LA REVOLUTION DU SEQUENCAGE DE NOUVELLE GENERATION (NEW GENERATION SEQUENCING, NGS) Séquençage Sanger sur amplicons : 500 pb X 1 000 000 Exome humain 160,000 exons = 30 Mb (1.2% du génome humain) Profondeur du séquençage 100x 3000 Mb = 3 Gb Génome humain = 3 Gb
EXOMES CONSTITUTIONNELS: DONNÉES STABILISÉES Par exome: 34 Mb : 1.2% du génome total 20000 SNV (Single Nucleotide Variation) 500 SNVs rares (fréquence <0.1%) non répertoriés dans les bases de données 1 SNV de novo avec impact biologique Majorité des SNVs à impact biologique survenus < 10000 ans
Risque de maladie Tolérance biologique RELECTURE DE LA COMPLEXITE DU DETERMINISME GENETIQUE DES MALADIES HUMAINES Age 100% 80% Mutations rares voire privées 60% 40% Déterminisme monogénique Déterminisme Oligogénique Déterminisme Multigénique // // 1 5 Nombre de variations génétiques 100
RELECTURE DE LA COMPLEXITE DU DETERMINISME GENETIQUE DU CANCER
BENEFICE MEDICAL DU DIAGNOSTIC DES FORMES HEREDITAIRES DE CANCER COLORECTAL 1/500 Cancer colon, 62 ans Mutation MSH2 Cancer colon, 32 ans Wt/mt Cancer colon, 36 ans Wt/ Wt Wt/mt Wt/mt Lever une angoisse illégitime et une surveillance médicale injustifiée chez les sujets non porteurs Surveillance adaptée chez les porteurs
BENEFICE MEDICAL DU DIAGNOSTIC DES FORMES HEREDITAIRES DE CANCER DU SEIN ET DE L OVAIRE 1/400 Cancer du sein 35 ans Cancer du sein 50 ans Cancer du sein 67 ans Cancer de l ovaire 50 ans Cancer du sein 27 ans Cancer de l ovaire 45 ans Wt/Wt Wt/Wt Cancer du sein Wt/Mt 34 ans IRM annuelle Mastectomie prophylactique < 40 ans Annexectomie après tout projet parental Mutation BRCA1
DÉTERMINISME GÉNÉTIQUE DES FORMES FAMILIALES OU PRECOCES DU CANCER DU COLON ET DU CANCER DU SEIN - OVAIRE I. Optimisation du diagnostic des formes héréditaires de cancer du sein /ovaire du colon - Diagnostic par NGS - Interprétation des variants de signification inconnue des gènes MMR et BRCA II. Etude du déterminisme oligogénique du cancer colorectal III. Contribution des mutations de novo dans les cancers précoces sporadiques
I. PLATEFORMES NGS CAEN - ROUEN Gènes Intron MLH1 MSH2 MSH6 PMS2 (exons 6 à 15) Introns Introns Introns Introns APC STK11 MUTYH BMPR1A SMAD4 PTEN TP53 Introns Introns Introns Introns Introns Introns Introns 2100 patients 474 patients
OPTIMISATION DU WORKFLOW NGS DIAGNOSTIQUE Robotisation pré- et post-pcr Capture Sure Select et multiplexage avant capture Script d automatisation des taches Plateforme de Génomique Caen - Dominique Vaur
HETEROGENEITE DU DETERMINISME GENETIQUE DES CANCERS DU SEIN ET DE L OVAIRE 1500 patients RAD51C RAD51C PMS2 CDH1 NBN PMS2 CDH1 NBN RAD51D RAD51D MSH6 BARD1 RAD51B MSH6 BARD1 RAD51B 2% 2% 1% 1% 1% 1% 1% 1% 1% 1% 1% 1% 1% 1% 1% 1% XRCC3 XRCC3 1% 1% MRE11A MRE11A RAD50 <1% 2% 2% RAD50 BRIP1 BRIP1 0% 0% 2% 2% PMS1 2% MSH2 2% PMS1 2% MSH2 2% BRCA1 BRCA1 28% 28% 232 mutations délétères 16% MLH3 3% MLH3 3% CHEK2 CHEK2 6% 6% TP53 7% TP53 7% ATM 7% ATM 7% PALB2 PALB2 8% 8% BRCA2 24% 24% Castera et al. Eur. J. Hum. Genet. 2014, in press
VARIABILITE DU GENOME HUMAIN Next generation sequencing (NGS) Impact in Medical Genetics Patient Variations Interpretation
INTERPRÉTATION DES VARIANTS DE SIGNIFICATION INCONNUE Cancer du sein et de l ovaire Syndrome de Lynch Hereditary Non Polyposis Colorectal Cancer 1/400 1/500 BRCA genes (BRCA1, BRCA2) MMR genes (MLH1, MSH2, MSH6, PMS2) Genetic counseling Variants de signification inconnue Neutral variation? Pathogenic mutation? Appropriate clinical follow-up MMR : Colonoscopy, Hysteroscopy BRCA : Breast MRI, Mastectomy, Adnexectomy Targeted therapies e.g.: anti-parp for BRCA deficient patients
II. IMPACT DES VARIANTS DE SIGNIFICATION INCONNUE SUR L EPISSAGE Mutations Exon + ~50 nt intronic sequence 3 ss 5 ss 5 ss 3 ss + - 5 ss 3 ss GU A PyPyPy AG GU A PyPyPy AG ISS Branch site Poly-Py tract ESE ESS ISS ISE Branch site Poly-Py tract ESE, exonic splicing enhancer ESS, exonic splicing silencer ISE, intronic splicing enhancer ISS, intronic splicing silencer Inserm U1089, Alexandra Martins
THE MINIGENE SPLICING ASSAY PCR Minigene preparation Cloning Sequencing Analysis of minigene s transcripts Tournier et al., Hum Mutat. 2008 Bonnet et al., J Med Genet. 2008 Vezain et al., Hum Mutat. 2010 Gaildrat et al., J Med Genet. 2010 Gaildrat et al., Methods Mol Biol. 2010 Théry et al., Eur J Hum Genet. 2011 Vezain et al., Hum Mutat. 2011 Gaildrat et al., J Med Genet. 2012 Di Giacomo et al., Hum Mutat. 2013 RNA extraction & RT-PCR WT mut Inserm U1079 human cells Transfection Electrophoresis Gel purification Sequencing
IMPACT SUR L EPISSAGE DES VARIANTS DE SIGNIFICATION INCONNUE DES GENES MMR 259 VSI des gènes MSH2, MLH1 et MSH6 Réseau français des laboratoires d oncogénétique Stéphanie Baert-Desurmont Julie Tinat Pascaline Gaildrat Alexandra Martins 71 VSI (28%) avec effet sur l épissage 46 VSI (18%) avec effet majeur 25 VSI (10%) avec effet partiel AG SR ESE hnrnp Inhibitor + - GU 18% des VSI reclassés en mutations délétères d épissage 188 VSI (72%) sans effet sur l épissage Base de données MMR INCa
IMPACT SUR L EPISSAGE DES VARIANTS DE SIGNIFICATION INCONNUE DES GENES BRCA 174 VSI des gènes BRCA Etude Nationale Réseau français des laboratoires d oncogénétique 21 VSI (12%) avec effet partiel SR hnrnp Inhibitor 50 VSI (29%) avec effet sur l épissage 29 VSI (17%) avec effet majeur AG + - ESE GU 17% des VSI reclassés en mutations délétères d épissage Base de données BRCA INCa 124 VSI (71%) sans effet sur l épissage
IMPORTANCE INSOUPCONNEE DES MUTATIONS D EPISSAGE: L EXEMPLE DE L EXON 7 DE BRCA2 BRCA2 exon 7 Total number of variants=36 missense nonsense synonymous small ins/del 24 2 5 5 Splicing mutations: Creation 5 ss 1 Destruction 3 or 5 ss.3 Splicing regulation..11 15 (42%) Inserm U1079 Di Giacomo et al., Hum Mutat. 2013
IMPORTANCE INSOUPCONNEE DES MUTATIONS D EPISSAGE: L EXEMPLE DE L EXON 7 DE BRCA2 BRCA2 exon 7 n=36 89 88 39 81 64 81 41 73 71 71 72 52 45 exon inclusion (%) 11 splicing regulatory mutations (31%) Inserm U1079 Di Giacomo et al., Hum Mutat 2013
PREDICTION BIOINFORMATIQUE DES MUTATIONS D EPISSAGE BASE SUR L ESR SEQ SCORES (Ke et al. 2011) ESRseq (hexamers) ESRseq Score* Total Score Score Change WT WT 3 ESE +0.266 1 ESS -1.115 c.617c>g c.617c>g exon skipping -0.849 2 ESS Inserm U1079 Di Giacomo et al., Hum Mutat 2013
Total ESRseq Score Change CORRELATION DES SCORES ESRSEQ TOTAUX ET DES DONNEES FONCTIONNELLES Increase in exon 7 skipping (n=11) No increase in exon 7 skipping (n=21) Inserm U1079 Di Giacomo et al., Hum Mutat 2013
BILAN DE L INSTITUT NATIONAL DU CANCER CRC 10 ans d activité des laboratoires français d oncogénétique CRC < 61 ans Taux de détection de mutations : 15% CRC < 51 ans Rendement mutationnel faible Situations cliniques ne répondent pas à un modèle monogénique simple Colon < 61 ans Rectum 65 ans
III. ÉTUDE DOCC : DÉTERMINISME OLIGOGÉNIQUE DU CANCER COLORECTAL Patients au moins deux apparentés liés au 1 er degré présentant un CCR dont l un avant 61 ans (ou adénome colorectal à haut risque avant 51 ans) ou un cas sporadique de CCR avant 51 ans (ou adénome colorectal à haut risque avant 41 ans), ou ou un cas index avec tumeurs colorectales primitives multiples, la première avant 61 ans Exclus : syndrome de Lynch, polyposes adénomateuse (>10 adénomes), et hamartomateuse Contrôles (Centre d Investigation Clinique, CHU de Rouen) âgés de 45 à 60 ans sans antécédent personnel de CCR sans antécédent familial de CCR au 1 er degré
SNPs ÉTUDIÉS PAR SNaPSHOT 8q23.3 rs16892766, EIF3H 8q24.21 rs6983267, TCF4 15q13.3 rs4779584, GREM1 18q21.1 rs4939827, SMAD7 rs58920878/novel1 10p14 rs10795668 Tomlinson et al., Nat Genet 2007; Zanke et al., Nat Genet 2007 Tomlinson et al., Nat Genet 2008; Tenesa et al., Nat Genet 2008 Middeldorp et al., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2009 Jaeger et al., Nat Genet 2008; Broderick et al., Nat Genet 2007 Song et al., PLoS One 2012; Pittman et al., Genome Res 2009
1029 PATIENTS INCLUS 412 hommes et 617 femmes Âge moyen au diagnostic du CCR : 43.1 ans 363 avec CCR chez 2 apparentés au 1 er degré dont l un avant 61 ans 887 avec CCR <51 ans (ou adénome avancé <41 ans) Centres participants 44 avec CCR primitifs multiples, le 1 er avant 61 ans Stéphanie Baert-Desurmont, Françoise Charbonnier Estelle Houivet, Jacques Benichou
INTÉRÊT MÉDICAL DU GÉNOTYPAGE DES SNPS DANS LE CANCER COLORECTAL 1. Réplication de l association du risque de CCR avec 3 SNPs 1. Odds ratios >> OR des études d association pangénomiques 2. Impact cumulé de l association des SNPs Déterminisme Oligogénique du Cancer Colorectal 3. OR>2 : intérêt médical
IV. MUTATIONS DE NOVO ET CANCERS SPORADIQUES Mutation de novo pre-zygotique Mutation de novo post-zygotique Taux mutations De novo chez l homme : 1.18x10-8 / base Entre 0 et 2 mutations de novo par exome Mosaïque Tumeur âge précoce Contribution des mutations de novo rares aux formes précoces de cancer de présentation sporadique?
ANALYSE EXOMIQUE DE TRIOS Stratégie : Analyse Exomique Soustractive «analyse de trios» Exome Vissers et al. Nat Genet. 2010 Variants de l enfant Exome Variants du père Variants de la mère Exome Variants de novo Identification des mutations de novo (0-2 par exome) Identification de nouvelles voies moléculaires Inserm U1079 Isabelle Tournier
PARADIGME DU CANCER DE L OVAIRE Cystadénocarcinome séreux bas grade ovarien (FIGO IV) 21 ans - Métastases péritoine - Métastases colon - Métastases pancréas - Métastases utérus 52 ans 56 ans Pr Jean-Christophe Sabourin - Criblage BRCA1 / BRCA2 : négatif - Criblage TP53 : négatif - CGH-array haute résolution : négatif 21 ans Mutation de novo hétérozygote? Stratégie : analyse exomique soustractive
STRATÉGIE DE FILTRATION DES VARIANTS Coutant et al., BMC, 2012 15715 306 46 9 1 1 mutation de novo: INHBA, Inhibin βa - Qualité >Q30 - Profondeur >10x - Fréquence AF <0.001 (EVS, 1000G) Filtre de novo Filtration des artefacts Détection sur moins de 20 % des reads Inserm U1079 Plateforme de Génomique de Rouen Isabelle Tournier, Françoise Charbonnier, Sophie Coutant
Activine A (ng/ml) Inhibine A(ng/mL) INHBA P.N386S ALTÈRE LE RATIO ACTIVINES/INHIBINES HEK293F Transfection transitoire Immuno-assays Sécrétion d Activine A Sécrétion d Inhibine A - 28 % + 44 % WT p.n386s WT p.n386s p.n386s favorise la production d Inhibine A et réduit la production d Activine A Inserm U1079
IDENTIFICATION D UNE MUTATION DU GÈNE INHA Séquençage Sanger du gène INHBA 14 patientes françaises cancer épithélial ovarien avant 40 ans 35 patientes américaines cancer épithélial ovarien avant 40 ans BRCA1/BRCA2 négatives CLCC François Baclesse Pas d autre mutation détectée Division of Medical Genetics University of Washington Séquençage Sanger du gène INHA 14 patientes françaises cancer épithélial ovarien avant 40 ans INHA : 1 mutation hétérozygote c.179g>t p.r60l Non répertoriée dans les bases de données
IDENTIFICATION DE VARIANTS RARES DES INHIBINES Séquençage Sanger des gènes INHBA et INHA 62 patientes françaises cancer épithélial ovarien avant 40 ans BRCA1/BRCA2 négatives Département de Génétique Institut Gustave Roussy Département de Génétique Institut Curie βa α INHBA : 1 mutation hétérozygote c.839g>a p.g280e Non répertoriée dans les bases de données Détection de plusieurs variants rares non-synonymes des gènes des Inhibines Inserm U1079
ENRICHISSEMENT DES CAS EN VARIANTS RARES DES INHIBINES Analyse statistique Variants rares non-synonymes des gènes INHA et INHBA 76 patientes (cohorte de réplication) 154 femmes Caucasiennes 1000 genomes project 4300 Caucasiens EVS dataset COLLAPSING (overall burden) AGGREGATING (weighted burden) BI-DIRECTIONAL (variance test) S1 S2 S3 S4 S5 S1 S2 S3 S4 S5 S S S
ENRICHISSEMENT DES CAS EN VARIANTS RARES DES INHIBINES Analyse statistique Variants rares non-synonymes des gènes INHA et INHBA 76 patientes (cohorte de réplication) 154 femmes Caucasiennes 1000 genomes project 4300 Caucasiens EVS dataset 1000G controls (n=154) EVS controls (n=4300) p-value Empirical Empirical p-value p-value p-value CAST 0.0025-0.0065 - CMC 0.0043 0.0031 0.0050 0.0100 WSS 0.0012 0.0029 0.0011 0.0095 C-ALPHA <0.0001 0.0017 0.0129 0.0188 SKAT 0.0016 0.0030 0.0204 0.0167 Enrichissement en variants rares non-synonymes des gènes INHA and INHBA dans la cohorte de patientes Camille Charbonnier, Inserm U1079
IMPLICATION DES MUTATIONS CONSTITUTIONNELLES DES INHIBINES DANS LE DÉTERMINISME GÉNÉTIQUE DES FORMES PRÉCOCES DE CANCER DE L OVAIRE I- Identification d une mutation de novo de INHBA (chaîne β) II- Impact fonctionnel démontré de cette mutation III- Détection d une mutation de INHA (chaîne α) IV- INHA, gène suppresseur de tumeurs avec spécificité gonadique V- Enrichissement en variants rares des inhibines dans la cohorte de patientes avec cancer de l ovaire précoce Altération du ratio activines / inhibines Alteration du cross-talk entre cellules de la granulosa et cellules épithéliales Inserm U1079 Tournier et al., Human Mutation 2014
PROJET ONCOGENETIQUE I. Optimisation du diagnostic des formes héréditaires de cancer du sein /ovaire du colon - Fast track diagnosis - Plate-forme d Interprétation des variants de signification inconnue II. Contribution des mutations de novo dans les cancers précoces sporadiques III. Traitements personnalisés: inhibiteurs de PARP, immunothérapie, chimiothérapies non génotoxiques