbes d amplification pour chaque échantillon afin de s assurer que les résultats enregistrés sont bien dus à une amplification réelle et ne correspondent pas au bruit de fond enregistré au-dessus des seuils définis. Sélectionnez le fluorophore approprié à l intérieur de chaque canal et assignez-lui la cible pertinente, comme indiqué dans le Tableau 13. Tableau 13 Canaux de détection utilisés pour détecter la présence des gènes cibles des carbapénèmases en utilisant le CFX96 GREEN YELLOW ORANGE RED Canal du colorant rapporteur FAM VIC Texas Red Cy5 Cible détectée avec Carbaplex MM 1 Cible détectée avec Carbaplex MM 2 Configurez le CFX96 en utilisant les paramètres suivants : Volume d échantillon : 25 µl Mode de balayage : tous les canaux Type de plaque : BR transparente Témoin interne KPC NDM Type OXA-48 Témoin interne IMP VIM N/A Consultez le Tableau 14 pour les paramètres du profil thermique. Les données doivent être recueillies pour l ensemble des 45 cycles. Tableau 14 Paramètres de PCR pour le Dosage de PCR en temps réel Carbaplex Étape Température ( C) Durée Nombre de cycles Collecte de données Activation 95 15 min 1 Inactif Dénaturation 94 30 s Inactif 45 Annelage / extension 60 60 s Actif Pour analyser les données, sélectionnez dans Baseline Setting les éléments suivants : Baseline Subscribed Curve fit (Ajustement de courbe en soustrayant la ligne de base) Apply fluorescent drift correction (Appliquer la correction des dérives par fluorescence) Pour définir les valeurs seuils de chaque canal de détection, allez dans Baseline threshold > Single threshold > User defined et saisissez les valeurs indiquées dans le Tableau 15. Laissez la ligne de base en auto-calculated. Page 20 sur 28 Carbaplex IVD PCR Kit Instructions d utilisation Révision B

Tableau 15 Valeurs seuils du CFX96 pour le Dosage de PCR en temps réel Carbaplex Canal FAM VIC TEXAS RED Cy5 KPC NDM Type OXA-48 Table(s) Témoin interne IMP VIM - Threshold 30 50 60 70 Révision B Carbaplex IVD PCR Kit Instructions d utilisation Page 21 sur 28

8.4 QuantStudio 5 Consultez le mode d emploi pour savoir comment faire fonctionner l appareil de PCR en temps réel et procéder à des analyses de données. Il est important de contrôler visuellement les courbes d amplification pour chaque échantillon afin de s assurer que les résultats enregistrés sont bien dus à une amplification réelle et ne correspondent pas au bruit de fond enregistré au-dessus des seuils définis. Le Tableau 16 précise les cibles détectées par les canaux de détection correspondants. Définissez ces colorants comme étant des colorants rapporteurs. Tableau 16 Canaux de détection utilisés pour détecter la présence des gènes cibles des carbapénèmases en utilisant le QuantStudio GREEN YELLOW ORANGE RED Canal du colorant rapporteur FAM VIC JUN Cy5 Changement d état Aucun Aucun Aucun Aucun Cible détectée avec Carbaplex MM 1 Cible détectée avec Carbaplex MM 2 Témoin interne KPC NDM Type OXA-48 Témoin interne IMP VIM N/A Configurez le QuantStudio 5 en utilisant les paramètres suivants : Volume d échantillon : 25 µl Mode standard (avec taux de rampe à 1,6 C / s) Consultez le Tableau 17 pour les paramètres du profil thermique. Les données doivent être recueillies pour l ensemble des 45 cycles. Tableau 17 Paramètres de PCR pour le Dosage de PCR en temps réel Carbaplex Étape Température ( C) Durée Nombre de cycles Collecte de données Activation 95 15 min 1 Inactif Dénaturation 94 30 s Inactif 45 Annelage / extension 60 60 s Actif Pour analyser les données, assurez-vous que le colorant de référence passif ROX est désactivé et décochez la case de seuil automatique pour chaque cible. Le calcul automatique de la ligne de base doit continuer à se faire. Utilisez les informations fournies dans le Tableau 18 pour définir les valeurs seuils de chaque canal de détection dans la fenêtre Analysis settings. Tableau 18 Valeurs seuils du QuantStudio 5 pour le Dosage de PCR en temps réel Carbaplex Canal FAM VIC JUN Cy5 Table(s) Témoin interne KPC IMP NDM VIM Type OXA-48 Threshold 5 000 12 000 20 000 13 000 - Page 22 sur 28 Carbaplex IVD PCR Kit Instructions d utilisation Révision B

9 Interprétation des résultats 9.1 Témoin interne La détection d un témoin interne n est pas nécessaire lorsque le résultat est positif. Dans les cas où le témoin interne n a pas fonctionné mais l échantillon est considéré comme positif pour un ou plusieurs gènes de carbapénèmases, le résultat positif est considéré comme étant valable. Dans les cas où l échantillon est indiqué comme négatif pour toutes les cibles et le témoin interne est négatif, l utilisateur doit refaire le dosage en utilisant les mêmes extraits, mais dilués à 1:10. Si le témoin interne est alors signalé comme étant positif, le résultat initial était probablement dû à une erreur de manipulation/un phénomène d inhibition de la PCR et tout autre nouveau résultat doit alors être signalé. Si le témoin interne continue d être négatif après la répétition du test, l échantillon doit être re-testé en reprenant à partir de l étape d extraction. 9.2 Témoins positifs et négatifs Au moins un témoin positif et un témoin négatif issus du kit témoin fourni doivent être inclus dans chaque analyse. Chaque témoin négatif ou positif doit être préparé et testé dans les mêmes conditions que les échantillons de patients. Un témoin négatif qui donne un résultat de test positif révèle un problème de manipulation de l échantillon ou un problème de contamination. La séquence du dosage doit être réitérée en utilisant un aliquote de matériel témoin négatif fraîchement préparé tout en veillant à ce que la zone de travail et l équipement soient correctement décontaminés et qu un soin extrême soit apporté à la configuration de la PCR. Un témoin positif qui donne un résultat négatif révèle un échec de réactif ou une erreur de manipulation d échantillon. Veillez à ce que tous les réactifs soient correctement stockés et le cas échéant, vérifiez leur date de péremption avant de répéter la séquence du dosage en prenant des précautions toutes particulières pendant la configuration de PCR. Les résultats attendus pour le témoin positif sont indiqués dans le Tableau 19. Tableau 19 Résultats attendus pour le témoin positif Mastermix d amorce/sonde utilisé Carbaplex MM 1 Carbaplex MM 2 Cibles positives attendues KPC POSITIF NDM POSITIF POSITIF AU TYPE OXA-48 IMP POSITIF VIM POSITIF 9.3 Échantillons de patients / d origine inconnue Pensez à toujours contrôler visuellement les courbes d amplification pour chaque échantillon afin de vous assurer que les résultats enregistrés sont bien dus à une amplification réelle et non au bruit de fond enregistré au-dessus des seuils définis. Selon le type d échantillon, la quantité de matériel présent dans les échantillons envoyés en raison d une suspicion de CPE peut varier considérablement. Ainsi, toute valeur de C t inférieure à 45 pour les Révision B Carbaplex IVD PCR Kit Instructions d utilisation Page 23 sur 28

gènes de carbapénèmases correspondants peut indiquer un échantillon positif. Le Tableau 20 et le Tableau 21 résument les résultats obtenus dans chaque puits testé en fonction du mélange réactionnel Carbaplex MM 1 ou Carbaplex MM 2. Tableau 20 Résultats obtenus avec Carbaplex MM 1 Canal Gène carbapénèmase associé Valeur du C t Interprétation des résultats Green Yellow Orange Red Témoin interne KPC NDM Type OXA-48 > 10 SUCCÈS du témoin interne N/A OU < 10 ÉCHEC du témoin interne < 45 Échantillon positif N/A Échantillon négatif < 45 Échantillon positif N/A Échantillon négatif < 45 Échantillon positif N/A Tableau 21 Résultats obtenus avec Carbaplex MM 2 Échantillon négatif Canal Gène carbapénèmase associé Valeur du C t Interprétation des résultats Green Yellow Orange Témoin interne IMP VIM > 10 SUCCÈS du témoin interne N/A OU < 10 ÉCHEC du témoin interne < 45 Échantillon positif N/A Échantillon négatif < 45 Échantillon positif N/A Échantillon négatif Page 24 sur 28 Carbaplex IVD PCR Kit Instructions d utilisation Révision B

10 Caractéristiques de performance Les caractéristiques de performance identifiées lors de la vérification et de la validation du Dosage de PCR en temps réel Carbaplex sont indiquées dans le Tableau 22 et le Tableau 23. Le Tableau 22 fournit la performance analytique avec des quantités connues de matériel analysé à la limite de détection (LOD) de 10 copies initiales et plus (ADN) tandis que le Tableau 23 présente les données de performance clinique issues d une évaluation de performance multicentrique. Tableau 22 Caractéristiques de performance analytique du Dosage de PCR en temps réel Carbaplex Sensibilité (%) Spécificité (%) Échantillons modifiés 97,6 99,3 Tableau 23 Caractéristiques de performance clinique du Dosage de PCR en temps réel Carbaplex Performance avec prélèvements rectaux potentiels (%) Sensibilité (%) 100,0 96,3 Spécificité (%) 98,2 98,8 Performance avec isolats cliniques (%) Les chiffres pour la performance clinique ont été établis à partir de 500 prélèvements rectaux recueillis dans le cadre des soins de routine et de 151 isolats cliniques. Révision B Carbaplex IVD PCR Kit Instructions d utilisation Page 25 sur 28

11 Élimination Généralités concernant l élimination Éliminez tout réactif non utilisé, tout déchet et tout matériel d expédition conformément à la réglementation nationale, régionale ou locale en vigueur. Élimination de la neige carbonique La neige carbonique contient du CO 2 et doit être manipulée avec des gants dans un endroit bien ventilé. Procédez à l élimination de la neige carbonique en respectant la réglementation nationale, régionale ou locale en vigueur. Élimination des emballages Veuillez jeter l ensemble des emballages en respectant la réglementation locale concernant le recyclage. Les instructions susmentionnées concernant la procédure d élimination s appliquent à tous les états membres de l UE. L élimination correcte de ce produit permet de protéger les ressources naturelles et de veiller à ce que son recyclage soit effectué de manière à éviter toute conséquence négative éventuelle pour l environnement et la santé humaine. Si vous souhaitez obtenir des informations complémentaires, contactez votre service local de collecte des déchets. Page 26 sur 28 Carbaplex IVD PCR Kit Instructions d utilisation Révision B

12 Explication des symboles Les symboles suivants peuvent figurer sur les étiquettes du Carbaplex IVD PCR Kit ou dans ces Instructions d utilisation. Symbole Description Date limite d utilisation AAAA-MM-JJ Numéro de lot Fabricant Dispositif médical de diagnostic in vitro Contenance suffisante pour <n> tests Numéro de référence du produit Températures limites minimale et maximale de stockage Garantit la conformité à toutes les exigences légales associées Révision B Carbaplex IVD PCR Kit Instructions d utilisation Page 27 sur 28

13 Fabricant Bruker Daltonik GmbH Fahrenheitstraße 4 28359 Brême Allemagne Assistance Courriel : Support.Molecular-Testing@bruker.com Téléphone : 00800-BRKRSUPPORT (00800-27577877678) Informations relatives à la vente Courriel : Pour obtenir des renseignements d ordre général, veuillez contacter : ms.sales.bdal@bruker.com Pour obtenir des renseignements concernant les commandes, veuillez contacter : care@bruker.com Téléphone : +49 421 2205-0 Site web : www.bruker.com/care Les descriptions et spécifications remplacent toutes les informations antérieures et sont sujettes à changement sans avis préalable. Copyright 2017 Bruker Daltonik GmbH Page 28 sur 28 Carbaplex IVD PCR Kit Instructions d utilisation Révision B