Les données de l analyse des patrons d expression de certains gènes

La latéralité Les données des mutations naturelles Les données de l analyse des patrons d expression de certains gènes Les analyses expérimentales Les modèles : - la barrière gauche-droite - le flux nodal - des deux cils deux yeux, deux bras, deux poumons deux hémisphères cérébraux, une bouche, un cœur situé légèrement à gauche dans la cage thoracique un foie est à droite un estomac à gauche Intestin tournant à droite (inverse aiguille montre si on regarde l individu Poumon : 3 lobes à droite et 2 lobes à gauche

a) Les données des mutations naturelles Chez l homme : situs inversus Situs solitus Situs inversus situs inversus totalis : inversion complète de l AGD, 1/6000 à 1/10000 naissances (viable) Situs inversus ambiguus : nombre limité d organes sont inversés (malformations graves) a) Les données des mutations naturelles Chez l homme : asymétrie perdue isomérisme isomérisme gauche : les deux cotés sont de type gauche

a) Les données des mutations naturelles Chez l homme : asymétrie perdue, isomérisme : isomérisme droit : les deux cotés ont des caractéristiques de région droite (pas de rate : sensibilité aux infections) a) Les données des mutations naturelles Chez l homme : le syndrome ICS (immobile cilia syndrome) : mutation autosomique récessive : position aléatoire autres anomalies : gène ZIC3 code un facteur de transcription lié au chromosome X locus Xq26.2 (rarissime) les hommes homozygotes : situs ambiguus syndrome de Kartegener : ou syndrome de dyskinésie ciliaire primitive provoque une bronchorrhée chronique (accumulation mucus), sinusite chronique, situs inversus anomalies de rotation de l intestin

a) Les données des mutations naturelles Chez la souris : mutation récessive : inversus viscerum (gène iv) : courbure aléatoire du tube cardiaque positionnement aléatoire des organes 50% sont normaux et 50% inversés Asymétrie normale Courbure à gauche 50% des souris homozygotes iv Courbure droite inversus viscerum -iv- où 50% sont normaux et 50% inversés mutation récessive : inversion of embryonic turning (gène inv) : homozygotes : inversion complète du retournement inversion complète des organes, 100% situs inversus b) Analyse des mutations et des invalidations Gènes Protéines Organismes Phénotypes Effets sur l expression des gènes Brachyury, T Facteur de transcription HNF3 b Facteur de transcription Souris Souris Pas de chorde, défauts du noeud, courbure du coeur au hazard Pas de noeud et de chorde, absence de retournement et Absence de nodal, lefty-1, lefty-2 Absence de nodal, absence ou expression bilatérale de lefty de courbure du coeur inv Souris 100% de situs inversus Expression de nodal à droite, Pitx2 à droite, lefty-2 à droite, lefty 1 à droite dans la ligne médiane. Expression symétrique de nodal dans le noeud No turning (nt) Souris Dégénéresence de la chorde, pas de retournement de l embryon, courbure du coeur au hazard Sonic hedgehog Souris Isomérisme pulmonaire gauche, courbure du coeur et retournement de l embryon au hazard Expression complexe de nodal, expression bilatérale ou absente de lefty, lefty absent de la ligne médiane Lefty absent de la ligne médiane et du mésoderme latéral, expression bilatérale de pitx2, expression bilatérale ou à gauche de nodal et lefty-2. Positionnement gauche-droit des organes est-il régulé génétiquement??

b) Analyse des mutations et des invalidations Gènes Protéines Organismes Phénotypes Effets sur l expression des gènes Lefty A Cryptic Apparentée au TGFb Protéine de type EGF- CFP Lefty-1 Apparentée au TGFb Pitx2 Facteur de transcription Connexin43 Protéine des jonctions gap ZIC3 Facteur de transcription FGF8 Facteur de croissance Furine Sérine protéine Homme Souris Souris Souris Homme Homme Souris Souris Divers défauts de l axe gauche-droit Isomérisme pulmonaire droit,asplénie et hyposplénia, courbure du coeur et retournement de l embryon au hazard Isomérisme pulmonaire gauche Isomérisme pulmonaire droit, défauts de positionnement du coeur, hyposplenie Divers défauts de l axe gauche-droit Situs inversus lié à l X Isomérisme pulmonaire droit, courbure du coeur au hazard. Pas de courbure du coeur, pas de retournement de l embryon Absence de nodal, lefty-1, lefty-2, pitx2 Expression gauche ou bilatérale de lefty-2 Absence de nodal et pitx2 Augmentation de l expression de pitx2, expression gauche ou bilatérale de pitx2 et lefty-2. Positionnement gauche-droit des organes est-il régulé génétiquement?? b) Analyse des mutations et des invalidations phase initiale Modèle possible Altération de la symétrie de l embryon Acquisition d une information G-D phase initiale Transfert de l information G et D au niveau du nœud Puis autour du nœud côté gauche D après Raya et Belmonte, Nature reviews genetics, 2006

b) Analyse des mutations et des invalidations Modèle possible transfert de signaux du nœud vers la plaque mésodermique latérale gauche. Formation de domaines d expression de gènes de morphogenèse droite gauche Transfert d information de latéralité aux ébauches des organes qui en retour exécutent un programme morphogénétique d asymétrie gauche-droite D après Raya et Belmonte, Nature reviews genetics, 2006 c) Analyse des patrons d expression et invalidations de certains gènes La protéine Nodal Shen, Development 2007.

c) Analyse des patrons d expression et invalidations de certains gènes Les protéines Lefty : protéines sécrétées, famille des TGFβ antagonistes de Nodal c) Analyse des patrons d expression et invalidations de certains gènes Le gène Nodal : gastrulation : région postérieure sécrété par le nœud concentrée périphérie du nœud neurulation : cellules du mésoderme latéral exclusivement du coté gauche Nodal serait sous contrôle négatif de BMP, car un mutant null pour Smad5 qui est un médiateur de la voie BMP, présente une expression bilatérale de Nodal. Invalidation du gène : létale, rend impossible l analyse

c) Analyse des patrons d expression et invalidations de certains gènes Le gène Nodal expression dynamique de Nodal Shiratori, et al. Development 2006 c) Analyse des patrons d expression et invalidations de certains gènes Les protéines Lefty Lefty 1 : Au devant du nœud Puis sous forme d une bande constituée de 4-5 cellules (largeur) le long de la chorde et du coté gauche 5.5 6 6.5 gauche

c) Analyse des patrons d expression et invalidations de certains gènes Les protéines Lefty Lefty 2 : gastrulation mésoderme puis dans cellules du mésoderme latéral gauche Lefty 1 Lefty 2 c) Analyse des patrons d expression et invalidations de certains gènes Le gène Nodal et les lefty : L ARNm de nodal est co-distribué avec celui de lefty 2 Lefty 1 Lefty 2 et nodal Puis les ARNm Nodal, lefty 1 et 2 disparaissent à 14 somites Nodal Jours 9.5 Lefty 1 et 2 Jours 9.5

c) Analyse des patrons d expression et invalidations de certains gènes Le gène Pitx2 : Facteur de transcription Coté gauche D G Après lefty et nodal Jours 8 Persiste après disparition de nodal droite gauche Gène cible de nodal? Nodal Jours 9.5 Côté gauche Jours 9.5 c) Analyse des patrons d expression et invalidations de certains gènes Domaine d expression plus large que nodal : Mésoderme latéral Endoderme Cœur Un candidat intéressant est Pitx2 qui est un gène à homéoboîte apparenté à bicoid. Pitx2 est exprimé dans la partie gauche de l embryon, puis de plusieurs organes, comme le coeur, l'estomac, l'intestin ; ceci en fait un excellent candidat pour médier le transfert de l information de Nodal au niveau des organes en développement.

c) Analyse des patrons d expression et invalidations de certains gènes Le gène Pitx2 : Facteur de transcription Gène cible de nodal Suggère que son activation du coté gauche est initiée par la signalisation induite par nodal. Explique son extension à l endoderme, mésoderme, coeur un excellent candidat pour médier le transfert de l information de Nodal au niveau des organes en développement d) Les analyses expérimentales Inactivation du gène lefty2 : phénotype létal, analyse impossible Inactivation du gène lefty1 : isomérie gauche expression bilatérale de lefty 2, nodal et Pitx2 poumon gauche possède un seul lobe (au lieu de 4)

d) Les analyses expérimentales Interprétation possible : l expression de nodal dans la région gauche se traduit par une perte d asymétrie G-D. La voie de signalisation Nodale semble être une signalisation d asymétrie qui induit une morphogenèse de type gauche. gauche d) Les analyses expérimentales Interprétation possible : Puisque lefty1 est un antagoniste de nodal exprimé au niveau de la ligne médiane, on peut suggérer que l expression de lefty1 bloque la signalisation nodal, la signalisation gauche Donc empêche la diffusion information «gauche» droite

d) Les analyses expérimentales L inactivation du gène Pitx2 : provoque un isomérisme pulmonaire droit et des anomalies cardiaques. Au niveau pulmonaire : quatre lobes pour chacun des poumons. D G Jours 8 Interprétation : Puisque le gène Pitx2 code un facteur de transcription et qu il est exprimé dans le mésoderme latéral gauche, ce résultat suggère qu il active l expression de gènes impliqués dans la morphogenèse gauche. Ces gènes ne sont pas encore identifiés. Il pourrait donc être un des élément de la dernière phase de la mise en place de l asymétrie gauche-droite. d) Les analyses expérimentales Un premier bilan ARNm nodal Pourquoi nodal ne diffuse pas du côté droit??? Noeud Protéine nodal postérieur Gauche ARNm antérieur

d) Les analyses expérimentales Un premier bilan Le mécanisme de réaction-diffusion pour donner une information de position D après Shen, Development 2007. d) Les analyses expérimentales Pourquoi nodal ne diffuse pas du côté droit?? Épithélium respiratoire, Système reproducteur, Système nerveux Jours 8 Peau (kératinocytes), tubules rénaux Cellules endothéliales, le noeud Structure d un monocile

d) Les analyses expérimentales Un premier lien entre l'asymétrie droite gauche et les cils/flagelles a été mise en évidence par l'observation d'un syndrome humain, le syndrome de Kartagener (1985). Le situs inversus est accompagné de plusieurs autres problèmes: sinusite chronique, otites, bronchites, infertilité, càd des tissus ciliés ou flagellés. Il a été mis en évidence qu'une dynéine était mutée chez ces patients. L analyse d un mutant souris (inversus viscerum -iv- où 50% sont normaux et 50% inversés) apporte un soutient fort à cette hypothèse, puisque la molécule responsable de cette mutation est un type particulier de dynéine (exprimé dans certaines cellules ciliées, appelée left-right dynein, LRD) et qui fait partie de la machinerie moléculaire permettant le mouvement des cils. D autres mutants souris de kinésine présentent le même genre de phénotype. La Dynéine et la Kinésine sont des protéines "moteurs" qui utilisent l'énergie provenant de l'hydrolyse de l'atp pour se déplacer le long des microtubules. La mutation de Tg737, qui lui aussi appartient à la machinerie de transport intraflagellaire, entraîne aussi la perte des cils du nœud et une courbure au hasard du cœur. d) Les analyses expérimentales un monocil de 5 à 10 micromètres de long ARNm dynéine Tubuline acétylée - Les mutations de KIF3A et de KIF3B entraînent la perte complète des cils du noeud, et un défaut de mise en place de l asymétrie droite-gauche. La courbure du cœur se fait au hasard chez ces mutants qui montrent de graves défauts du développement et ne sont pas viables. KIF3A et KIF3B appartiennent à la famille des kinésines hétérotrimériques et sont nécessaires au transport intraflagellaire et à la formation des cils. Lorsque le transport intraflagellaire se fait mal, les cils déjà existant disparaissent et ne se reforment plus. Quel est le mouvement des cils??

d) Les analyses expérimentales Distribution des cils Billes fluorescentes et vidéocinématographie : se déplacent vers la gauche Pas d orientation à priori d) Les analyses expérimentales

d) Les analyses expérimentales Mouvement de droite à gauche et génèrent un flux (10 à 20 micromètres/seconde) qui est le premier événement à casser la symétrie de l embryon. Ce flux se produit seulement pendant quelques heures pendant le stade tardif de plaque neurale et s arrête avant l apparition des premiers somites, alors qu aucune asymétrie n est encore détectable. Shiratori et al. Development 2006 d) Les analyses expérimentales Deux modèles possibles Shiratori et al. Development 2006

d) Les analyses expérimentales Signification fonctionnelle de ce courant orienté vers la gauche?? Le flux pourrait être à l origine d un gradient de morphogène déplacé vers le coté gauche du nœud, qui pourrait interagir avec son récepteur et déclencher une cascade d expression asymétrique de gènes comme nodal et Pitx2 (à gauche). Mais ce modèle implique une coordination très précise entre la cinétique de synthèse, d attachement et de dégradation du morphogène, et le flux nodal. Il implique aussi une coordination des cils du nœud. Le morphogène pourrait être nodal lui-même ou bien une autre protéine comme sonic hedgehog par exemple. Comment peut on vérifier que le flux active l expression asymétrique de gènes? d) Les analyses expérimentales Changer le flux nodal?? Flux intrinsèque Flux artificiel

d) Les analyses expérimentales Changer le flux nodal?? l asymétrie gauche droite est réversée Flux vers la gauche nodal Flux vers la droite nodal Cœur à gauche mésoderme latéral Cœur mésoderme latéral d) Les analyses expérimentales Flux vers la droite Flux vers la gauche Mésoderme latéral noeud Nodal est exprimé dans le mésoderme latéral droit La distribution de nodal est inversée

d) Les analyses expérimentales mutation récessive : inversum viscerum (gène iv) : courbure aléatoire du tube cardiaque positionnement aléatoire des organes Pitx2 : aléatoire d) Les analyses expérimentales mutation récessive : inversum viscerum (gène iv) : courbure alèatoire du tube cardiaque positionnement aléatoire des organes

d) Les analyses expérimentales mutation récessive : inversion of embryonic turning (gène inv) : homozygotes : inversion complète du retournement inversion complète des organes 100% situs inversus Nodal symétrique dans le noeud Pitx2, lefty2 à gauche Pitx2 d) Les modèles : Le modèle du flux nodal Vidéocinématrographie : Courant orienté vers la gauche Change flux nodal: l asymétrie gauche droite est réversée

e) Données récentes Les cils mécanosensoriels - la polycystine-2 est localisée au niveau des cils des cellules rénales. - La polycystine-2 est une glycoprotéine transmembranaire qui forme un canal calcium dans la membrane. - Le gène codant pour cette protéine (Pkd2) est muté dans une maladie autosomique dominante humaine, la human polycystic disease. - Les souris mutées pour Pkd2 présentent un développement droite-gauche anormal, des défauts de division en deux parties du cœur et des kystes rénaux et pancréatiques et meurent avant la naissance. - Des souris possédant des kystes rénaux présentent aussi souvent des anomalies des cils. - Donc le fait que la polycystine-2 et la polycystine-1 qui lui est associée se situent au niveau des cils du rein a permis de faire l hypothèse que les cils étaient le lien entre la polycystic disease et l asymétrie droite-gauche. - Des études ont montré que l application d un flux au niveau des cellules rénales ciliées était à l origine d un rejet de calcium intracellulaire, à condition que les cils soient intacts et que la polycystine-2 soit fonctionnelle. Il a ensuite été postulé que les cils des cellules rénales agissent comme des mécanosenceurs et «sentent» le flux de liquide au niveau du rein la polycystine-2 converti ce flux en un signal calcique, permettant la maturation du rein. e) Données récentes Les cils mécanosensoriels La polycystine est localisée coté gauche Expérimentalement : augmentation du calcium du côté gauche Ca ++ Le flux crée du côté gauche une pression sur des cils mécanosensoriels Transduction d un signal qui augmente le Ca++ dans les cellules du coté gauche du noeud

e) Données récentes Les jonctions Gap La polycystine est localisée coté gauche polycystine Côté gauche e) Données récentes le modèle des deux cils Inversine : Protéine cytoplasmique Interaction protéine-protéine Calmoduline Ca++

e) Données récentes FGFR1 FGFR2 FGFR3 phosphotyrosine + SU5402 Vue ventrale à 7.5 jours e) Données récentes vésicules

e) Données récentes Lipides membranaires marqués avec du DiI, observation au confocland Mouvement des vésicules vers la gauche e) Données récentes Le flux de vésicules est inhibé par 20 mm SU5402

e) Données récentes Les vésicules prennent naissance à droite à partir d un cil (rouge) e) Données récentes Fragmentation des vésicules du côté gauche

e) Données récentes Restauration du flus de vésicules par Shh lors de l incubation avec SU5402 e) Données récentes Restauration du flus de vésicules par AR lors de l incubation avec SU5402

e) Données récentes Mutant iv/iv. Mouvements Brownien e) Données récentes Mutants kif3a -/- (pas de cils). Pas de flux.

e) Données récentes Dominant négatif iv/iv intensité du signal : rouge> vert > bleu > noir e) Données récentes Billes fluorescentes + SU5402 indépendant de la signalisation FGF

e) Données récentes vidéo inhibiteur e) Données récentes Un modèle possible Shiratori et al. Development 2006

e) Données récentes Un modèle possible e) Données récentes Un modèle possible

Bilan Un modèle possible De nombreuses questions restent encore sans réponse : - comment sont orientés les cils par rapport à l axe antéro-postérieur? - comment les cils du nœud sont-ils coordonnés afin de générer un flux nodal? - comment un signal asymétrique (flux nodal) peut-il mener à une expression asymétrique de gènes comme nodal? Cibles de Pitx 2 - comment une expression génique asymétrique peut-elle mener à une organogenèse asymétrique? - Quid à droite?? EPIGENESE