Agenda. Introduction Concept de l apoptose Bases moléculaires de l apoptose Apoptose et pathologies Apoptose et cancer

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2 Agenda Introduction Concept de l apoptose Bases moléculaires de l apoptose Apoptose et pathologies Apoptose et cancer

3 Objectifs Le but de ce cours est : d'apporter des connaissances théoriques sur l aspect de l apoptose et la mort cellulaire. d'apporter des connaissances sur les mécanismes moléculaires de l apoptose Régulation de l'apoptose Les signaux : voies intrinsèque et extrinsèque La mitochondrie : Bcl2, t-bid, cytochrome C, Apaf Les caspases et les inhibiteurs Physiopathologies liées à l apoptose

4 La cellule oscille entre la vie et la mort

5 Concept de l apoptose

6 Tu t es déshonoré toimême et ton organisme. Cellule-San! Je ne peux servir à la vie Autant mourir en samouraï L APOPTOSE L harakiri cellulaire

7 Stresse, besoins en augmentation Stimuli blessants Incapacité d adaptation

8 intro

9 L'apoptose (du grec ancien ἀπόπτωσις, apóptôsis : apo - au loin et ptosis - chute) a été mise en évidence en 1972 par John Kerr, Andrew Wyllie et Alastair Currie lors de l'étude de tissu par microscopie électronique «Ce mot provient d'une locution grecque évoquant la «chute des feuilles»

10 Présentation de l apoptose Définition de l apoptose L apoptose est une forme de mort cellulaire également appelée «mort cellulaire programmée», au cours de laquelle un programme de suicide est activé à l intérieur de la cellule. L apoptose est un phénomène normal, très régulé, permettant aux organismes pluricellulaires : de réguler leur nombre de cellules ; d éliminer des cellules normales qui ne sont plus nécessaires ; d éliminer des cellules anormales qui représentent un danger pour l organisme (cellules infectées, cellules dont l ADN est muté ). La nécrose, quand à elle, est une mort cellulaire accidentelle.

11 Étiologie de la mort cellulaire

12 Comparaison entre apoptose et nécrose Gonflement cellulaire Destruction des organites Rupture de la membrane plasmique Libération du contenu cytoplasmique et des enzymes lysosomaes lésion des cellules voisines Inflammation Cicatrisation anarchique par prolifération des fibroblastes Processus passif Condensation de la chromatine Fragmentation de l ADN en segments réguliers Fragmentation du noyau Maintien de l intégrité des organites Maintien de l intégrité de la membrane plasmique Fragmentation de la cellule en corps apoptotique Modification de la membrane plasmique (passage de phosphatidylsérine vers l extérieur) Phagocytose des corpos apoptotiques Pas de libération du contenu cytoplasmique Pas de processus inflammatoire Pas de cicatrisation: les cellules environnantes comblent l espace vide Processus actif

13 apoptose physiologique Elle est en équilibre constant avec la prolifération Processus physiologique normal intervenant dans: Développement des organismes pluricellulaires Homéostasie tissulaire chez l adulte Défense contre des agents pathogènes mise en place d une cavité au sein d un organe initialement «plein» Rôle de l apoptose dans la formation de la lumière des acini de cellules MCF-10A

14 apoptose physiologique a) Apoptose et développement Ex. 1 : Caenorhabditis elegans. Ver transparent d 1 mm de long, vivant dans le sable et ayant une durée de vie très courte (2 semaines). La cellule œuf donne cellules dont 131 meurent par apoptose au cours de son développement.

15 Prix Nobel Médecine 2002 Robert H. Horvitz Prix Nobel Médecine 2002 La majeure partie de nos connaissances actuelles sur les mécanismes de la régulation de l apoptose provient des travaux menés sur le nématode Cænorhabditis elegans.

16 Le suicide au service de la créativité! a) Apoptose et développement Ex. 2 : Sculpture des doigts de la patte de souris. Les pattes apparaissent sous forme d une structure «en forme de pelle» et les doigts ne se séparent que quand les cellules situées entre eux meurent par apoptose. (A) formation des doigts Apoptose incomplète

17 Rôles de l apoptose a) Apoptose et développement Ex. 3 : Système immunitaire. Dans le thymus, les lymphocytes T reconnaissant le soi sont éliminés par apoptose pour éviter les réactions auto-immunes.

18 Rôles de l apoptose b) Apoptose dans les tissus adultes Dans les tissus adultes, l apoptose équilibre exactement la division cellulaire. Si ce n était pas le cas, le tissu se développerait ou rétrécirait. Exemple : Foie de rat : Si une partie du foie est éliminée chez un rat adulte, la prolifération du tissu hépatique augmente pour rattraper la perte. Si un rat est traité au phénobarbital (= médicament qui stimule la division cellulaire et donc l hypertrophie du foie), après arrêt du traitement, on constate que l apoptose augmente jusqu à ce que le foie retrouve sa taille d origine (environ 1 semaine).

19 Rôles de l apoptose L apoptose est une forme de mort cellulaire active qui nécessite la participation de la cellule pour sa propre mort par le biais d'événements intracellulaires qui sont en fait placés sous contrôle génétique Evènement intracellulaires de l apoptose - Gonflement des mitochondries - Augmentation massive du calcium cytosoliques - Libération des molécules photogènes mitochondriales (cytochrome C, caspases,,,)

20 Hallmarks d apoptose Un processus apoptotique s'accompagne, au niveau cellulaire, de modifications morphologiques dont les principales sont les suivantes : Altération mitochondriale Fragmentation de l ADN Altération de la membrane plasmique Activation des caspases

21 Morphologie de cellules apoptotiques

22 BLEBBING des cellules:

23 BLEBBING des cellules:

24 Un signal de mort! D un point de vue biochimique, l apoptose est provoquée par un signal de mort comme un manque de facteurs de croissance, un manque d oxygène ou d autres molécules. Ce signal perçus par la cellule engendre une réponse stéréotypée.

25 Caractères biochimiques cytosol cytosol = Phosphatidylserine

26 Caractères biochimiques fixation de l annexine sur la surface membranaire

27 au niveau membranaire Ca 2+ PS Ca 2+ Entrée capacitative de Ca 2+ Ca 2+ Mécanismes intracellulaires qui règlent l externalisation de la phosphatidylsérine. Après une stimulation, le calcium (Ca 2+ ) est libéré à partir des réservoirs intracellulaires. La déplétion de ces stocks conduit à l activation de canaux calciques localisés dans la membrane plasmique et à un influx de calcium

28 Clairance des cellules apoptotiques

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30 Les trois phases de l apoptose

31 Bases moléculaires de l apoptose

32 Activée par des stimuli divers: (physiologiques, pathologiques, expérimentaux) Stimulation de «récepteurs de mort» Carence en facteurs trophiques Agents génotoxiques (rayons γ, rayons UV) Chocs thermiques, osmotiques Détachement de la matrice extracellulaire («anoïkis») Drogues cytotoxiques (dexaméthasone, staurosporine,.) Virus, bactéries

33 Les caspases, protéases de l apoptose (cysteine aspartic acid-specific proteases) L apoptose dépend d une famille de protéases : les caspases. Celles-ci contiennent une cystéine sur leur site actif et coupent leur substrat protéique au niveau d acides aspartiques spécifiques. Les caspases sont exprimées sous forme de pro enzymes inactives appelées formes zymogènes ou pro-caspases (30 à 50 kda).

34 Les caspases, protéases de l apoptose Toutes les cellules synthétisent des caspases sous forme de précurseurs inactifs : les procaspases. L activation des procaspases est étroitement régulée. Il existe deux familles de caspases : les caspases initiatrices (ex : caspases 8 et 9) et les caspases effectrices (ex : caspase 3).

35 Conséquence de l activation des caspases Fragmentation de Fragmentation du Fragmentation de la cellule Fragmentation de l ADN noyau «blebbing» de la membrane GOLGI

36 Les voies de la mort voie intrinsèque et extrinsèque

37 L activation de l apoptose L activation de l apoptose peut se faire : de l extérieur de la cellule (voie extrinsèque) : c est la voie des récepteurs de mort de l intérieur de la cellule (voie intrinsèque) : c est la voie mitochondriale. Coloured scanning electron micrograph (SEM) of a cell undergoing apoptosis.

38 Signaux : voie intrinsèque et extrinsèque Death Ligand MILIEU EXTRACELLULAIRE Stimuli Apoptotique Récepteur de la mort BID clivé Caspase-8 BID Apoptosome Caspase-9 CYTOSOL APOPTOSE

39 Un exemple de récepteur de mort : Le récepteur Fas - Les lymphocytes T induisent la mort de leurs cellules cibles par apoptose. - Ces lymphocytes expriment une protéine appelée ligand Fas (Fas-L). - Fas-L se fixe spécifiquement sur un récepteur exprimé à la surface des cellules cibles : le récepteur de mort Fas (Fas-R). La liaison Fas-L/Fas-R entraîne la mort des cellules cibles.

40 Un exemple de récepteur de mort : Le récepteur Fas TNF α (ligand) La partie extracellulaire de Fas-R porte des domaines CRD (Cystein Rich Domain) riches en cystéines et reconnaissant le ligand Fas (Fas-L). Domaine CRD TNFR1 La partie cytosolique porte un domaine DD (Death Domain), indispensable à la transduction du signal. Domaine DD FADD TRADD Pro-Caspase-8 TRAF-2

41 Transduction du signal (exemple des récepteurs Fas) 1) Fas-L se fixe sur la partie extracellulaire de Fas-R. 2) Fas-R se trimérise Changement de conformation des domaines DD. 3) Mise en place du complexe sous-membranaire DISC (Death Inducing Signaling Complex) : Le complexe DISC résulte de l association, sous la membrane plasmique, de Fas-R avec FADD et les procaspases 8. Remarque : La procaspase 8 est initiatrice. Elle contient un prodomaine DED qui permet son interaction avec FADD. La procaspase 3 est effectrice. Elle ne contient pas de prodomaine.

42 La voie mitochondriale Modification de la perméabilité AIF membranaire relargage de certaines protéines (AIF CytC proapoptotiques) Cytochrome C H +

43 La voie mitochondriale Formation de l apoptosome implique la formation d un complexe cytosolique appelé APOPTOSOME. Celui-ci comprend : Le cytochrome c La procaspase 9 : procaspase initiatrice qui possède un prodomaine CARD (CAspase Recruitment Domain). La molécule Apaf-1 (Apoptotic protease activating factor-1) : Exon

44 Apaf-1 beauté fatale! protéine adaptatrice faisant le lien entre le cytochrome c et les procaspases 9. Apaf-1 possède un domaine CARD faisant des interactions homophiles avec le prodomaine CARD des procaspases 9 et un domaine WD40 lui permettant d interagir avec le cytochrome c.

45 Cytochrome C Oxidase: en cavale c est mortel transporteur mobile d électrons de la chaîne respiratoire mitochondriale. Il est normalement localisé dans l espace intermembranaire des mitochondries.

46 Résumé du déroulement de la voie mitochondriale de l apoptose Cyt C Domaine WD40 Prodomaine CARD APOPTOSE Pro-caspase 9 (active) Domaine CARD Apaf-1 Pro-caspase 9 (inactive) Grosse SU Petite SU 1) Libération de cytochrome C mitochondrial dans le cytosol. 2) Recrutement d Apaf-1 au niveau du cytochrome c. 3) Recrutement des procaspases 9 et mise en place de l apoptosome (pour des raisons de simplification, seulement 2 molécules d Apaf-1 sont représentées dans l apoptosome au lieu de 7). 4) Activation mutuelle des procaspases 9 par protéolyse mutuelle. 5) Activation des procaspases 3 (effectrices) par les caspases 9.

47 Si la balance penche en faveur de la mort cellulaire, la cellule déclenche l apoptose : son noyau se fragmente et la cellule se fractionne en petites vésicules qui seront captées et éliminées par des macrophages

48 Régulation de la voie mitochondriale

49 a) Les protéines de la famille Bcl-2 Les protéines de la famille Bcl-2 ont un rôle dans la régulation de la voie mitochondriale : Bcl-2 et Bcl-XL sont anti-apototiques car elles bloquent la libération de cytochrome c par la mitochondrie. Bad, Bax, Bak et Bid sont pro-aptotiques et agissent par des mécanismes différents : Bad se fixe sur certaines molécules anti-apoptotiques et les inactive ; Bax et Bak stimulent la libération de cytochrome c par la mitochondrie ; Bid active Bax et Bak.

50 b) Déclenchement de la voie mitochondriale La voie mitochondriale peut se déclencher de deux façons : 1) Lorsque la voie des récepteurs de mort est activée, les caspases 8 clivent Bid entraînant son activation. tbid active Bax et Bak. 2) Lorsque l ADN est endommagé, la protéine régulatrice de gènes p53 s accumule et stimule la transcription de gènes qui codent des protéines pro-apoptotiques telles que Bid, Bax et Bak. Dans les deux cas, la conséquence est la libération de cytochrome c par les mitochondries.

51 Voies de mort cellulaire alternatives

52 Necroptose : une «Nécrose programmée»! processus biologique découvert récemment et qui se caractérise par une mort cellulaire par nécrose grâce à des facteurs liés à l'apoptose. La nécrose programmée est à distinguer de la nécrose classique En raison de l'existence de circuits moléculaires dédiés, le terme de «nécrose programmée» fut inventé pour distinguer la nécrose induite par des TNF (Tumor Necrosis Factor) de celles induites par un traumatisme non spécifique (blessure par exemple). Il s'agit donc d'un processus actif, et non passif

53 Necroptose : une «Nécrose programmée»!

54 ANOIKIS (Frisch et al. JCB 1994) - Mort cellulaire déclenchée suite à la perte de contact d une cellule épithéliale avec la MEC perte de l engagement des intégrines forme d apoptose les fibroblastes normaux ne sont pas sensibles les cellules épithéliales sont protégées dans certaines conditions: Surexpression de BCL-2 Expression d oncogène Talin vinculine a- actinine FAK + Actine =>protège contre la prolifération ectopique de cellules (altération de l architecture tissulaire) Signalisation «outside-inside» des intégrines

55 Apoptose et pathologies

56 Apoptose et pathologie Processus d apoptose activation Exemples : Peu fine, neurodégénérescence Exemples : cancer athérosclérose

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58 Apoptose et pathologie Maladies associées à une dérèglement du processus apoptotique Maladies neurodégénératives, maladies auto-immunes, Cancers

59 Mutations dans les tumeurs humaines L'analyse moléculaire des mutations somatiques présentes dans les tumeurs a révélé que de nombreux gènes agissant sur les voies de signalisation et d'exécution de l'apoptose sont affectés dans les tumeurs. Fas NFκB ciap2 TMSL Cytochrome C Caspase-9 Apaf-1 Caspase-3 p53 Bax Bcl-2

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61 Conclusion : l apoptose

62 Résumé : Cette forme de mort cellulaire est indispensable à la survie et au bon fonctionnement de l organisme. Elle se déclenche à réception de signaux qui activent un processus de fragmentation de l ADN des cellules. l apoptose peut être consécutive à une agression physique ou chimique mais que ce phénomène est également requis au cours de nombreux processus physiologiques, tels que le développement embryonnaire et le renouvellement des tissus adultes, et pathologiques (atrophies tissulaires).

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