Dr. Maël PENHOAT Mael.penhoat@univ-lille1.fr Chimie Analytique Instrumentale Notions de spectrométrie de masse
Plan du cours : PARTIE I Définitions Principe de la spectrométrie de masse Instrumentation JJ Thompson (1912) Spectromètre de masse (2010)
Définition : Spectrométrie de masse La spectrométrie de masse (MS) est une méthode de mesure des rapports masse sur charge (m/z) de molécules individuelles et ionisées et de leurs produits de fragmentation. (z) (z) (z) (z) (z) Plusieurs informations peuvent être disponibles : la masse moléculaire d un composé, la masse des fragments de ce composé, une mesure quantitative de ce composé
Définition : Spectre de masse (z) (z) (z) (z) (z)
Applications : Détermination de la structure des molécules organiques et biologiques. Détermination de la masse molaire des peptides, des protéines et d oligonucléotides. Détection et identification des produits dopants dans le sang chez les sportifs. Détection et identification de drogues et médicaments dans le sang, l urine et la salive. Contrôle des gaz dans la respiration d un patient pendant une intervention chirurgicale. Datation de pièces archéologiques. Analyse de particules d aérosol. Détermination des résidus de pesticides dans la nourriture. Contrôle de la présence de produits organiques volatils dans l eau de distribution Détermination des séquences des acides aminés dans les polypeptides et protéines (Protéomique).
Définition : Grandeurs La masse (m) masse exacte et masse nominale Masse exacte d une particule = 1,66054.10-27 kg = 1/12ème de la masse de l isotope 12 C = 1 uma= 1 Da s exprime en unité de masse atomique (uma) ou en Dalton (Da) Masse nominale (ou masse monoisotopique) = Σ nbrede masse des atomes de la molécule ou de l ion La charge (q = ze) charge élémentaire (e = 1,6.10-19 C) et z nbreentier Le rapport masse sur charge (m/ze) «tri» des ions Abus de langage, «masse» = masse/charge
Définition : Utilisation du spectre de masse La valeur m/z du pic moléculaire permet de calculer la masse moléculaire. Les pics de fragmentation permettent de reconstituer une partie de la structure. L intensité des pics permet de faire de l analyse quantitative. Exemple :
Principe de la spectrométrie de masse : Un spectromètre de masse mesure la masse de molécules isolées en phase gazeuse. Pour cela, le spectromètre de masse doit assurer les opérations suivantes : 1) Volatiliser Séparer les molécules les unes des autres : on passe de l état de matière condensée à un état gazeux. 2) Ioniser Transformer les molécules en ions, car un spectromètre de masse fonctionne grâce à des champs électriques. 3) Mesurer les rapports m/z La masse moléculaire est calculée à partir du rapport masse (m)/charge (z).
Instrumentation : Différents éléments d un spectromètre de masse : M = molécule : Dispositif permettant d introduire les molécules de préférence sous forme gaz. Parfois le passage sous forme gazeuse est réalisé au niveau de la source d ion. : La source d ion permet d ioniser la molécule à l état gazeux par transfert de charge +e ou -e. : L analyseur permet de séparer les différents ions générés (père ou fils) selon leur rapport masse/charge. (balayage d un champ magnétique ou électrique) : Dispositif permettant de recueillir les ions séparés par l analyseur pour produire un courant électrique proportionnel au nombre d ions. Pour éviter toutes collisions avec des molécules résiduelles, «source, analyseur et détecteur» du spectromètre de masse sont maintenues sous vide par un système de pompage fonctionnant en permanence.
I -Sources d ions : Il existe de nombreux types de sources d ions et chacun de ces types de sources repose sur un principe physique différent. Le principe physique qui permet de volatiliser et d ioniser un type de composé est choisi par l opérateur en fonction des caractéristiques de la molécule à analyser. Les étapes de volatilisation et d ionisation se font successivement ou simultanément selon le type de source. Les critères de choix principaux sont : la volatilité et la stabilité thermique du composé à analyser sa labilité chimique les fonctions chimiques présentes et leur aptitude à induire une ionisation la taille des molécules les quantités de produit disponibles le type d introduction souhaitée (directe ou en couplage chromatographique)
Sources d ions : 1 - Ionisation par impact électronique (EI) L échantillon gazeux est introduit dans la source où ses molécules sont frappées par un faisceau d électrons de 70 ev d énergie cinétique (référence). Il se forme alors des ions positifs : Ceux-ci peuvent ensuite se fragmenter suivant leur énergie interne. Principe :
L ionisation par impact électronique conduit ainsi à un spectre assez fourni, avec de nombreux fragments, très riche en informations structurales. Le nombre d ions formés est proportionnel à la pression de l échantillon et au courant électronique: c est une méthode quantitative. Cette méthode d ionisation est universelle ; la variété des ions formés dépend de l énergie cinétique des électrons, propriété utile pour l étude des structures moléculaires. Exemple : Spectre de masse de la venlafaxine(antidépresseur) (M = 277 g.mol-1) N OH O Pic moléculaire inapparent (fréquent en EI)
Spectres EI de l acétate d éthyle en fonction du potentiel d accélération des électrons : Acétate d éthyle O O Exact Mass: 88,05
Potentiel d ionisation par Impact Electronique (EI) : Le potentiel d ionisation (PI) d une molécule est l énergie minimale nécessaire à l expulsion d un électron de cette molécule. Exemple : Potentiel d ionisation de CH 3 -CH 2 -CH 2 -X en fonction de la nature de X
2 - Ionisation chimique positive (PCI) : La substance à analyser est injectée dans la source avec un large excès de gaz (méthane, ammoniac, isobutane ). Le gaz est ionisé en premier et ionise ensuite la substance par transfert de charge. Zoom de la chambre d ionisation :
Ionisation chimique positive en présence de méthane : L ion MH+ qui n est pas radicalaire a moins tendance à se fragmenter que l ion moléculaire M+ en ionisation électronique cette ionisation douce permet d obtenir un ion «pseudomoléculaire»(m+1). Danscecasladétectiondupicmoléculaireestdansbiendescasplusaisée.
Affinité protonique (PA) : L affinité protonique correspond à la variation d enthalpie pour la réaction de protonation. L observation d un ion moléculaire MH+ signifie que l espèce étudiée M a une affinité protonique beaucoup plus forte que celle du gaz d ionisation(pa(m)>pa(gaz)). L énergie de protonation dépend également la température et de la pression au sein de la source.
Exemple : Spectres EI et PCI de la Leucine : Leucine M = 131 u isobutane PCI méthode plus douce que l EI (moins de fragmentation)
3 -Ionisation chimique négative (NCI) : Le principe est le même que l ionisation positive avec transfert de charge d un gaz vers l espèce étudiée. Les gaz utilisés sont toutefois différents. Mélange CH 4 /N 2 O : Mécanisme de transfert de charge : Cette ionisation douce permet d obtenir dans ce cas un ion «pseudomoléculaire» (M-H)-avec une détection à (M-1). Formation d ions réactifs positifs (PCI) ou négatifs (NCI) à partir du gaz précurseur : M + (gaz précurseur)± (produit)± (fragments)±
4 - Ionisation par electrospray(esi) : Une solution est pulvérisée dans une chambre. Un courant de gaz sec (N 2 ) évapore progressivement le solvant. Un potentiel de quelques kv est appliqué à la sortie du capillaire ce qui permet de charger les gouttelettes. Les gouttelettes chargées (de plus en plus petites) sont dirigées par un champ électrique vers l analyseur. Echantillon liquide ± 5kV Gaz auxilliaire (N 2 ) Aiguille Gaz envelopant(n 2 ) Spray Plume
Principe de l électrospray:
5 - Désorption / ionisation laser (MALDI) La désorption-ionisation laser assistée par matriceest une technique d'ionisation douce utilisée en spectrométrie de masse, permettant l'analyse de biomolécules (protéines, sucres) et les grosses molécules organiques qui tendent à devenir fragiles et à se fragmenter lorsqu'elles sont ionisées par des méthodes plus conventionnelles. Elle est relativement similaire à l'ionisation par électrosprayen douceur relative et en ions produits (bien qu'elle crée moins d'ions multichargés). L'ionisation est provoquée par un faisceau laser (normalement un laser à l'azote). Une matrice est utilisée afin de protéger la biomolécule de la destruction par un faisceau direct et de faciliter la vaporisation et l'ionisation.
Exemple de matrices : Préparation des échantillons : Evaporation Matrice + échantillon + solvant Déposés sous forme de goutte dans un puit Matrice + échantillon cristallisés
Comparaison entre les méthodes d ionisation : Les «ionisations dures» génèrent souvent des ions moléculaires, à nombre impair d électrons, qui se fragmentent beaucoup et parfois même totalement avant d avoir eu le temps de sortir de la source. Les «ionisations douces»génèrent des ions moléculaires à nombre pair d électrons, qui sont relativement stables et qui ont des durées de vie suffisantes pour traverser l analyseur, arriver jusqu au détecteur, et donc être mesurés. Ionisation Dure Assez Douce Douce Méthode Impact Electronique (EI) Ionisation Chimique Positive (PCI) Ionisation Chimique Négative (NCI) Electrospray (ESI) Désorption/Ionisation Laser (MALDI)
II - L analyseur Il existe différents types d analyseurs. Ils sont tous basés sur des principes physiques différents, mais tous les analyseurs mesurent des valeurs m/z : B : Déflexion par un champ magnétique (c'est l'analyseur le plus ancien) Q : Déflexion par un champ quadripolaire IT : Confinement dans un piège à ion (Ion Trap) TOF : Mesure d un temps de vol (Time Of Flight) FT-ICR : Résonnance Cyclotronique d Ions à Transformée de Fourrier Les ions formés dans la source sont dirigés (extraction et focalisation) vers l analyseur par des champs électrostatiques qui peuvent être de quelques volts (Q, IT, FT-ICR) ou de plusieurs dizaines de kilovolts (TOF, B). La vitesse de déplacement des ions dans l analyseur dépend de l intensité du champ d extraction Les caractéristiques principales d'un analyseur sont : La résolution R La gamme m/z qu'il peut analyser La rapidité de balayage en m/z La sensibilité La vitesse avec laquelle les ions le traversent Les caractéristiques dépendent de l analyseur. Chaque type d'analyseur a son "point fort".
Résolution (R) : La résolution mesure l aptitude d un analyseur à séparer deux ions de masse aussi voisines que possible.
1 -Analyseur par un champ magnétique (B) : PRINCIPE : Action d un champ électrique sur une particule chargée : ddp U (volt) entre deux plaques distantes de d (mètres) apparison d un champ électrique E avec : Dans ce champ électrique E, une particule de charge q (Coulomb) subit la force F e (Force de Coulomb) : Siq > 0 E et F e ont le même sens F e ne dépend pas de la masse de l ion, uniquement de sa charge q
Action d un champ magnétique sur une particule chargée : Soumise à un champ magnétique B, un ion de charge q (Coulomb) et de vitesse v (m.s -1 ) subit une force Fm (Force de Lorentz) : Si v etb perpendiculaires Fm = q.v.bet v, B et Fm perpendiculaires Dans ces conditions, la force Fm ne modifie pas la vitesse de l ion L ion est soumis à une force orthogonale à son déplacement l ion amorce une trajectoire circulaire de rayon R dans un plan perpendiculaire à B et contenant v. L ion est en équilibre sur cette trajectoire F cent (force centrifuge) F cent = m.v 2 /R F m = F cent
Action d un champ magnétique sur une particule chargée (suite) : R varie en fonction du rapport m/z 1 même ion avec 2 charges différentes donnera 2 signaux R varie en fonction de v si l on veut que 2 ions de même rapport m/z aient la même trajectoire, il faut qu ils aient la même vitesse v
Principe de fonctionnement d un analyseur magnétique : Différentes façons pour l introduction de l échantillon (seringue, «sortie» de chromatographes (GC, HPLC )). Le jet gazeux passe dans la chambre d ionisation (pression très basse) Un système permet de canaliser le flux moléculaire en un jet qui est dirigé vers un ensemble d électrodes
Principe de fonctionnement d un analyseur magnétique : Les molécules sont bombardées par un flux d électrons : formason d ions posisfs après impact des électrons sur les molécules Les ions formés (cations) sont différents et ont différentes masses : obtenson d un spectre de masse
Principe de fonctionnement d un analyseur magnétique : Les ions chargés positivement sont sensibles au champ électrique. Accélération des cations par plusieurs plaques (fentes d accélération) portés à des potentiels négatifs croissants (ddp totale de 10000 V) Focalisation du courant d ions par d autres plaques (fentes de focalisation)
Principe de fonctionnement d un analyseur magnétique : 10-5 torr Les chambres d ionisation et d accélération sont placées sous vide poussé (10-5 torr) pour éviter les arcs électriques et minimiser les collisions entre ions Tous les ions acquièrent la même vitesse cinétique d accélération : E cin accélération = q.u= z.e.u= ½ m.v 2 E cin totale = E cininitiale + E cinaccélération
Principe de fonctionnement d un analyseur magnétique : 10-5 torr Les chambres d ionisation et d accélération sont reliées à un tube analyseur Le tube analyseur (ici tube recourbé à 180 ) est soumis à un champ magnétique perpendiculaire à sa courbe et est toujours sous basse pression. Suite à l action du champ magnétique B, les ions sont déviés
Principe de fonctionnement d un analyseur magnétique : Les ions n ont pas la même masse, ni la même vitesse. Pour un champ B constant, ces ions subissent des forces de déviation différentes et leurs trajectoires sont donc différentes. La trajectoire de certains de ces ions fait qu ils vont s écraser sur les parois du tube analyseur ces ions ne sont pas détectés
Principe de fonctionnement d un analyseur magnétique : Sélection des ions en fonction de m/z : F m = q.v.bet F cent = m.v 2 /R Système à l équilibre sur la trajectoire de rayon R F m = F cent Pour chaque m/z, il faut faire varier B pour conserver R constant :
Principe de fonctionnement d un analyseur magnétique : Arrivé au bout du tube analyseur, les ions sont canalisés par une série de fentes et atteignent ensuite le système de détection
2 - Analyseur quadripolaire (Q) : 4 barres métalliques parallèles (l = 5 à 20 cm) raccordées électriquement 2 à 2. Sur les champs électriques, on surimpose une tension alternative. Les ions en résonnance ont une trajectoire stable et traversent le quadripolepour être détectés. Les ions en non-résonnaceont une trajectoire instable et sortent du quadripoleet ne sont pas détectés.
3 -Analyseur de piège à ions -ion trap(it) : Le piège est constitué de 3 électrodes entre lesquelles on applique une tension en radiofréquence. Un balayage de l'amplitude de la radiofréquence entraîne l'expulsion des ions piégés vers le détecteur. Principe :
4 -Analyseur à temps de vol -Time of Flight (TOF) : Les ions de rapport m/z différents se déplacent à des vitesses différentes (acquises dans la phase d accélération). Le tube de vol est libre de tout champ. Les ions de rapport m/z le plus petit parviendront au détecteur les premiers.
5 - Analyseur à résonance cyclotronique(ft-icr) : Séparation selon la fréquence cyclotronique(force de Lorentz) dans un champ magnétique.
L analyse de la fréquence cyclotroniquedonne accès à un signal ondulatoire qui est ensuite traité mathématiquement à l aide d une transformée de Fourrier pour conduire au spectre de masse. Cette technique est de loin la plus complexe mais aussi la plus résolutive et permet de mesurer jusqu à la masse d électrons ou de particules plus petites. a) Signal ondulatoire brut b) Signal traité par transformée de Fourrier = Spectre de masse.
6 -Analyseur Orbitrap: Séparation selon la fréquence cyclotronique(force de Lorentz) dans un champ magnétique. Fréquences caractéristiques : Fréquence de rotation ω φ Fréquences d oscillations radiales ω r Fréquences d oscillations axiales ω z r ω ϕ = ω z 2 R m R 2 1 z ω r = ω z R m R 2 2 φ ω z = k m / z
III Le détecteur Dernier élément du spectromètre de masse, le détecteur fournit des signaux électriques qui sont enregistrés sous la forme de spectres de masse par le logiciel d acquisition de l ordinateur qui pilote l appareil. Channeltron Il existe différents détecteurs : Cylindre de Faraday Multiplicateur d électrons secondaires Multiplicateur magnétique Channeltron Galette de microcanaux
En Résumé