Dipl. Natw. ETH. Accepted on the recommendation of. FROM Candida tropicalis IN Saccharomyces cerevisiae CONTINUOUS CULTURE

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1 Diss. ETH No EXPRESSION STUDIES OF THE CYTOCHROME P450alk GENE FROM Candida tropicalis IN Saccharomyces cerevisiae IN CONTINUOUS CULTURE A dissertation submitted to the SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZUERICH for the degree of Doctor of Natural Sciences Presented by ISABELLA BERETTA Dipl. Natw. ETH Born May 26,1955 Citizen of Lugano Tl Accepted on the recommendation of Prof. Dr. A. Fieehter, examiner PD Dr. O. Käppeli, co-examiner Zürich 1990

2 1 Summary The alkane indudble cytochrome P450 gene (P450alk) from C. tropicalis, was expressed into S. cerews/aegrf18 (oc, />/s3-11, Ws3-15, /eu2-3, /eu2-112) using a replicative and an integrative system. The expression cassette consisted of the P450alk gene inserted between the alcohol dehydrogenase I and terminator. (ADHI) promoter Continuous cultures of the P450alk expressing yeast at varied dilution rates and histidine concentrations in the medium showed that heterologous expression was obtained with efficiency only under oxido-reductive growth conditions. One drawback of plasmid-based expression Systems is their mitotic instability. In S. cerevisiae GRF18/509-6, that eontained a replicative plasmid, P450alk could be detected over 150 generation maximally, with a steady decrease in the content of the heterologous protein. Southern blot analysis showed that the P450alk expression cassette was no more present in the majority of these cells. Since the aspect of expression stability is very important for the maintenance of a desired recombinant protein production, integration of the P450alk expression cassette into the host genome through an integrative vector was carried out, resulting in a more stable construction (GRF18/IB1). In continuous cultures, a stable expression over more than 350 generations was achieved. After this number of generations, a constant content of cellular P450alk was still maintained corresponding to the same level as measured at the beginning of the cultivation. Following the Observation that P450alk was detectable under oxido-reductive cultivation conditions only, as determined by spectrophotometric analysis, a more detaiied investigation of this phenomenon was undertaken. Analysis of P450alk mrna and protein content showed that increasing dilution rates were accompanied by an increase in P450alk mrna and corresponding protein levels. Consequently, it was concluded that cultivation conditions exert a regulatory effect on the ADHI promoter. The functionauty of P450alk was tested by in vitro assays using microsomal fractions of GRF18/ As for the monooxygenase activity the C. tropicalis NADPH-cytochrome P450 reductase (NCPR) is of importance, the NCPR gene was overexpressed by insertion into pds509-6, to yield GRF18/509-6R. The resulting increase in NCPR activity yielded a doubling of the hydroxylation

3 activity of microsomal fractions. Furthermore, whole yeast cells were used in hydroxylation assays with lauric acid as the model Substrate to test the applieability of the recombinant cells for bioeonversion of fatty acids to oxidated products. Hydroxylated fatty acid and dicarboxylic acid could be detected mostly in the culture supematant. The product recovery was poor. However, the Volumetrie productivity could be increased by using higher cell densities in growing or resting cell cultures.

4 3 R6sumö Le gene du cytochrome P450 induit par les aicanes (P450alk) de C. tropicalis a gtg exprimg chez S. cerews/aegrf18 (a, Ws3-11, /7/S3-15, teu2-3, teu2-112), en employant un Systeme replicatif et integratif. La cassette d'expression comprenait le cytochrome P450alk insere entre le promoteur et le terminateur du gene de ralcool-deshydrogenase I [ADHI). Des cultures continues de la levure exprimant P450alk, avec des taux de dilution et des concentrations d' histidine dans le milieu de culture variöes, ont dgmontrg que l'expression heterologue ne pouvati etre obtenue que dans des conditions de croissance oxido-reductives. Un inconvenient des systemes d'expression code par un Plasmide est leur instabilitö mitotique. Chez S. cerews/ae GRF18/509-6, qui contenait un Plasmide replicatif, P450alk etait detectable pour un maximum de 150 generations avec un declin continu dans la concentration de la proteine hetörologue. Par l'analyse d'adn genomique ("Southern blot"), il y gtg prouve que la cassette d'expression de P450alk n'etait plus presente dans la plupart de ces cellules. Comme l'aspect de la stabilite d'expression est tres important pour le maintient de ia production d'une proteine recombinante, l'integration de la cassette d'expression de P450alk dans le ggnome de I' höte avec un Plasmide integratif füt entreprise et une construction decisivement plus stable en resultait (GRF18/IB1). Les experiences de cultures continues avec cette nouvelle souche ont montre une expression stable pour plus de 350 generations. Apres ce nombre de ggngrations, un taux constant de P450aik cellulaire gtait ggalement mantenu, eorrespondant au meme niveau mesure au dgbut de la culture. L'observation que P450alk n'gtait dgtectable que dans des conditions de culture oxido-reductive, comme determine par des analyses spectrophotomgtriques, conduisit ä une investigation plus dgtaillge de ce phenomene. Des analyses du mrna et du contenu en proteine ont montrg qu'une augmentation du taux de dilution gtait aecompagng par une augmentation du taux de mrna de P450alk et de cette mgme protgine. Ces observations montrerent done que le promoteur de YADHI est soumis ä une rggulation determinee par les conditions de culture continue. La fonetionaiitg du P450alk a gtg gtudige par des essais in vitro employant des fractions microsomales de GRF18/ Comme pour l'activitg de la

5 monooxyggnase, la NADPH-cytochrome P450 reductase (NCPR) de C. tropicalis a une importance, le gene de NCPR fut sur-exprimge par insertion dans pds509-6, pour obtenir GRF18/509-6R. Une augmentation de l'activitg specifique de NCPR en resultait ainsi qu'un doublement de l'activitg d'hydroxylation de l'acide laurique dans les fractions microsomales. En outre, des ceiiuies de levure entigres ont gtg employges dans des essais avec de l'acide laurique comme Substrat modele, ce que entre-ouvre la possibilitg d'utilisation de ceiiuies recombinantes pour la bioeonversion d' acides gras en produits oxydes. De l'acide gras hydroxylg et de l'acide dicarboxylique ont gtg determing dans le surnageant de la culture. La quantitg rgcupgrable du produit a gtg pauvre. La produetivitg volumetrique pouvait gtre augmentg en employant de plus hautes densitgs cellulaires dans des cultures de ceiiuies croissantes et noncroissantes.