République du Sénégal Ministère de la Santé et de la Prévention Réseau National de Laboratoires * * * * * * * * * *

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1 République du Sénégal Ministère de la Santé et de la Prévention Réseau National de Laboratoires * * * * * * * * * * MICROSCOPIE EN BACTERIOLOGIE-VIROLOGIE RESAOLAB Convention de Financement N AFD CZZ C

2 Introduction Examen microscopique : mise en évidence bactéries et virus Microscopes optiques, à fond noir, à fluorescence: forme, constituants Microscope éléctronique : ultrastructure

3 Microscopie en Bactériologie

4 EXAMEN MICROSCOPIQUE I. Examen sans coloration II. Examen après coloration 1. Colorations simples 2. Colorations différentielles 3. Colorations spécifiques III. Examen après réaction d Immunofluorescence

5 Examen sans coloration Etat Frais

6 Examen sans coloration = Examen à l'état frais 1-A partir d une suspension bactérienne -Technique Déposer sur la lame une goutte de la suspension à l aide d une pipette pasteur débouclée Recouvrir de lamelle couvre- objet propre Eviter d enfermer des bulles d air Le liquide ne doit pas déborder (sinon jeter la lame dans une solution désinfectante et recommencer) Observer au microscope à l objectif 40 x, condenseur abaissé, sans huile à immersion Réseau National de Laboratoires - Module microscopie - Avril 2012

7 Examen sans coloration = Examen à l état frais -Lecture Apprécier la flore bactérienne: présence ou absence; abondance, morphologie (bacilles, cocci, spirilles), mobilité Lors de la pose de la lamelle, des flux liquidiens entraînent toutes les bactéries dans le même sens et à la même vitesse Des bactéries sont considérées comme mobiles lorsque des trajets très différents sont observés (déplacement dans toutes les directions).

8 Examen sans coloration = Examen à l état frais -Lecture Veiller à observer une grande partie de la lame, mais ne pas prolonger l observation au-delà de 3 à 10 minutes Nepas hésiter àrecommencer Après observation, jeter la lame dans un bac contenant un désinfectant à large spectre car les bactéries sontvivantes

9 Examen sans coloration = Examen à l état frais ATTENTION! Une bactérie mobile peut apparaître immobile alors qu elle est flagellée si les conditions de l observation ne sont pas optimales - flagellescassés par la préparation ou détruits par un instrument trop chaud - bactérie provenant d une culture vieille Mobilité influencée par la température d incubation : - certaines bactéries immobiles à 37 C et mobiles à 22 C (Yersinia, Hafnia ). Une bactérie immobileest est animée de mouvements d agitation normaux dits mouvements browniens (agitation moléculaire) : ne pas confondre avec la pas confondre avec la mobilité

10 Examen sans coloration = Examen à l état frais 2-A partir d une culture bactérienne sur gélose -Technique Déposer sur la lame une goutte d eau distillée stérile ou de sérum physiologique Prélever une colonie et faire une suspension homogène dans la goutte d eau en incorporant progressivement l inoculum et en remuant très délicatement (afin de ne pas casser les flagelles) Recouvrir de lamelle -Lecture Procéder comme précédemment

11 Examen après coloration

12 Réalisation d un frottis Frottis= étalement monocouche des bactéries/ lame Déposer sur une lame propre une goutte de suspension ou d eau stérile si la culture prélevée est solide, puis prélever à l aide de l anse de platine une parcelle de la culture Mélanger afin d obtenir une suspension homogène

13 Réalisation d un frottis Réaliser le frottis en partant du centre de la lame, en décrivant avec l anse des mouvements circulaires de façon à obtenir un étalement mince et homogènesur au moins 2/3 de la lame Stériliser l anse Sécher et fixer le frottis au-dessus de la flamme du bec Bunsen sans trop le chauffer Effectuer alors la coloration désirée Rq: avant de colorer, attendre que la lame refroidisse sous peine de cristallisation du premier colorant ou de cassedela lame

14 Réalisation d un frottis

15 Examen après coloration Colorations simples

16 1/Coloration au Bleu de méthylène -Technique Colorations simples Recouvrir le frottis de bleu de méthylène phéniqué Laisser agir 1 minute Rincer abondamment la lame avec le jet d'une pissette d'eau distillée ou à l'eau du robinet jusqu'à élimination des colorants en excès Sécher à l'air ou sur une platine chauffante, ou délicatement entre deux feuilles de papier filtre fin (ou buvard), sans frotter Examiner au microscope, objectif à immersion Réseau National de Laboratoires - Module microscopie - Avril 2012

17 - Résultats Les bactéries sont colorées en bleu sombre Coloration intéressante pour l'observation rapide des frottis mais permet seulement une étude morphologique Nécessité de la compléter par une coloration de Gram, et de May-Grünwald-Giemsapour la reconnaissance des éléments cellulaires - Applications Pus urétral, LCR

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19 2/ Coloration au Giemsa Coloration polychromatique douce Colorant de Giemsa: 3 colorants (bleu de méthylène, azur de méthylène et éosine) éosinated azur de méthyle : -composé qui se forme spontanément dans le mélange -donne des colorations différentes selon le support -Étapes de coloration, épreuve et contre coloration faites simultanément lors de l action du colorant de Giemsa

20 Avantages : conserve mieux les cellules moins agressive que le Gram Permet d observer des bactéries fragiles: spirochètes, spirilles, mycoplasmes etc Permet aussi de mettre en évidence la capsule bactérienne ou les bactéries intracellulaires

21 La technique =«coloration lentede Giemsa» La solution de travail : à préparer extemporanément en diluant au dixième une solution mère (conservée à l abri de l humidité et de la lumière) avec de l eau tamponnée ph=7

22 Réaliser un frottis et le fixer de manière douce (laisser sécher longtemps à l étuve ) Recouvrir desolution de Giemsa(diluée) et laisser colorer 30 minutes (cuve à coloration) Eliminer le colorant et rincer à l eau tamponnée.. Rincer ensuite à l eau du robinet Sécher entre deux feuilles de papier absorbant et observer à l objectif 100 à immersion

23 Examen après coloration Colorations simples 2/Coloration au Giemsa EPEC: adhésion localisée EAEC: adhésion agrégante Hep-2 E. coli

24 Examen après coloration Colorations différentielles

25 Examen après coloration Technique générale d une coloration En général, les colorations en bactériologie suivent un même principe qui peut se définir en 3 (éventuellement 4) étapes: COLORATION (résultat positif à la fin) Mordançageou ou intensification de la coloration Décoloration ou EPREUVE (c est le caractère que l on cherche à mettre en évidence) CONTRE COLORATION permet d observer les germes décolorés précédemment (résultat négatif à la fin)

26 Examen après coloration Colorations différentielles 1/ Coloration de Gram base de l identification d une souche bactérienne - Principe Doit être parfaitement maîtrisée car c est le point de départ du choix des examens complémentaires à effectuer, des milieux à ensemencer etc Les différences de coloration des bactéries reposent sur des différences de constitution de la paroi Teste l alcoolo résistance d une souche bactérienne

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28 1/ Coloration de Gram -Technique Réaliser un frottis et le fixer Coloration Coloration: violet de Gentiane phéniqué durant une minute. Rincer à l eau du robinet Mordançage: recouvrir la lame de réactif de Lugol 1 minute (réactif iodo-ioduré) ioduré) Rincer à l eau

29 Epreuve (alcoolo résistance) : Plonger 3 ou 4 fois une demi seconde dans un pot d alcool ou laver 3 ou 4 fois à l alcool Rincer à l eau du robinet immédiatement Les bactéries à Gram - sont alcoolo-sensibles et sont donc décolorées La paroi des bactéries àgram + ne laisse pas passer l alcool et sont dites alcoolo-résistantes et restent colorées en violet

30 Contre coloration: Fuschinediluée au 1/20 ème ou safranine pendant une minute. Toutes les bactéries prennent le colorant mais le violet masque la fuschine Les «Gram positives» gardent le Violet de gentiane Les «Gram négatives» sont recolorées par la fuschine Rincer à l eau du robinet et sécher entre deux feuilles de papier absorbant Observer à l objectif 100 à immersion, à pleine lumière

31 -Résultats Bactéries dites «à Gram Négatif» sont roses Bactéries dites «à Gram Positif» sont colorées en violet Rq: certaines bactéries telles que Bacillus, apparaissent parfois roses et violettes sur le même frottis, on les dit «Gram labiles» et les différences de coloration sont dues à des différences d âge des bactéries

32 1/Coloration de Gram Bactéries à Gram positif Bactéries à Gram négatif

33 Clostridium tetani Clostridium perfringens Bactéries à Gram positif

34 Association Fuso-spirillaire Bactériesà Gram négatif

35 2/Coloration de ZiehlNeelsen -Principe Colorations différentielles Basée sur la capacité de bactéries à conserver, après coloration à chaud à la fuschine, la teinte rose malgré l action d un acide fort concentré et d éthanol à 95 Propriété de la paroi: très riche en lipides (acide mycolique, acides gras à longues chaînes et cires) qui ne sont retrouvés que chez ces bactéries dites «acido-alcoolo-résistantes» ou BAAR

36 Paroi des Mycobactéries

37 Coloration de ZiehlNeelsen -Technique Réaliser frottis d épaisseur moyenne et le fixer Recouvrir complètement la lame de fuschine de Ziehlconcentrée et chauffer la lame jusqu'à émission de vapeurs blanches de phénol Le frottis ne doit jamais sécher (rajouter de la fuschine si nécessaire) Eliminer le surplus de colorant, laisser refroidir la lame et rincer à l eau du robinet

38 Epreuve (acidorésistance) résistance): Recouvrir la préparation d une solution d acide sulfurique au 1/4 (ou d acide nitrique au 1/3) puis d alcool Rincer à l eau du robinet Recouvrir de bleu de méthylène pendant 1 minute Rincer à l eau du robinet et sécher entre feuilles de papier absorbant Observer à l objectif 100 à l immersion Réseau National de Laboratoires - Module microscopie - Avril 2012

39 -Résultats Les BAAR apparaissent en rouge sur fond bleu

40 3/Coloration à l acridine orange -Technique Couvrir la lame par une solution d'acridine orange à 1% et laisser agir 15 minutes. Rincer à l eau Couvrir la lame avec la solution de décoloration et laisser agir 1 minute. Rincer à l eau Couvrir la lame de bleu de méthylène et laisser agir 1 minute. Rincer à l eau Couvrir la lame avec la solution de décoloration et laisser agir 3 minutes. Rincer à l eau Laisser sécher et lire au microscope à fluorescence

41 -Résultats Les mycobactéries présentent une fluorescence rouge à orange Il faut lire environ 70 champs par lame avant de déclarer une lame négative Alternative à la coloration de Ziehl-Neelsen Neelsenpour la mise en évidence des mycobactéries et doit être confirmée par celle-ci ci en cas de positivité Permet d'augmenter la sensibilité de l'examen direct et permet un screening plus rapide

42 4/Coloration à l auramine -Technique Couvrir la lame par de l'alcool méthylique et laisser agir pendant 2 minutes. Rincer à l eau Couvrir la lame avec de l'auramineet et laisser agir pendant 15 minutes. Rincer à l eau Couvrir la lame d'acide-alcool alcool et laisser agir 3 minutes. Rincer à l eau Couvrir la lame de rouge de thiazine et laisser agir 1 minutes et 30 secondes. Rincer à l eau Laisser sécher et lire au microscope à fluorescence

43 - Résultats Les mycobactéries apparaissent jaunes sur fond rouge

44 5/Coloration de Vago utilisée pour Treponema, Leptospiraet et Borrelia - Technique : Réaliser un frottis du prélèvement pathologique. Ne pas le fixer Recouvrir la lame d'une solution filtrée de mercurochrome à 2% pendant 3 à 5 minutes Laver à l'eau distillée Colorer pendant 5 minutes avec une solution filtrée de vert de méthyle à 2% Laver à l'eau distillée, laisser sécher Examiner à l'objectif 100

45 - Résultats Les bactéries apparaissent en violet clair sur un fond clair Leptospira Réseau National de Laboratoires - Module microscopie - Avril 2012

46 6/Coloration de Köster Pour les bactéries partiellement acido- résistantes(brucella, Rhodococcus, Nocardia, Chlamydia, Actinobacillus, Bordetella ) Ne sont pas colorées par le Ziehl, méthode trop agressive

47 6/Coloration de Köster -Technique Coloration: solution de fuschine(ou safranine) à 2% dans de la soude molaire pendant 1 mn Laver à l eau du robinet Epreuve: Décolorer par acide sulfurique 0.1% pendant 10 à 20 sec Rincer à l eau du robinet Contre-coloration par du bleu de méthylène Rincer,, sécher Observer à l objectif 100 à immersion.

48 Les bactéries partiellement acido-résistantes apparaissent roses orangées sur fond bleu

49 Examen après coloration Colorations spécifiques

50 Colorations spécifiques 1/Coloration de Rhodes (flagelles) Les flagelles sont fragiles et la préparation du frottis délicate -Technique Préparation du frottis(utiliser une lame neuve) : laisse couler, sur la lame inclinée à 45 au dessus de la cuve à coloration (mettre de l eau de Javel dans la cuve), 2 gouttes d une culture en bouillon (culture jeune: 6 à 12 heures) de la souche à étudier. Laisser sécher.

51 Recouvrir la préparation de mordant de Rhodes (préparé extemporanément) pendant 3 mn Laver soigneusement à l eau distillée Recouvrir de nitrate d argent ammoniacal (préparé extemporanément), chauffé presqu à ébullition, et laisser agir 3 à 5 mn Rincer à l eau distillée Sécher et observer à l immersion

52 -Résultats Les corps bactériens apparaissent presque noirs, les flagelles sont teintés en brun plus ou moins foncé

53 Ciliature péritriche : flagelles répartis sur toute la surface de la bactérie Ex : entérobactérie mobile Ciliatures polaires : flagelles localisés à un ou deux pôles de la bactérie - Ciliature polaire monotriche Ex : Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas spp, Vibrio spp - Ciliature polaire multitriche Ex : Pseudomonas fluorescens - Ciliature amphitriche et multitriche Ex : Plesiomonas, Helicobacter

54 Colorations spécifiques 2/Colorations des spores Espèces des genres Bacilluset Clostridium sont capables de former des spores quand les conditions deviennent défavorables: température, milieu pauvre Les spores = formes de résistance

55 Forme de la spore - spore sphérique - spore cylindrique - spore ovoïde Position de la spore - Spore centrale -spore subterminale - spore terminale Déformation éventuelle de la bactérie par la spore - spore non déformante - spore déformante

56 2/Colorations des spores -Technique de BARTHOLOMEW: vert malachite à froid Fixer le frottis par la chaleur: 20 passages dans la flamme (altération des structures pariétales et perméabilisation de la spore) Recouvrir de vert malachiteet et laisser en contact 10 minutes. Laver à l eau distillée pendant 10 secondes Recouvrir le frottis de fuchsine à 0,25% et laisser en contact 10 secondes Laver à l eau distillée Sécher et observer à l immersion

57 2/Colorations des spores -Technique de BENITO TRUJILLO: vert malachite à chaud Réaliser un frottis et le fixer Recouvrir d une solution de vert malachite à 5% Chauffer jusqu à émission de vapeurs; laisser refroidir et chauffer à nouveau. L opération doit durer 10 minutes au total (rajouter du colorant si nécessaire) Laver soigneusement à l eau distillée Recouvrir le frottis de fuchsine basique à 0,25% pendant 1 mn Laver à l eau distillée, Sécher et observer à l immersion

58 2/Colorations des spores -Résultats Les spores apparaissent vertes dans un corps bactérien coloré en rouge

59 NB : Les spores peuvent être mises en évidence: -Etat frais: elles apparaissent très réfringentes -Coloration de Gram: elles apparaissent sous forme de structures incolores bien délimitées à l intérieur des bacilles les enveloppes sporalesinterdisent la pénétration des colorants

60 Examen après réaction d Immunofluorescence

61 Examen après réaction d Immunofluorescence Les colorants fluorescents en vert les plus connus sont des dérivés de la fluorescéine comme le FITC (Fluoresceine Iso Thio Cyanate). Réseau National de Laboratoires - Module microscopie - Avril 2012

62 Examen après réaction d Immunofluorescence 1/Immunofluorescence directe Utilisation d un anticorps dirigé contre la molécule recherchée = antigène Cet anticorps est couplé à un fluorochrome Révélation: microscope à fluorescence Fluorochrome

63 Examen après réaction d Immunofluorescence 2/Immunofluorescence indirecte Dans ce cas, on a deux anticorps: Ac primaire dirigé contre l antigène recherché deuxième Acmarqué par un fluorochrome, et possédant une haute affinité pour Acprimaire = antiglobuline Traceur Fluorochrome ETAPES Anticorps secondaire 2 Anticorps primaire 1 AntigËne Echantillon

64 Examen après réaction d Immunofluorescence Lames d immunofluorescence directe (IFD) IFD Influenza A IFD Legionnella

65 MERCI