HIBRYDATION IN SITU METHODOLOGIE EN ANATOMIE PATHOLOGIE SESSION
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- Monique St-Pierre
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1 METHODOLOGIE EN ANATOMIE PATHOLOGIE SESSION HIBRYDATION IN SITU Dr Mokrane Yacoub. AHU Histologie Faculté de médecine de Poitiers Service d anatomie pathologique
2 PLAN I- Définition et principes de l hybridation in situ II- Matériel A - Les sondes B - Marquages C - Détection du signal III- Contrôles de la spécificité d hybridation lv- Méthodes et Protocoles V- Références
3 I- Définition et principes de l hybridation in situ
4 Définition et principes de l hybridation in situ
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7 II- Matériel
8 A- Les sondes
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14 B- Marquages
15 Les marquages Selon la nature de la sonde : ADNc : nick-translation ou random priming ou PCR ARN : transcription in vitro Oligonucléotide : 3 tailing
16 1. Marquage des sondes ADN
17 1. Marquage des sondes ADN
18 1. Marquage des sondes ADN
19 1. Marquage des sondes ADN
20 2. Marquage des sondes ARN
21 2. Marquage des sondes ARN
22 3. Marquage des Oligonucléotides
23 3. Marquage des Oligonucléotides
24 C- Détection du signal
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36 III- Contrôles de la spécificité d hybridation
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38 IV- Méthodes et Protocoles
39 Nature des tissu Tissu frais Tissus congelés -80 Tissu fixé dans le formaldéhyde à 4% pendant 12 h et mis dans le sucrose pendant 24-48h Fixé et inclus en paraffine (sensibilité moins bonne)
40 ABut : Pré Traitement - permettre à la sonde marquée d atteindre l acide nucléique - réduire le bruit de fond, et les liaisons non spécifiques 6) Post fixation : Inactiver les Rnases Endogènes 8) Perméabilisation et déprotéinisation : (les liaisons covalentes de la PFA empêchent l accès aux sondes dans la cellule) - Pérméabilisation: destruction partielle des membranes cellulaires Détergent (Triton, saponine ), éthanol, enzymes (lipases) - Déprotéinisation: protéines endogènes associées aux acides nucléiques 3) Acétylation : élimine le bruit de fond en se fixant sur des site de fixation non spécifique (masque les fonctions amines) 4) Préhybridation: saturer les sites de fixation non spécifiques Incubation du tissu avec le tampon d hybridation
41 B- Hybridation Incubation les coupes avec la sonde marquée en présence du tampon d hybridation à une température permettant une HIS spécifique Température de fusion: stabilité énergétique de l hybride (Tm) Tampons d hybridation - Formamide désionisée : abaisse Tm (moins agressives pour la morphologie) déstabilise les liaisons hydrogènes - Tampon SSC ph7 : abaisse Tm, les ions Na+ interviennent dans la concentration en cation (force ionique), stabilité de l hybride - DiThioThréitol (DTT): pour les sondes marquées au soufre 35 - Sulfate de dextran: HIS sur lame (aug la concentration de sonde) - ARNt de levure, ADN de sperme de saumon, solution de Denhardt s: sature des liaisons non spécifiques par compétition avec des macromolécules - DiEthylPyroCarbonate (DEPC): inhibiteur des RNases
42 C- Lavages Eliminer l excès de sonde non hybridée et dissocier les hybrides illégitimes (diminuer le bruit de fond) -Lavages successifs : bains en Tampon SSC de concentration décroissante -TRT par RNase A : dégrader les sondes non hybridées Protocoles doivent être adaptés au système matériel/sonde utilisé
43 D- Détection du signal Révélation de l haptène incorporé dans les Hybrides - Méthode - Soit immunologique basés sur des réactions AG-AC - Soit enzymatique basés sur des réactions ligand-anti ligand - Visualisées par le produit d une réaction enzymatique (peroxydase, phosphatase alcaline) ou par émission de fluorescence (fluorescéine.) - Les conjugués enzymatiques sont révélés par des chromogènes de différentes couleurs :. Pour la phosphatase alcaline (NBT-BCIP bleu foncé, INT/BCIP rouge). Pour la peroxydase (DAB marron, AEC rouge) E- MONTAGE Préférable d utiliser un montage aqueux de type Mowiol
44 F- Visualisation
45 V- Références
46 V- Références - Sites CHU Pitié salpêtrière Paris - In situ Hybridization Protocols. Darby A and Tim D. Hewiston. (2006) Third Edition. Methods in Molecular Biology. Humana press. - Histological detection of messenger RNAs With biotinylted synthetic oligonucleotide probes. A.F.Guitteny (1989). J.Histochem.Cytochem.36,PP; Hybrydation In Situ. O.Devergne, M.Peuchemaur et D.Emilie.(1991) Société Française d Immunologie, Les Editions INSERM.
47 Fin
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