Microscope confocal à balayage laser Photo-détecteur Filtre confocal Plan image Image reconstruite point par point par balayage laser Miroir dichroïque Source de lumière Laser Objectif Obtention directe de coupes optiques sans information parasite des plans voisins Plan focal
filtre d'excitation diaphragme confocal photodétecteur Université Joseph Fourier Yves Usson 2000 Schéma de principe du microscope confocal source laser plan focal rayons hors focale (pinhole) filtre d'émission échantillon objectif miroir dichroïque rayons hors focale
plan focal XY vue XZ plan focal XY vue XZ Université Joseph Fourier Yves Usson 2000 Formation de l image Microscopie conventionnelle Microscopie confocale I I X X
Microscopie confocale - PSF réelle Bille diamètre 200nm Imagée avec objectif 63x 1.4NA échantillonnage 100x100x100nm
Comparaison Conventionnel/Confocal 5µm Image 256x256 Fluorescence conventionnelle Image 256x256 Fluorescence confocale
Y Description des données 3D Pile de sections numérisées Volume numérique X voxel Connexité (voisinage) dans un volume numérique facette commune arête commune sommet commun Z
Galerie de sections optiques
Microscopie 3D -Sections orthogonales
Profondeur d'observation limitée par les propriétés des objectifs Atténuation du signal lumineux par l'optique du microscope Déformations dues aux différences d'indice de réfraction Université Joseph Fourier Yves Usson 2000 Limites des méthodes d'acquisition en microscopie confocale Modes de microscopie limités Photodégradation des fluorochromes Absorption de la lumière par le specimen Bruits photonique et électronique
Amélioration du rapport signal-bruit Université Joseph Fourier Yves Usson 2000 Fluorescence - Nature du bruit photonique Bruit poissonnien Bruit gaussien 1.00 µ 0.80 0.60 σ Source 3 photons/ms 0.40 0.20 2 4 1 6 3 0.00 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 PIXELS temps d intégration 1 ms
Amélioration du rapport signal/bruit 5µm Image 256x256 : 1 trame durée : 0,5 s/trame Moyennage de 4 trames Moyennage de 32 trames
60 5,0 Université Joseph Fourier Yves Usson 2000 4,0 3,0 2,0 Absorption de la lumière par le specimen 60 40 20 Vue latérale brute (noyaux de cellules myocardiques) 0 0 20 40 60 80 100 Numéro de section 40 20 Vue latérale après compensation par une fonction log-logistique (Rigaut et al., 1991) 0 0 20 40 60 80 100 Numéro de section
Photodégradation de la fluorescence Photodégradation d'une préparation homogène 250 Photodégradation en fonction du temps d'exposition Gel de F.I.T.C. 200 150 100 50 Les molécules de fluorochrome situées dans le double cône de lumière sont altérées 0 0 2 4 8 10 12 14 16 Temps en min.
o xy h xy i xy Plan image Disque de Airy Université Joseph Fourier Yves Usson 2000 Formation de l image par une lentille Convolution par un filtre passe-bas i xy = h xy o xy Source ponctuelle rayons diffractés -1 ô xy = h xy i xy Restauration par déconvolution
Restauration de la résolution par déconvolution Spermatozoïde démembrané de Xenopus laevis incubé dans un extrait d'oeuf Etude de la cinétique de recondensation chromosomique (1h30) Marquage YOYO (de la Barre & Dimitrov) 2 1 Sections XY Données Sections XZ Reconstructions 2 1 Données restaurées
Reconstruction surfacique - Seuillage objet
Codage en distances à l observateur Université Joseph Fourier Yves Usson 2000 Reconstruction surfacique - codage de distance axe Z (profondeur) Valeurs de profondeur Voxels "objet" Volume 3D Projection dans le Z-buffer Construction d une topographie
Reconstruction surfacique - Tampon Z Z Y X Z-buffer Carte de distance
Modèle simplifié d'illumination par diffusion et réflexion I = I0 (k1 + k2 cos α) k1 constante de lumière diffuse ambiante k2 constante de lumière réfléchie avec k1 < k2 et k1 + k2 = 1.0 Université Joseph Fourier Yves Usson 2000 Reconstruction surfacique - Modèle d illumination Direction d'observation & lumière incidente Normale à la facette α α angle entre la normale à la surface et la lumière incidente I0
direction de visualisation Z-buffer Université Joseph Fourier Yves Usson 2000 Reconstruction surfacique - Modèle d illumination Z Y X d z d y N Normale à la surface dans l'espace voxel d z d x d z ( N = Gz,, -1) d x d z d y Z-buffer
Reconstruction surfacique - Modèle d illumination Modèle d'illumination diffuse Prise en compte du marquage fluorescent et ajout d'ombrages Codage en distances et ajout d ombrages
Microscopie confocale - Visualisation 3D Reconstruction par suivi de rayons rayons observateur écran de visualisation volume 3D
Reconstruction par suivi de rayons - Transparence Université Joseph Fourier Yves Usson 2000 Microscopie confocale - Visualisation 3D Règle de transparence I P k = α k V k + (1-α k ) I ij { k-1 αk = f(v k ) I k est l'intensité collectée sur le chemin du rayon, I k-1 la valeur précédente; α k est le coefficient de transparence qui dépend de V k, la valeur du voxel courant pij rayon observateur écran de visualisation volume 3D