Université de Sherbrooke. Identification des substrats de la caspase-8 dans des cellules du cancer colorectal résistantes à l apoptose

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2 Université de Sherbrooke Identification des substrats de la caspase-8 dans des cellules du cancer colorectal résistantes à l apoptose Par Victor Létourneau Programme de pharmacologie Mémoire présenté à la Faculté de médecine et des sciences de la santé en vue de l obtention du grade de maitre ès sciences (M. Sc.) en pharmacologie Sherbrooke, Québec, Canada Septembre 2022 Membres du Jury d évaluation Pr Jean-Bernard Denault, département de pharmacologie-physiologie Pr Michel Grandbois, département de pharmacologie-physiologie Pr François-Michel Boisvert, département d anatomie et de biologie cellulaire Victor Létourneau, 2022

3 RÉSUMÉ Identification des substrats de la caspase-8 dans des cellules du cancer colorectal résistantes à l apoptose Par Victor Létourneau Programme de pharmacologie Mémoire présenté à la Faculté de médecine et des sciences de la santé en vue de l obtention du diplôme de maitre ès sciences (M.Sc.) en pharmacologie, Faculté de médecine et des sciences de la santé, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada, J1H 5N4 L apoptose est un mécanisme cellulaire se déclenchant lorsque la cellule est endommagée et mène au suicide de la cellule grâce aux caspases, une famille de protéases qui contrôlent ce processus de mort cellulaire. Dans certaines conditions comme le cancer, où la résistance à la mort cellulaire est normalement observée, il a longtemps été considéré que l activité des caspases subissait une suppression quasi totale. Cependant, la caspase-8 initiatrice peut être activée dans les cellules du cancer colorectal (CCR) en absence d apoptose. Cela soulève des questions quant à son rôle principal connu qui se veut pro-apoptotique. Parmi les protéines qui sont clivées par les caspases initiatrices dans des lignées de cellules du CCR, notre laboratoire a identifié SNX1 et SNX2. Ces protéines sont impliquées dans le routage intracellulaire et la signalisation des récepteurs tyrosine kinase (RTK) qui sont impliqués dans la pathogenèse du CCR. Ce projet vise à identifier d autres protéines qui sont clivées par les caspases initiatrices et qui pourraient augmenter la tumorigénicité et la capacité métastatiques. Notre hypothèse de recherche est que les caspase-8 et -10 auraient d autres substrats qui, une fois clivés dans les cellules du CCR résistantes à l apoptose, augmenteraient la tumorigénicité et le pouvoir métastatique des cellules cancéreuses. Notre but était d identifier ces nouveaux substrats ainsi que de caractériser l impact de leur clivage sur la tumorigénicité de lignées de CCR. Nous avons d abord converti des cellules résistantes à l apoptose. Pour y arriver, plusieurs techniques furent utilisées comme la diminution des molécules pro-apoptotiques et l augmentation des molécules anti-apoptotiques, et ce, sans succès. Cependant, nous y sommes parvenus par le retrait complet des caspases exécutrices 3 et 7 avec le CRISPR-Cas9. Nous avons démontré que les cellules étaient résistantes par divers tests, dont l induction de l apoptose avec TRAIL et l analyse du clivage de PARP, un marqueur de l apoptose. Pour identifier des substrats, nous avons marqué des cellules résistantes avec des isotopes (SILAC) et avons induit la mort cellulaire dans celles-ci. Nous avons analysé les résultats par spectrométrie de masse et avons identifié un substrat potentiel, la profilin-1. Malheureusement, nous n avons pas pu confirmer son clivage par immunobuvardage. Nous avons tenté la même procédure, mais en utilisant la technique TAILS, sans avoir identifié de nouveaux substrats. Notre hypothèse reste donc à vérifier. Il serait intéressant de tenter d autres méthodes de protéomique ou de les optimiser afin de peutêtre pouvoir identifier de nouveaux substrats. Mots clés : apoptose, cancer colorectal, caspase, substrat, protéomique, iii

4 SUMMARY Identification of caspase-8 substrates in colorectal cancer cells resistant to apoptosis By Victor Létourneau Pharmacology Program Thesis presented at the Faculty of medicine and health sciences for the obtention of Master degree diploma maitre ès sciences (M.Sc.) in Pharmacology, Faculty of medicine and health sciences, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada, J1H 5N4 Under physiological conditions, apoptosis is a cellular mechanism triggered when the cell is damaged and leads to cell suicide orchestrated by caspases, which form a family of proteases that control the process of cell death. In certain conditions, such as in cancer where there is resistance to cell death, it has long been thought that caspase activity is near completely suppressed. However, initiator caspase-8 is activated in colorectal cancer (CRC) cells in the absence of apoptosis. This raises questions about its canonical role, which is intended to be pro-apoptotic. Among the proteins that are cleaved by initiator caspases in CRC cells, our laboratory has identified SNX1 and SNX2. These two proteins are involved in the intracellular routing and signaling of receptor tyrosine kinase, which are involved in the pathogenesis of CRC. This project aims at identifying other proteins such as SNX1 and SNX2 that are cleaved by initiator caspases and which could increase tumorigenicity and the ability to metastasize. Our research hypothesis is that caspase-8 and -10 has other substrates which, upon cleavage in cells resistant to apoptosis of CRC, would increase the tumorigenicity and metastatic capacity of cancer cells. Our goal was to identify new substrates and to characterize the impact of their cleavage on cancer tumorigenicity. We first made HCT-116 cells resistant to apoptosis. To achieve this, several approaches were attempted such as the reduction of pro-apoptotic proteins and the increase of anti-apoptotic proteins expression, without success. However, we succeeded by completely removing using CRISPR-Cas9, the executioner caspases 3 and 7. We demonstrated that the cells were resistant by various tests including following the induction of apoptosis with TRAIL and by observing PARP-1 cleavage, a marker of apoptosis. To identify substrates, we labeled resistant cells with isotopes (SILAC) and induced cell death in them. We analyzed the results by mass spectrometry and identified a potential substrate, profilin-1. However, we could not confirm its cleavage by immunoblotting. We attempted the same procedure, but using the TAILS proteomics technique, without obtaining any substrate. Therefore, our hypothesis remains to be verified. It would be interesting to try other proteomic methods or to optimize them to be able to identify new substrates. Nevertheless, the cellular model we developed constitute a very useful tool to investigate initiator caspase substrates. Keywords: apoptosis, colorectal cancer, caspase, substrate, proteomics, iv

5 TABLE DES MATIÈRES RÉSUMÉ... iii SUMMARY... iv TABLE DES MATIÈRES... v LISTE DES TABLEAUX... viii LISTE DES FIGURES... ix LISTE DES ABRÉVIATIONS... xi INTRODUCTION L apoptose Fonctions physiologiques de l apoptose Caractéristiques de l apoptose et d autres types de mort cellulaire Les caspases Les caspases apoptotiques Les caspases inflammatoires Les différentes voies de mort cellulaire par apoptose La voie extrinsèque La voie intrinsèque Roles de l apoptose dans diverses pathologies L apoptose comme cible dans le traitement du cancer Les substrats des caspases Méthodes d identification des substrats des caspases Hypothèse et objectifs Hypothèse Objectifs MATÉRIEL ET MÉTHODES Liste des anticorps utilisés v

6 2.2 Constructions plasmidiques et DsiRNA utilisés Culture cellulaire, transfections, invalidation génétique et traitements apoptotiques Extraits cellulaires Immunobuvardages Coloration à l annexine V et iodure de propidium (PI) Microscopie confocale Marquage des noyaux Test de vitesse de prolifération Test de vitesse de migration Spectrométrie de masse RÉSULTATS Cellules HCT-116 résistantes à l apoptose Diminution de BAK et BAX par l utilisation de DsiRNA Cellules HCT-116 résistantes à l apoptose Augmentation des protéines BCL-XL et XIAP par l utilisation de plasmides Cellules HCT-116 résistantes à l apoptose Diminuer l expression des caspases exécutrices Résistance à l apoptose induite dans les HCT-116 CASP3/7 KO Marquage à l annexine-v et au PI Résistance à l apoptose induite dans les HCT-116 CASP3/7 KO Marquage des noyaux et visualisation par microscopie confocale Caractérisation des cellules HCT-116 CASP3/7 KO Tester la capacité d activation de la caspase Caractérisation des cellules HCT-116 CASP3/7 KO Vitesse de prolifération Caractérisation des HCT-116 CASP3/7 KO Vitesse de migration Identification des substrats de la caspase-8 dans les HCT-116 CASP3/7 KO - SILAC Identification des substrats de la caspase-8 dans les HCT-116 CASP3/7 KO TAILS vi

7 DISCUSSION Induction d une résistance à l apoptose Caractérisation des HCT-116 CASP3/7 KO Identification des substrats de la caspase-8 par différentes approches de protéomiques. 69 CONCLUSION RÉFÉRENCES vii

8 LISTE DES TABLEAUX Tableau 1 : Anticorps utilisés Tableau 2 : Plasmides utilisés Tableau 3 : DsiRNA utilisés Tableau 4 : Protéines identifiées avec l approche SILAC qui possèdent un site de clivage suivant un résidu aspartate Tableau 5 : Protéines identifiées avec l approche TAILS qui possédaient un ratio LÉGER/MÉDIUM > 1, Tableau 6 : Protéines identifiées avec l approche TAILS qui possédaient un ratio LÉGER/MÉDIUM < 0, viii

9 LISTE DES FIGURES Figure 1 : Différences morphologiques entre l apoptose et la nécrose... 5 Figure 2 : Caractéristiques structurales des différentes caspases... 7 Figure 3 : Maturation de la forme zymogène des caspases en forme active... 9 Figure 4 : Voies apoptotiques Figure 5 : Site de clivage des caspases Figure 6 : Niveaux d expression des protéines BAK et BAX dans les HCT-116 transfectées Figure 7 : Niveaux d expression des protéines BAK et BAX dans les HCT-116 transfectées Figure 8 : Résistance à l apoptose par l observation du clivage de PARP-1 dans les cellules HCT-116 transfectées exposées au TRAIL Figure 9 : Transfection des cellules HCT-116 afin de surexprimer les protéines BCL-XL et XIAP Figure 10 : Résistance à l apoptose par l observation du clivage in cellulo de PARP-1 dans les cellules HCT-116 surexprimant BCL-XL et XIAP exposées au TRAIL Figure 11 : Résistance à l apoptose par l observation du clivage in cellulo de PARP-1 dans les cellules HCT-116 CASP7 KO exposées au TRAIL Figure 12 : Niveau d expression de la caspase-3 dans les cellules HCT-116 CASP7 KO transfectées Figure 13 : Résistance à l apoptose par l observation du clivage de PARP-1 dans les cellules HCT-116 CASP7 KO transfectées exposées au TRAIL Figure 14 : Validation de l absence de la caspase-3 dans des clones de cellules HCT-116 CASP7 KO CRISPR/Cas Figure 15 : Résistance à l apoptose par l observation du clivage in cellulo de PARP-1 dans les cellules HCT-116 CASP3/7 KO exposées au TRAIL Figure 16 : Résistance à l apoptose par le marquage avec annexine-v et PI pour quantifier le pourcentage de cellules apoptotiques Figure 17 : Résistance à l apoptose par le marquage des noyaux ix

10 Figure 18 : Validation de l activation de la caspase Figure 19 : Essais de prolifération Figure 20 : Essai de migration Figure 21 : Essais de migration Figure 22 : Schéma expérimental de l approche SILAC Figure 23 : Schéma à l échelle des différentes classes de peptides détectés en spectrométrie de masse SILAC Figure 24 : Validation in cellulo du clivage de PFN Figure 25 : Validation in cellulo du clivage de PFN Figure 26 : Schéma expérimental de l approche TAILS Figure 27 : Schéma à l échelle des différentes classes de peptides détectés en spectrométrie de masse TAILS x

11 LISTE DES ABRÉVIATIONS APAF-1 BAD BAK BAX BCL-2 BCL-XL BID CID CP DAMP DD DED DFF DISC DMEM DNT DsiRNA FADD Fas/Apo1/CD95 FBS GFP GSDMS HCT116 HMGBI HSP90 HUNTER IAP IL-1 IL-10 KO LBR LPS NAD NuMa PAMP PARP-1 PBS PFN1 Apoptosis protease-activating factor 1 BCL-2-associated death promoter BCL-2 homologous antagonist/killer BCL-2-associated X protein B-Cell Lymphoma 2 B-Cell Lymphoma-extra large BH3 interacting-domain death agonist Connecteur interdomaine Cellules parentales Damage-associated molecular patterns Death domain Death-effector domain DNA fragmentation factor Death-inducing signaling complex Dulbecco s Modified Eagle Medium Domaine N-terminal Dicer-substrate small interfering RNA Fas associated with DD Fas receptor/apoptosis antigen 1/Cluster of differentiation 95 Fetal bovine serum Green fluorescent protein Gasdermin D Human colorectal carcinoma High mobility group box 1 Heat shock protein 90 High-efficiency undecanal-based N termini enrichment Inhibitor of apoptosis Interleukine 1 Interleukine 10 Knock out Récepteur de la lamine B1 Lipopolysaccharide Nicotinamide adénine dinucleotide Nuclear mitotic apparatus protein Pathogen-associated molecular patterns Poly (ADP-ribose) polymerase 1 Phosphate-buffered saline Profiline-1 xi

12 PFN2 PI PRR PtdSer PUMA RISC ROCK1 RTK SDS-PAGE SILAC SMAC SNX1 SNX2 TAILS TGF- TNF TNFR TP TRAIL XIAP Profiline-2 Propidium iodide Pattern recognition receptor Phosphatidylsérine p53 upregulated modulator of apoptosis RNAi-induced silencing complex Rho-associated kinase I Récepteur tyrosine kinase Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis Stable isotopic labeling of amino acids in cell culture Second mitochondria-derived activator of caspases Sorting nexin-1 Sorting nexin-2 Terminal amine isotopic labeling of substrate Transforming growth factor beta Tumor necrosis factor Tumor necrosis factor receptor Température pièce Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand X-linked inhibitor of apoptosis xii

13 INTRODUCTION 1.1 L apoptose L apoptose est un processus de mort cellulaire programmé permettant à l organisme d éliminer les cellules endommagées. Le terme apoptose fut introduit pour la première fois en 1972 par une équipe de recherche australienne étudiant des coupes de tissus à l aide d un microscope électronique. Ils mirent en évidence certaines caractéristiques cellulaires clés de l apoptose, en particulier la condensation de la chromatine, pavant la voie pour la recherche dans ce domaine (Kerr et al., 1972). Il fallut encore quelques années avant que cet important processus cellulaire gagne de l intérêt dans la communauté scientifique grâce à la parution de plusieurs publications montrant concrètement que l apoptose est un processus de mort cellulaire programmé. C est notamment avec des études sur le ver Caenorhabditis elegans qu il fut possible de comprendre que des 1090 cellules qui constituent l animal immature, un nombre précis de 131 sont programmées à mourir par apoptose (Gumienny et al., 1999). Les principaux acteurs dans le phénomène d apoptose sont les caspases, des protéases à cystéine responsables du clivage de diverses protéines impliquées dans ce processus et sont aussi derrière plusieurs phénomènes clés de l apoptose comme la fragmentation de l ADN. Les divers rôles des caspases seront couverts en détail dans une section ultérieure. Bien que l apoptose reste la voie de mort cellulaire la plus étudiée et connue, plusieurs autres furent par la suite découvertes comme la pyroptose et la ferroptose (Tang et Kroemer, 2020 ; Vande Walle et Lamkanfi, 2016) Fonctions physiologiques de l apoptose L apoptose et la mitose sont deux processus aux rôles opposés, mais complémentaires, qui permettent le maintien de l homéostasie cellulaire du corps et ont tous deux des rôles dans la croissance et le développement. Si la mitose permet de former de nouvelles cellules, l apoptose, elle, permet d éliminer les cellules âgées et endommagées. 1

14 L apoptose a aussi des rôles avant notre naissance en permettant la destruction des cellules devenant superflues lors de l embryogenèse. Notamment, celles présentes entre les doigts dans le développement du fœtus, ce qui permet d avoir des doigts séparés les uns des autres (Gilbert, 2000). Un autre rôle crucial de l apoptose durant l embryogenèse se trouve dans la formation d un réseau de neurones connecté (Hollville et al., 2019). Durant cette période, les neurones sont produits de façon excessive et les neurones qui ne réussissent pas à former des connexions neuronales seront éliminés par apoptose (Hollville et al., 2019). Une fois l embryogenèse terminée, l apoptose a plusieurs rôles protecteurs en nous débarrassant des cellules endommagées. C est notamment le cas lorsque les cellules subissent des dommages irréparables à leur ADN en étant, par exemple, exposées au rayonnement UV. Avec l intervention du facteur de transcription p53 qui induit la transcription de facteurs pro-apoptotiques, la cellule mourra par apoptose, nous protégeant des effets potentiellement néfastes qu une cellule à l ADN endommagé pourrait avoir (Roos et Kaina, 2006). L apoptose possède aussi divers rôles dans la guérison de blessures. Différents types cellulaires sont impliqués dans ce processus comme les cellules immunitaires et celles-ci doivent être éliminées une fois leur travail terminé. Par exemple, les neutrophiles responsables de l élimination des pathogènes présents dans une blessure meurent par apoptose une fois les pathogènes détruits (Fox et al., 2010) Caractéristiques de l apoptose et d autres types de mort cellulaire L apoptose est un processus exécuté par les caspases. Ce phénomène peut être déclenché de plusieurs façons, mais suit généralement certains changements morphologiques clés qui lui sont propres. Pour mieux mettre en évidence l unicité de ces changements, l apoptose sera comparée à un autre processus de mort cellulaire, la nécrose. L une des caractéristiques clés de l apoptose est que ce phénomène est un type de mort cellulaire programmé et finement régulé. Comparativement à l apoptose, la nécrose (ne pas confondre avec la nécroptose qui est en partie programmée) n est pas un type de mort cellulaire programmé et ne dépend pas des caspases (Linkermann et Green, 2014). En effet, certains mécanismes permettent de limiter les dégâts potentiels que la nécrose 2

15 pourrait causer, dont l inflammation. Prenons l exemple d une coupure de la peau où l on observe la nécrose des cellules fortement endommagées (D Arcy, 2019). Dans ce cas, les macrophages ont pour rôle de phagocyter les débris et les cellules nécrosées afin d éviter les dommages collatéraux qu il pourrait y avoir, comme une réponse inflammatoire trop importante. En effet, une cellule nécrosée perd l intégrité de sa membrane plasmique et gonfle jusqu à ce qu elle se brise et relâche différentes molécules et protéines qui se retrouveront dans l espace extracellulaire (Savitskaya et Onishchenko, 2015). Parmi celles-ci, il y a des facteurs pro-inflammatoires comme HMGB1, qui aident au déclenchement d une réponse inflammatoire en se liant au NLRP3, une protéine de l inflammasome (Nikoletopoulou et al., 2013). Les neutrophiles sont ensuite recrutés et relâchent des espèces réactives, ce qui a comme effet d augmenter la réaction inflammatoire (Haanen et Vermes, 1995). Il est donc crucial de réguler l activité de ces cellules immunitaires, car elles relâchent des molécules bactéricides et une trop grande sécrétion de celles-ci pourrait potentiellement tuer des cellules saines se trouvant à proximité (Rock et Kono, 2008). Donc, il est nécessaire que ces cellules immunitaires meurent et elles le font par apoptose, ce qui permet d éviter une destruction excessive des tissues sains. Dans le contexte d une blessure, une réaction inflammatoire contrôlée est également bénéfique du fait qu elle créer de la vasodilatation qui permettra d amener plus rapidement les cellules du système immunitaire au site de la blessure afin d éviter une infection potentielle (Rock et Kono, 2008). Comme la nécrose cause une réaction immunitaire, le corps fera la distinction entre la nécrose qui est plus souvent associée à un danger comme une blessure et il pourra y réagir rapidement comparativement à l apoptose qui n engendre normalement pas de réponse immunitaire (Matzinger, 1994). C est d ailleurs l une des plus grandes différences entre la nécrose et l apoptose, soit l absence de réaction inflammatoire. Comparativement à la nécrose, lorsqu une cellule meurt par apoptose celle-ci est phagocytée par les cellules avoisinantes ou par les macrophages, ce qui empêche le déclenchement d une réaction immunitaire. Les cellules apoptotiques sont reconnues comme prêtes à être phagocytées, par l exposition du phosphatidylsérine (PtdSer). Normalement, le PtdSer est absent sur le feuillet externe de 3

16 la membrane plasmique et son exposition donne aux macrophages le signal de les phagocyter (Segawa et Nagata, 2015). Un autre phénomène propre à l apoptose est que la membrane d une cellule apoptotique ne perd pas son intégrité, même si la cellule diminue en taille et forme plusieurs petites vésicules appelées corps apoptotiques. Plusieurs phénomènes doivent se produire pour arriver à cette morphologie comme le clivage par la caspase-3 du Rho-associated protein kinase 1 (ROCK1) (Tixeira et al., 2020).Une fois clivé, ROCK1 phosphoryle les fibres de myosine et permet la contraction de l actomyosine provoquant le bourgeonnement de la membrane plasmique et ainsi la formation de vésicules (Atkin-Smith et Poon, 2017). Avec l aide d autres processus, la formation de vésicules intactes est possible et il n y aura pas le déversement de molécules pro-inflammatoires dans le milieu extracellulaire, ce qui empêche une réaction inflammatoire (Haanen et Vermes, 1995). De plus, le recrutement des macrophages permet parfois la relâche de certaines molécules anti-inflammatoires comme IL-10 et TGF- (Chung et al., 2006 ; Huynh et al., 2002). Ce processus n a d ailleurs aucun impact sur les cellules avoisinantes (Doonan et Cotter, 2008). Outre l inflammation, plusieurs autres différences morphologiques entre l apoptose et la nécrose sont présentes comme la modification de la structure de l ADN. Durant l apoptose, le noyau rétrécit, la chromatine se condense et l ADN est clivé de façon contrôlée (Saraste et Pulkki, 2000). Le complexe Caspase-activated DNase (CAD) est un hétérodimère responsable de ce clivage et est composée de deux sous unités, l unité de 40 kda (DFFB) et celle de 45 kda (DFFA), dont le rôle est d inhiber DFFB. Durant l apoptose, la caspase-3 clive cette dernière, libérant ainsi DFFB qui sera en mesure de cliver l ADN chromosomique (Zhang et Xu, 2000). Cela produira des fragments d environ 180 à 200 paires de bases, soit la taille d un nucléosome. Cette dégradation de l ADN condamne effectivement la cellule à mourir (Bortner et al., 1995). Lors de la nécrose, la chromatine n est généralement pas condensée. L ADN est tout de même clivé, mais de manière aléatoire, créant des fragments de différentes tailles (Edinger et Thompson, 2004). 4

17 Figure 1 : Différences morphologiques entre l apoptose et la nécrose Il existe plusieurs différences morphologiques entre la nécrose et l apoptose. D abord, lors de l apoptose la cellule voit son volume diminuer et il y aura bourgeonnement de la membrane grâce à la caspase-3 qui clive et active ROCK1. Une fois activé, ROCK1 va phosphoryler la myosine (sphère rouge) et permettra la contraction de l actomyosine (ligne verte) ce qui mènera à la formation des corps apoptotiques qui sont phagocytés par les cellules avoisinantes. Ensuite, l ADN va se briser de façon régulière, donnant des fragments de 180 à 200 pb. Lors de la nécrose, le volume cellulaire augmente, l ADN sera brisé en fragments de différentes tailles et il y aura largage du contenu intracellulaire à l extérieur de la cellule. Cela engendre une réponse inflammatoire qui n est pas présente dans l apoptose. Figure réalisée avec BioRender.com Bien que les changements morphologiques soient clés pour différencier une cellule en apoptose d autres types de morts cellulaires, il existe aussi plusieurs changements biochimiques dans la cellule qui marque l état d apoptose. L une des composantes biochimiques importantes qui dicte si la cellule mourra par apoptose ou par nécrose est le niveau d adénosine triphosphate (ATP). En effet, l apoptose nécessite une consommation importante d ATP et un niveau bas de cette molécule peut entraîner la cellule vers la nécrose. Par exemple, la poly (ADP-ribose) polymérase 1 (PARP-1), une protéine impliquée entre autres dans la réparation de l ADN, consomme du nicotinamide adénine dinucléotide (NAD+) de manière importante. Le NAD+ est un substrat utilisé pour 5

18 convertir l ADP en ATP et une activation de la protéine PARP-1 pourrait donc diminuer indirectement le niveau d ATP présent dans la cellule et pousser la cellule vers la nécrose. Lors de l apoptose, PARP-1 est rapidement clivé par les caspase-3 et caspase-7, empêchant son activité et conservant un niveau élevé d ATP permettant à la cellule de mourir par apoptose. Le clivage de PARP-1 est d ailleurs considéré comme un marqueur d apoptose important (Boucher et al., 2012 ; Kiechle et Zhang, 2002) et l observation de ces fragments à 89 kda et à 24 kda de PARP-1, généralement par buvardage de type Western, est suffisante pour indiquer qu il a été clivé par les caspases et que les voies apoptotiques sont mobilisées (Chaitanya et al., 2010). Une autre façon d observer la présence d apoptose est de montrer l activation des caspases exécutrices par l utilisation d anticorps qui reconnaissent la forme clivée active de la caspase d intérêt, souvent la caspase-3 (Srinivasan et al., 1998). 1.2 Les caspases Les principaux acteurs de l apoptose sont une famille de protéases à cystéine nommées caspases. Le terme caspase est dérivé de l appellation cysteine-aspartyl-specific protease. Comme son nom l indique les caspases clivent généralement du côté C-terminal d un résidu aspartate. Cependant, il fut récemment démontré qu elles pouvaient aussi cliver suivant un résidu glutamate ainsi que plus rarement suivant un acide aminé phosphosérine (Seaman et al., 2016). Toutes les caspases, à l exception de la caspase-14, sont composées de trois domaines. Elles possèdent un domaine en N-terminal (DNT) de longueur variable responsable de la régulation de leur activité. Elles présentent aussi un domaine catalytique qui est composé d une petite sous-unité (~10 kda) ainsi que d une grande sous-unité (~20 kda). Celles-ci sont liées entre elles par un connecteur interdomaine (CID) qui est clivé lors de l activation des caspases (Lavrik et al., 2005). Ce clivage permet aux deux sousunités de former un hétérodimère chez les caspases initiatrices alors que pour les caspases exécutrices sont déjà sous cette forme et le clivage leur permettra de former un hétérotétramère composé de deux hétérodimères. Cette forme est une condition essentielle à l activité de toutes caspases (Kumar, 2007). 6

19 Les caspases sont produites sous forme de zymogène (forme inactive) et, afin d être activées, elles doivent subir certaines modifications qui varient selon le sous-groupe auquel elles appartiennent. Les caspases ne sont pas toutes activées de la même façon et dans un contexte d apoptose, elles sont divisées en deux grandes catégories; les caspases initiatrices composées des caspases 2, 8, 9 et 10 et les caspases exécutrices qui comprennent les caspases 3, 6 et 7 (Galluzzi et al., 2016 ; Shi, 2002). Il y a aussi d autres caspases spécifiquement impliquées dans l inflammation plutôt que dans l apoptose, soient les caspases 1, 4 et 5. Figure 2 : Caractéristiques structurales des différentes caspases Il existe trois grands groupes de caspases : les caspases inflammatoires (caspases 1, 4 et 5), les caspases initiatrices (caspases 2, 8, 9 et 10) et les caspases exécutrices (caspases 3, 6 et 7). Il y a aussi la caspase-14 qui ne se trouve dans aucune de ces catégories. Le groupe des caspases inflammatoires ainsi que certaines caspases initiatrices (caspase-9) possèdent un domaine CARD capable d interagir avec des protéines de recrutement et réguler leur activité tandis que les autres caspases initiatrices possèdent deux motifs DED (caspases 8 et 10) qui permettent par l interaction avec différentes protéines d échafaudage de les activer ou les inhiber. Finalement, les caspases exécutrices possèdent un domaine N-terminal court de régulation. Figure adaptée de (Li et Yuan, 2008) et réalisée avec BioRender.com Il y a finalement la caspase-14 impliquée de la différenciation des kératinocytes qui ne figure pas dans aucune des catégories dues à son rôle qui lui est propre (Denecker et al., 2008). Ses mécanismes d activation ne sont pas encore complètement élucidés, mais elle semble l être par certaines molécules présentes dans la peau comme les céramides 7

20 (Markiewicz et al., 2021). Cela diffère de l activation classique d une caspase, qui se produit généralement suite à des dommages ou à des dangers comme une infection. Celleci participe aussi dans la conservation de l eau dans la peau afin d éviter son dessèchement (Markiewicz et al., 2021). Outre la caspase-14, seulement présente dans les kératinocytes, les autres caspases sont exprimées de façon ubiquitaire. Bien qu aussi ubiquitaire, la caspase-1 est plus abondamment présente dans les monocytes et les macrophages (Ramirez et Salvesen, 2018) Les caspases apoptotiques Tel que présenté plus haut, deux groupes de caspases sont responsables en grande partie du déroulement de ce processus de mort cellulaire par apoptose, soient les caspases initiatrices et les caspases exécutrices. Le principal rôle des caspases initiatrices est d activer, par clivage, la forme zymogène des caspases exécutrices. Ces dernières peuvent, une fois activées, cliver plusieurs substrats, certains servants à la progression de l apoptose, d autres étant des protéines essentielles à la survie de la cellule et un dernier groupe, sans rôle important reconnu souvent qualifier de substrats collatéraux (bystanders). Elles sont aussi responsables de plusieurs processus présents dans l apoptose, dont la formation des corps apoptotiques, au clivage de l ADN ainsi qu à l exposition des phosphatidylsérines (Julien et Wells, 2017) Les caspases initiatrices Parmi les caspases initiatrices se trouvent les caspases 2, 8, 9 et 10 qui s autoactivent par dimérisation. L un des modèles qui expliquent cette activation est celui de l activation par proximité, qui sera décrit plus loin, stipulant qu un nombre élevé de molécules de caspase dans un espace restreint aiderait à leur activation par dimérisation (inducedproximity model) (Salvesen et Dixit, 1999). Les caspases 8 et 10 possèdent deux death effector domain (DED) qui leur permettent d interagir avec des récepteurs de la mort par le biais de protéines adaptatrices se liant à ceux-ci comme le Fas-associated protein with death domain (FADD). D autres protéines peuvent aussi lier les DED pour inhiber 8

21 l apoptose comme le cellular FLICE (FADD-like IL-1 -converting enzyme)-inhibitory protein (c-flip) permettant de réguler l activation des caspases initiatrices 8 et 10 (Ramirez et Salvesen, 2018). Figure 3 : Maturation de la forme zymogène des caspases en forme active L activation d une caspase est différente entre les groupes de caspases. Les caspases initiatrices et inflammatoires sont présentes sous forme de monomères inactifs dans le cytosol et sont activées par dimérisation. Suite à leur activation, il y a fréquemment clivage à différents résidus aspartate (ciseaux), l un présente entre le prodomaine et la grande sous-unité permettant de les séparer ainsi que deux se trouvant dans le CID entre la grande et la petite sous-unité. Les caspases exécutrices, elles, sont présentes sous forme de dimères inactifs et seront clivées au niveau du CID par les caspases initiatrices afin d être activées et elles seront matures suite au clivage de leur DNT. Figure réalisée avec Biorender.com La caspases-8 est connue pour son rôle dans l initiation de l apoptose par la voie extrinsèque, un processus enclenché par des signaux externes comme des ligands activant les récepteurs de la mort (Fischer et al., 2006). La caspase-8 est beaucoup plus étudiée et ses fonctions, autant dans l apoptose que dans divers processus biologiques, sont beaucoup mieux répertoriées que celles de la caspase-10 puisque cette dernière n est pas présente chez la souris ou le rat (Jänicke et al., 2006). La caspase-8 joue un rôle dans l embryogenèse en aidant la prolifération et la différenciation des cellules progénitrices; la délétion de cette protéase dans des embryons mène à la mort de ceux-ci (Kang et al., 9

22 2004). De plus, certaines de ses fonctions seraient indépendantes de son activité enzymatique puisqu une mutation lui enlevant cette activité permet toujours de voir les mêmes effets par la caspase-8 (Kang et al., 2004). La caspase-8 possède aussi un rôle sur l activité de l inflammasome. En fonction du type cellulaire, la caspase-8 peut aider ou nuire à son activation (Tummers et Green, 2017). Un autre rôle intéressant de la caspase- 8 est celui qu elle possède dans la régulation des cellules immunitaires. La caspase-8 permet aux cellules T et B autoréactives d être éliminées afin d éviter le développement de maladies auto-immunes. En effet, la mutation de la caspase-8 inhibe ce processus (Maelfait et Beyaert, 2008). La caspase-8 montre très bien que les caspases apoptotiques n ont pas que des rôles dans l apoptose, mais qu elles possèdent aussi d autres rôles importants dans l homéostasie et le développement. La caspase-10 pourrait aussi avoir certains rôles immunitaires, car la mutation de celle-ci est impliquée dans le syndrome lymphoprolifératif avec auto-immunité (Wang et al., 1999). Un rôle opposé dans l activation de l apoptose a toutefois été identifié pour la caspase-10 (Horn et al., 2017). Celle-ci pourrait empêcher le déroulement de l apoptose par la voie dépendante de la caspase-8; la caspase-10 diminuerait la formation du death-inducing signaling complex (DISC) et, donc, diminuerait l activation de la caspase-8 (Horn et al., 2017). La caspase 9 possède un caspase activation and recruitment domain (CARD) dans sa portion N-terminale dont la fonction est d interagir avec le domaine CARD d APAF-1 (Apoptotic peptidase activating factor 1) (Lahm et al., 2003). Cette interaction est cruciale dans l activation de cette caspase et dans le bon déroulement de la voie intrinsèque de l apoptose. Ces rôles seront couverts dans une section ultérieure. La caspase-9 joue un rôle dans la différenciation des myoblastes squelettiques en myotube. Ces effets sont médiés par la caspase-3, mais c est la caspase-9 qui est responsable de son activation, car un fonctionnement anormal de cette dernière empêchera cette différenciation (Murray et al., 2008). La caspase-9 est aussi impliquée dans la réponse aux infections virales ainsi que dans l autophagie (Avrutsky et Troy, 2021). Bien que la caspase-2 soit classée parmi les caspases initiatrices, elle ne clive pas les caspases exécutrices pour les activer (Fava et al., 2012). La caspase-2 possède aussi un 10

23 domaine CARD, mais interagit plutôt avec PIDD permettant son activation. Une fois activée, elle peut cliver certains substrats comme BID en sa forme active pro-apoptotique tbid (Bouchier-Hayes et Green, 2012) Les caspases exécutrices Les caspases exécutrices sont les caspases 3, 6 et 7. Comparativement aux caspases initiatrices, les caspases exécutrices sont présentes dans le cytosol en tant que dimères inactifs. Elles ne s autoactivent pas in cellulo, sauf lorsque surexprimées, mais sont activées par clivage protéolytique de leur CID par les caspases initiatrices (Boatright et Salvesen, 2003). Elles peuvent aussi être activées par d autres protéases comme la granzyme B (Darmon et al., 1995) qui est larguée dans le cytosol des cellules par certaines cellules immunitaires afin d induire l apoptose des cellules cancéreuses ou infectées (Goping et al., 2003). Les caspases exécutrices ont une région N-terminale courte qui ne possède pas sites d interaction bien définis (Boice et Bouchier-Hayes, 2020). Les caspases exécutrices ont comme rôle principal de cliver divers substrats essentiels à la survie cellulaire et au déroulement de la mort cellulaire par apoptose. En effet, il a été démontré que dans des souris KO pour la caspase-3 et la caspase-7, le phénomène d apoptose y est déficient et ces souris meurent à la naissance. Cela montre qu en plus de leur rôle crucial dans le bon déroulement de l apoptose, ces caspases sont aussi essentielles dans le développement (Lakhani et al., 2006). Même si à première vue les caspases-3 et 7 ont une activité presque identique sur certains substrats communs, chacune a un répertoire de substrats qui lui sont propres. La caspase-3 est celle qui a le rôle le plus important durant l apoptose, car elle possède un plus grand nombre de substrats et son absence chez les souris est suffisante pour causer la mort des souris avant la naissance (Walsh et al., 2008). Elle va notamment activer la caspase-6 et la DNAse CAD. Elle va aussi cliver plusieurs substrats comme PARP-1, une protéine responsable de la réparation de l ADN (Lakhani et al., 2006 ; Porter et Jänicke, 1999). Bien que la caspase-7 possède certaines fonctions communes à la caspase-3, celle-ci possède aussi des rôles uniques. Par exemple, cette caspase clive certains substrats, comme la cochaperone d HSP90, p23 et PARP-1, de façon plus efficace que la caspase-3 grâce à 11

24 un exosite (Boucher et al., 2012). Elle aurait aussi un rôle dans le combat des infections (Akhter et al., 2009). En effet, il a été montré que des macrophages déficients en caspase- 7 ont une moins bonne capacité à réduire la réplication de certains pathogènes. La caspase-6, elle, est activée par la caspase-3 et a un rôle dans l apoptose comme la diminution du volume du noyau. Celle-ci est aussi capable de cliver plusieurs caspases, dont la caspase-2, 3 et 8, mais avec des effets variés qui ne seront pas discutés ici. Outre ses fonctions apoptotiques, la caspase-6 participerait à l inflammation, dont dans l activation de l inflammasome et participe à la protection contre l infection par l influenza (Wang et al., 2015 ; Zheng et al., 2020). Il a aussi été démontré que la caspase- 6 active est présente dans plusieurs maladies neurodégénératives comme la maladie d Alzheimer et de Huntington, mais son rôle dans ces pathologies n est pas bien défini (Graham et al., 2011) Les caspases inflammatoires Bien que les caspases soient plus souvent décrites pour leur rôle dans l apoptose, il existe un groupe de caspases, les caspases inflammatoires, qui possèdent une multitude de rôles dans des processus inflammatoires et dans le combat des infections. Les caspases inflammatoires sont constituées de la caspase-1, 4, 5, et 12. Même si la caspase-12 fait théoriquement partie de ce groupe, son rôle ne sera pas couvert puisqu elle n est pas active chez l humain (Bateman et al., 2021 ; Fischer et al., 2002). La caspase la plus étudiée des caspases inflammatoires est la caspase-1. Celle-ci doit être activée par un complexe protéique nommé inflammasome qui est notamment responsable de reconnaître les damage-associated molecular pattern (DAMP). Ces molécules sont produites pour annoncer des dommages cellulaires qui ne sont pas liés à une activité bactérienne. L inflammasome reconnaît aussi les pathogen-associated molecular pattern (PAMP) qui indiquent la présence de pathogènes dans l organisme et permette d y répondre (Schroder et Tschopp, 2010). La reconnaissance des DAMP et PAMP se fait par le biais des pattern recognition receptor (PRR). La caspase-1 est recrutée par un domaine 12

25 CARD présent sur diverses protéines senseurs formant l inflammasome et activée par dimérisation. Une fois activée, elle aura comme fonction de cliver certains substrats, comme c est la pro-interleukine-1 (IL-1) qui est une cytokine jouant un rôle clé dans la réponse immunitaire innée et dans la génération d une réaction inflammatoire. La caspase-1 peut aussi activer la gasdermine D (GSDMD) qui est importante dans la réponse immunitaire et peut initier la mort par pyroptose (Xia et al., 2021). Les caspase-4 et caspase-5 ont des rôles moins connus. Cependant, un rôle récemment identifié de la caspase-4 est qu elle reconnaît les lipopolysaccharides (LPS) présents sur les bactéries Gram négatives lors d une infection. La caspase-4 aurait aussi un rôle dans la sécrétion d IL-1 et dans la destruction par pyroptose des macrophages infectés par des bactéries (Matikainen et al., 2020). La caspase-5 peut aussi lier les LPS bactériens ; il fut montré qu en présence de LPS, la caspase-5 serait activée et aiderait au relâchement des molécules pro-inflammatoires IL-1 et IL-1 (Viganò et al., 2015). 1.3 Les différentes voies de mort cellulaire par apoptose Il existe deux façons principales d activer l apoptose, soit par la voie intrinsèque ou par la voie extrinsèque. Deux voies déclenchées par des signaux différents sont exécutées par plusieurs protéines, certaines propres à l une des deux voies alors que d autres leur sont communes. (Elmore, 2007). Les acteurs et les mécanismes participant dans ces voies seront couverts en détail dans cette section La voie extrinsèque Afin qu une cellule meure par la voie apoptotique extrinsèque, un ligand provenant de l extérieur de la cellule doit se lier à l un des récepteurs de la mort de la grande famille des tumor necrosis factor receptor (TNFR). Il existe six récepteurs dans cette famille qui régulent l apoptose, soit le TNFR1, Fas/Apo1/CD95, DR3, DR4/TRAIL-R1, DR5/TRAIL-R2 et DR6 (Nair et al., 2014). Comme leur nom l indique, ces récepteurs lient des facteurs de nécrose tumorale (TNF). Avec l aide d une région intracellulaire 13

26 appelée le death domain (DD), il sera possible de prendre le signal extracellulaire et de le traduire en signal interne permettant le déclenchement de l apoptose (Elmore, 2007). Pour illustrer ce processus, prenons le ligand TRAIL que j ai abondamment utilisé dans mon projet, bien que d autres ligands agissent aussi sur ces récepteurs comme TNF et FasL. La principale fonction de TRAIL est d induire l apoptose dans des cellules tumorigéniques (Holoch et Griffith, 2009). Afin de déclencher le processus d apoptose, TRAIL peut se lier à deux récepteurs, DR4 et DR5, causant leur trimérisation (Pan et al., 1997). Dans la partie intracellulaire des récepteurs, il y aura la liaison de l adaptateur FADD sur le motif DD des récepteurs suivi des procaspases 8 ou 10 (caspase-8 pour fin de simplification) à FADD grâce à leurs domaines DED et la combinaison de ces protéines, récepteurs-adaptateurs-caspases, forme le DISC. Suivant la formation de ce complexe, il y aura autoactivation par dimérisation de la procaspase-8; une fois activée, cette caspase clivera plusieurs substrats comme les procaspases exécutrices 3 et 7 (Kischkel et al., 2000). La caspase-8 peut aussi cliver certaines protéines proapoptotiques impliquées dans la voie intrinsèque de l apoptose dont BH3 Interactingdomain death agonist (BID) en sa forme active tbid. (Li et al., 1998 ) (voir section 1.4.2). Une fois les caspases exécutrices activées, elles cliveront plusieurs substrats afin de déclencher l apoptose. Par exemple, la caspase-3, qui est l actrice principale dans l exécution de l apoptose, clivera notamment ICAD, l inhibiteur de la DNase CAD (Enari et al., 1998). Elle inactive aussi la protéine PARP-1 qui, dans des conditions normales, participe à la réparation de l ADN (Jänicke et al., 1998 ; Walsh et al., 2008). Un autre changement cellulaire important de l apoptose causé en grande partie par la caspase-3 est le bourgeonnement membranaire. La caspase-3 clive et active plusieurs modulateurs du cytosquelette d actine comme ROCK1, le p21-activated kinase 2 (PAK2) et la gelosine. La gelosine clivée est constitutivement active et les protéines ROCK1 et PAK2 ne dépendront plus de l activité des GTPases ce qui crée une réorganisation anormale du cytosquelette d actine causant le bourgeonnement cellulaire (Green et Llambi, 2015). Ce ne sont cependant pas toutes les cellules qui peuvent directement mourir via la voie extrinsèque (cellules de type I). Ce qui différencie les autres types cellulaires est le niveau 14

27 de la protéine X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP). Dans les cellules de type II, XIAP est présent en quantité suffisante pour inhiber les caspases exécutrices activées par les caspases initiatrices de la voie extrinsèque (Jost et al., 2009). Pour que ce type de cellules meurent, elles doivent aussi utiliser la voie intrinsèque de l apoptose qui leur permet de relâcher le second mitochondria-derived activator of caspases (SMAC), un inhibiteur de XIAP. Cela permettra donc l activation des caspases exécutrices et la mort cellulaire par apoptose (Green et Llambi, 2015). Les cellules utilisées durant ma maîtrise, les HCT-116, sont de type II (Özören et El-Deiry, 2002). Afin d éviter que la cellule enclenche la voie extrinsèque de l apoptose à tort, il existe plusieurs protéines comme XIAP qui régulent le processus d apoptose. Une protéine illustrant bien ce processus de régulation est la protéine c-flip dont il existe deux formes : la forme courte (c-flips) et la forme longue (c-flipl) (Irmler et al., 1997). Les deux protéines possèdent un domaine DED leur permettant de se lier à la protéine FADD du complexe DISC. Lorsque c-flips lie FADD, elle empêche la caspase-8 de s y lier, inhibant ainsi son recrutement et son activation (Krueger et al., 2001). Il se produit la même chose lorsque c-flipl est présent en grande quantité. Cependant, lorsque cette protéine est présente à une faible concentration, elle favorise plutôt le déroulement de l apoptose (Chang et al., 2002) et peut même participer à l activation des caspases initiatrices 8 et 10 (Boatright et al., 2004) La voie intrinsèque Comparativement à la voie extrinsèque, la voie intrinsèque de l apoptose est déclenchée suite à des signaux provenant de l intérieur de la cellule. Plusieurs phénomènes peuvent enclencher ce processus comme la présence de matériels viraux, des radiations, la perte de facteurs de croissances ou des dommages à l ADN. Il est aussi possible, comme expliqué dans la section précédente, que par la voie extrinsèque les caspases 8 et 10 clivent BID en sa forme active tbid et active la voie intrinsèque de l apoptose (Kiraz et al., 2016 ; Westphal et al., 2011). Ce dernier interagit avec BCL-2 associated X protein (BAX) et avec BCL-2 homologous antagonist/killer (BAK) dont la capacité de former 15

28 des pores permettra au cytochrome c de sortir de la mitochondrie et d enclencher la voie intrinsèque de l apoptose (Li et al., 1998 ; Moldoveanu et al., 2013). Pour illustrer ce processus, prenons l exemple dans lequel la cellule aurait subi des dommages à l ADN à la suite d une exposition aux rayonnements UV. Ces bris à l ADN auront comme impact d activer p53. p53 activée augmente la transcription de facteurs pro-apoptotiques comme BAX, le p53 upregulated modulator of apoptosis (Puma), BID et même la protéine Noxa (Hemann et Lowe, 2006). Parmi ces protéines, BAX ainsi que BAK, activées par tbid, feront des pores dans la membrane externe de la mitochondrie qui aura deux conséquences principales. La première, sera que ces pores laisseront certaines protéines pro-apoptotiques comme SMAC et Omi sortir de la mitochondrie (Westphal et al., 2011). Ces protéines pourront inhiber les inhibitor of apoptosis proteins (IAP) comme XIAP. La deuxième sera de laisser le cytochrome c sortir de la mitochondrie. Celui-ci liera les domaines WD40 de la protéine APAF-1 pour former un complexe dépendant de l ATP nommé apoptosome (Jiang et Wang, 2004). Ce complexe est formé de sept molécules d APAF-1 organisées en roue et possédant à son centre des domaines CARD qui permettent la liaison de la pro-caspase-9. L un des modèles qui expliqueraient comment la caspase-9 est activée propose que plusieurs molécules de caspases-9 se trouvent à l apoptosome. Dû à la proximité des molécules de caspases, cela permettrait leur dimérisation et l activation de la caspase-9 (Riedl et Salvesen, 2007). Une fois la caspase-9 activée, celle-ci activera les caspases exécutrices 3 et 7 qui pourront enclencher divers processus déjà expliqués menant à la mort de la cellule (Kuida, 2000). Tout comme la voie extrinsèque, il existe plusieurs protéines qui régulent le processus de mort cellulaire par la voie intrinsèque. La famille de protéines BCL-2 illustre parfaitement cette régulation, car dans cette famille on retrouve tant des molécules pro-apoptotique (BAK et BAX) qu anti-apoptotiques (BCL-2 et BCL-XL) qui réguleront celles-ci (Westphal et al., 2011). Même ces protéines anti-apoptotiques vont, elles aussi, être régulées par la protéine BCL-2-associated death promoter (BAD) qui lie BCL-2 et BCL- XL, les empêchant d inhiber BAX et BAK et permettant le déroulement de l apoptose (Howells et al., 2011). 16

29 Figure 4 : Voies apoptotiques Afin d activer la voie extrinsèque de l apoptose, un ligand doit se lier à un récepteur de la mort, causant la trimérisation de celui-ci. Il y a ensuite formation du DISC qui permet de recruter les pro-caspases 8 et 10 et de les activer par dimérisation. Dans une cellule de type I, les caspases initiatrices actives pourront directement activer suffisamment de caspases exécutrices et causer la mort cellulaire. Dans les cellules de type II, il faut que la cellule passe par la voie intrinsèque de l apoptose. Cette voie peut être activée de plusieurs façons. Avec l augmentation de l expression de BID par p53, à la suite de dommages à l ADN et par le clivage de BID par la caspase-8. La forme clivée de BID, tbid, a la fonction d inhiber les molécules anti-apoptotiques BCL-2 et BCL-XL ainsi que d activer BAX et BAK qui formeront des pores dans membrane des mitochondries. Ces pores laissent fuir SMAC qui inhibe XIAP, une protéine inhibant les caspases exécutrices et la caspase-9. Le cytochrome c sortira aussi de la mitochondrie afin de lier APAF-1 ce qui engendrera la formation de l apoptosome. Cette structure recrute et active la caspase- 9 qui pourra ensuite activer les caspases exécutrices. Figure réalisée avec BioRender.com 1.4 Roles de l apoptose dans diverses pathologies L apoptose est un processus qui doit être régulé de façon très stricte. Un niveau d apoptose soutenu est notamment observé dans certaines maladies neurodégénératives, 17

30 comme celle d Huntington. En effet, il a été démontré dans un modèle murin de cette maladie qu il y avait une trop forte activation de la caspase-1 et de la caspase-3 plus tard dans la maladie. Des signes apoptotiques dans les neurones, comme le relâchement du cytochrome c, ont été observés et démontrent la présence d apoptose excessive (Friedlander, 2003). L absence d apoptose est toutefois beaucoup plus répertoriée dans la littérature et plus spécifiquement dans le cancer. En effet, l un des éléments clés dans la formation du cancer est l évasion de l apoptose des cellules cancéreuses (Hanahan et Weinberg, 2000). Par exemple, les cellules cancéreuses ne réagiront pas ou moins efficacement à certains signaux qui devraient normalement causer leur mort, comme le dommage à l ADN, une division cellulaire incontrôlée et la perte d encrage à la matrice extracellulaire (Hanahan et Weinberg, 2011). Le dogme accepté sur l activité des caspases dans le cancer a longtemps été que les caspases étaient inactivées dans cette pathologie et qu une activité de celles-ci serait nécessairement bénéfique pour diminuer le cancer. Cependant, une vue plus nuancée du rôle des caspases dans le cancer a vu le jour dans les dernières années. Il est tout de même important de mentionner les effets et causes de l inhibition de l activité des caspases et de la dérégulation de l apoptose dans le cancer. Comme mentionné plus haut, la balance entre les protéines pro et anti-apoptotiques est très importante pour le bon déroulement de l apoptose. Généralement dans le cancer, les protéines anti-apoptotiques sont surexprimées et les pro-apoptotiques sont sous-exprimées. Les protéines de la famille BCL-2 sont un bon exemple de cette dérégulation (Kang et Reynolds, 2009). Les protéines comme BCL-2 et BCL-XL qui ont des rôles anti-apoptotiques sont souvent surexprimées dans les cancers (Lebedeva et al., 2000 ; Reed, 2008). De plus, la surexpression de ces protéines est liée à la résistance aux traitements par chimiothérapie, des récidives, ainsi qu une survie plus courte (Goldar et al., 2015 ; Wuillème-Toumi et al., 2005). BAX, une protéine pro-apoptotique, voit son expression diminuée dans le cancer colorectal et pourrait jouer un rôle dans la résistance à certains agents de chimiothérapie (Manoochehri et al., 2014). Ce débalancement entre les molécules régulant le processus apoptotique explique souvent en partie pourquoi il est si difficile de tuer les cellules cancéreuses in vivo. Une autre protéine dont la fonction est dérégulée 18

31 dans le cancer, la protéine p53, est très souvent mutée et sera incapable de répondre aux dommages à l ADN et autres stress auxquels elle répond lorsque fonctionnelle. Il suffit d un seul acide aminé différent pour causer cette mutation qui est suffisante pour entraver l activité de cette protéine. Comme son activité est perturbée facilement, il n est pas surprenant de constater qu elle soit si souvent mutée dans le cancer (Muller et Vousden, 2013). Un autre aspect de la dérégulation de l apoptose est la délétion ou le non-fonctionnement de certaines caspases (Zhou et al., 2018). Toutefois, le rôle des caspases dans le cancer est plus nuancé que l on pourrait le croire. Bien que la présence des caspases soit généralement considérée comme positive, les études des dernières années ont montré que dans un contexte de cancer, certaines caspases peuvent avoir des rôles néfastes. Comme ce sont souvent le rôle des caspases dans le déroulement de l apoptose qui sont présentées, ces résultats peuvent de prime abord surprendre. Il est maintenant évident que les caspases possèdent plusieurs rôles non apoptotiques et sont impliquées dans divers processus biologiques (Zhou et al., 2018); rendant les traitements visant à activer les caspases plus complexes. Induire la mort cellulaire est généralement positif dans certains cancers. Par exemple avec des agents visant BCL-2, il fut possible de ralentir la vitesse de croissance des cellules du cancer des poumons (Carneiro and El-Deiry, 2020). Cependant, si le traitement ne mène pas à l apoptose, les autres rôles des caspases pourraient être activés, comme celui dans la prolifération cellulaire, des conséquences néfastes pourraient résulter de ce type de traitement. Comme certaines composantes de l apoptose sont souvent compromises dans le cancer, une activation des caspases ne menant pas à la mort cellulaire pourrait être délétère au patient. Par exemple, la caspase-3 pourrait aussi favoriser la régénération de suivant une radiothérapie (Huang et al., 2011). En effet, il a été observé que lorsque des cellules tumorales saines sont mises en contact avec des cellules cancéreuses récemment irradiées, celles-ci croissent plus rapidement. Cependant, si la caspase-3 est retirée des cellules irradiées, cet effet est grandement diminué, suggérant un rôle de la caspase-3 dans les signaux de croissances que les cellules endommagées par la radiation pourraient envoyer aux cellules cancéreuses non touchées par le traitement (Huang et al., 2011). Bien que surprenant, il fut aussi démontré que 19

32 l absence de la caspase-3 chez certains patients dans le cancer colorectal rendait les cellules plus sensibles à la chimiothérapie et à la radiothérapie; cette absence diminuerait le risque d invasion et de migration des cellules cancéreuses par des mécanismes qui restent à élucider (Zhou et al., 2018). Cette étude semble donc montrer que dans certains cas, la présence de la caspase-3 ne serait pas un signe positif chez un patient atteint d un cancer. Comparativement, l absence de la caspase-9 dans le cancer de la tête et du coup est reliée à un traitement avec le cisplatine moins efficace (Kuwahara et al., 2003). Ces observations montrent que l implication des caspases dans le cancer est complexe et changent d un cancer à l autre, mais aussi d un patient à l autre. La caspase-8 est aussi un bon exemple montrant les divers rôles des caspases dans le cancer; celle-ci est augmentée dans certains cancers et diminuée dans d autres, causant divers effets. La perte de la caspase-8 a été observée dans plusieurs cancers comme le cancer des ovaires, le cancer du sein, de la prostate et plusieurs autres (Kim et al., 2003 ; Mandal et al., 2020). Cette diminution pourrait notamment avoir un effet dans la production de métastases ainsi que dans l évolution générale du cancer en aidant la transformation cellulaire (Krelin et al., 2008). Il rend aussi moins efficaces les traitements visant à induire l apoptose. Puisque la caspase-8 possède un rôle crucial dans l induction de l apoptose, des mutations peuvent être suffisantes pour perturber le phénomène d apoptose (Mandal et al., 2020). La dysfonction du processus peut donc contribuer à la création d un cancer (Olsson et Zhivotovsky, 2011). Dans d autres types de cancers, la caspase-8 n est pas diminuée, voire même augmentée comme c est parfois le cas dans le cancer colorectal (Mandal et al., 2020). Comme cette caspase possède des fonctions non apoptotiques, sa présence peut engendrer des effets néfastes. Elle peut notamment favoriser la mobilité des cellules cancéreuses, les aidant à envahir plusieurs parties du corps (Franco et Huttenlocher, 2005). Elle arriverait à cet effet en stimulant l activité de la calpaïne qui contribue à la prolifération et la migration des cellules. Dans les glioblastomes, la caspase-8 peut aussi favoriser l angiogenèse, un processus important dans la croissance d une tumeur et pourrait participer à la résistance face à certains agents utilisés en chimiothérapie (Fianco et al., 2017). Il est cependant important de comprendre 20

33 que la présence de caspases actives dans le cancer est souvent un signe positif donnant une meilleure chance de survie au patient (Elrod et al., 2010). 1.5 L apoptose comme cible dans le traitement du cancer Bien que les caspases aient des rôles divers et même parfois opposés dans le cancer, l induction de l apoptose par celles-ci ou d autres protéines impliquées dans l apoptose peut représenter une solution thérapeutique intéressante. L une des premières stratégies tentées visant à induire la mort cellulaire dans le cancer fut avec le TRAIL qui induit la mort par apoptose via la voie extrinsèque. L attrait de ce ligand est qu il peut induire la mort cellulaire de façon sélective en ne faisant mourir que les cellules cancéreuses; les cellules saines sont généralement épargnées (Walczak et al., 1999). Malheureusement, lors des essais cliniques les cellules cancéreuses se sont avérées résistantes au TRAIL dans la majorité des cas. Cependant, certaines études semblent démontrer qu il est possible de sensibiliser des cellules cancéreuses au TRAIL grâce à l utilisation d agents chimiothérapeutiques comme le cisplatine. Bien que cette méthode semble prometteuse, elle n a pas encore été évaluée dans le cadre formel d une étude clinique (Lemke et al., 2014). Une autre approche intéressante est l utilisation de molécules visant certaines protéines importantes de l apoptose et qui sont souvent impliquées dans sa dérégulation. Parmi ces composés pharmacologiques, se trouvent plusieurs inhibiteurs des régulateurs de l aptoptose BCL-2 et BCL-XL (Navitoclax), des molécules mimétiques de SMAC (Birinapant), différents agonistes synthétiques des récepteurs de la mort (GEN1029) ainsi qu une molécule visant à restaurer l activité de p53 (APR-246 ) (Boice et Bouchier- Hayes, 2020). Plusieurs de ces composés se trouvent à différentes phases cliniques de recherche et montrent que l induction de l apoptose comme traitement contre le cancer est une voie intéressante pour traiter cette maladie et surmonter la résistance à l apoptose présente dans cette pathologie. L une des protéines les plus ciblées est la famille BCL-2. Comme on y trouve autant de protéines anti que pro-apoptotiques, cela en fait une cible intéressante. Par exemple, il existe le ABT-737, une petite molécule qui se lit à BCL-2 et BCL-XL et les empêchent d interagir avec les protéines pro-apoptotiques qu elles inhibent. Cette molécule s est montré efficace pour ralentir la croissance de certains types 21

34 de tumeurs (Carneiro and El-Deiry, 2020). Donc, c est par l étude de cette résistance qu il sera possible d élaborer de nouveaux composés pharmacologiques la contournant. Figure 5 : Site de clivage des caspases Les caspases clivent généralement en c-terminal d un résidu aspartate à un endroit nommé le lien scissile. Les résidus se trouvant en amont de ce lien se nomment P1, P2 et ainsi de suite alors que ceux présents en aval du site se nomment P1, P2 et ainsi de suite. Il est possible de dire que la majorité des caspases vont cliver lorsque certains résidus (représentés en jaune) sont présents à certaines positions spécifiques donnant le motif X-Glu-X-Asp (Gly/Ala/Ser)-X-X-X. Figure réalisée avec Biorender.com. 1.6 Les substrats des caspases Le but de mon projet est d identifier de nouveaux substrats pour une caspase, il est donc crucial de comprendre comment clivent les caspases et ce qui constitue un site de clivage idéal pour celles-ci. Comme toute protéase, les caspases clivent certaines séquences spécifiques. Durant l apoptose, environ 2000 protéines seraient clivées (Seaman, 2016.). Par convention, le résidu adjacent au site de clivage du côté N-terminal se nomme P1 et les résidus se trouvant en amont de celui-ci se nomment P2, P3, P4, etc (Figure 5). Du côté C-terminal, le résidu suivant le site de clivage se nomme P1 suivi de P2, P3, etc. (Schechter and Berger, 1967). Parmi ces résidus, celui ayant le plus grand impact sur l efficacité du clivage est P1. Généralement, les caspases clivent à la suite d un résidu aspartate (~90%) ou glutamate (~10%). Toutes les caspases possèdent aussi une préférence en P3 pour un résidu glutamate (Thornberry et al., 1997) et pour un petit résidu (Gly, Ala, Ser) en P1 (Stennicke et al., 2000). Il est donc possible de généraliser en disant 22

35 que la plupart des caspases clivent les motifs X-Glu-X-Asp (Gly/Ala/Ser) (Shi, 2002). Cependant, même s il est vrai que les caspases ont cette préférence, chaque caspase possède des différences dans son affinité pour certains résidus. Entre les différentes caspases, les préférences pour l acide aminé en P4 et P2 varie. Ce sont en partie ces différences qui expliquent pourquoi les différentes caspases ne possèdent pas les mêmes substrats et qu elles présentent des fonctions diverses. C est grâce à des études utilisant des librairies de peptides synthétiques que ces préférences ont été établies. Pour chaque caspase, plusieurs combinaisons furent testées pour les acides aminés présents près du lien scissile et il fut possible de déterminer quel résidu était clivé de façon plus efficace en tenant compte de leur position. C est ainsi que pour chaque caspase, les résidus préférentiels sont connus pour les positionsp1 à P4 afin d obtenir un clivage optimal par une caspase donnée. Par exemple, pour les caspases exécutrices 3 et 7 le motif DEVD est bien connu comme étant le site de clivage idéal pour ces deux caspases (Timmer et Salvesen, 2007) et la caspase-8 préfère plutôt le motif LETD (Julien et Wells, 2017). L emplacement du site de clivage est aussi important, car il doit se trouver à la périphérie de la protéine pour permettre à la caspase d y avoir accès. De plus, les caspases clivent plus fréquemment dans les boucles, suivi des hélices et moins efficacement dans les feuillets (Julien et Wells, 2017) Méthodes d identification des substrats des caspases L identification des substrats des différentes caspases est cruciale dans la compréhension de leurs rôles dans les divers processus biologiques auxquels elles participent. L une des approches les plus utiles pour l identification de nouveaux substrats et sans équivoque la protéomique qui peut-être définit comme l identification et la quantification des protéines présentes dans un extrait cellulaire (Aslam et al., 2017). Ce large domaine analytique comprend plusieurs sous-catégories, dont la dégradomique qui s intéresse aux substrats et aux inhibiteurs des protéases (Rogers et Overall, 2013). Puisque mon projet consiste à identifier des substrats de la caspase-8, une protéase importante dans la mort cellulaire, je m attarderai à présenter la dégradomique pour mon projet. 23

36 Il existe diverses approches pour découvrir de nouveaux substrats d une protéase, dont la plupart d entre elles sont basées sur la spectrométrie de masse. Cette technique inventée en 1912 par J. J. Thomson a été perfectionnée depuis son invention pour être aujourd hui un outil précis qui permet de déterminer la composition moléculaire ou protéique d un échantillon (Noda et al., 2016). Pour ce faire, le spectromètre de masse mesure le ratio de la masse par rapport à la charge (m/z) (McLafferty, 1981). L échantillon est ensuite fragmenté en plus petites molécules qui seront plus facilement identifiables par spectrométrie de masse puis bombardé avec un jet d électrons qui permet d ioniser l échantillon. Pour l identification de molécules simple, un graphique sera obtenu avec plusieurs pics représentant les ratios m/z obtenus pour les différents fragments de la molécule. Comme la structure d innombrables molécules est connue, il sera possible avec ces différents fragments d identifier la molécule mère. Cependant, comme les protéines sont immensément plus complexes, cette technologie a dû être adaptée. C est pourquoi dans le domaine de la dégradomique, la spectrométrie de masse tandem est utilisée (El- Aneed et al., 2009). D abord, il faut digérer les protéines avec une protéase comme la trypsine afin de réduire la taille des protéines en peptides de plus petite taille (Aebersold et Goodlett, 2001). Cette méthode possède deux étapes de séparation : 1) permet de fragmenter les peptides en plus petits fragments ionisés et 2) permet de déterminer la séquence en acide aminé de chaque peptide. En utilisant une base de données de référence du protéome humain, il est possible de savoir de quelle protéine provenaient ces peptides, permettant donc d identifier les protéines qui étaient présentes dans l échantillon (Aebersold et Goodlett, 2001). Cependant, certains obstacles rendent l utilisation de cette technique peu efficace pour trouver des peptides créés par des protéases intracellulaires ayant clivé la protéine d origine. En effet, les peptides produits se trouvent souvent en faible quantité en comparaison avec plusieurs protéines abondantes, comme l actine, qui masquent ces peptides plus rares. Dans notre cas, nous cherchons des peptides issus d une protéase spécifique, la caspase-8, avec le motif de clivage qui lui est associé. Comme ces peptides sont peu présents, il est pertinent de les enrichir afin d augmenter les chances de les identifier. Ce sont notamment ces obstacles qui ont menés à la création du terminal amine isotope labeling of substrates, plus communément appelé TAILS. Cette technique permet de bloquer les amines libres générées avant la digestion tryptique par l utilisation 24

37 de formaldéhyde. Les peptides possédant des amines libres avant cette digestion seront généralement ceux qui ont été clivés par la protéase d intérêt, ici les caspases. Cela permet donc de faire la distinction entre les peptides générés par l action des protéases comme les caspases, de ceux générés par la trypsine. Aussi, le formaldéhyde utilisé peut posséder des isotopes lourds ou légers permettant de marquer deux conditions et de les distinguer en spectrométrie de masse. Avec l utilisation d un polymère capable de lier les amines libres, il sera possible d éliminer les peptides tryptiques, car ils seront les seuls possédant des amines libres ce qui simplifiera l échantillon et augmentera les chances d identifier les substrats d une protéase (Rogers et Overall, 2013). Une autre technique qui peut être utilisée comme façon préliminaire pour identifier de nouveaux substrats est l utilisation de bases de données montrant des substrats potentiels. C est ce que notre laboratoire a fait précédemment avec l utilisation, entre autres, de Degrabase, qui donne plusieurs peptides semblant provenir de l activité des caspases (Crawford et al., 2013). Les peptides présents ne sont pas nécessairement des substrats, mais ils présentent un site de clivage correspondant à celui d une caspase. Notre laboratoire a pu de cette façon identifier que dans cette banque de données, SNX1 et SNX2 semblaient être clivés par les caspases initiatrices. Pour confirmer ces résultats, l apoptose a été induite pour tenter d observer l apparition du fragment clivé de SNX1/2 par immunobuvardage, ce qui fut le cas (Duclos et al., 2017). Ce qui rend cette découverte intéressante est que SNX1/2 sont deux protéines importantes pour le routage intracellulaire et participent au recyclage, mais aussi à la dégradation de certains récepteurs par leur internalisation vers les lysosomes. Parmi ces récepteurs se trouvent les RTK qui sont connus pour leurs nombreux rôles dans le cancer. Ils vont être dérégulés en étant constitutivement actifs, ce qui permet une croissance démesurée des cellules cancéreuses (Cohen et al., 2005). L observation du clivage par les caspases de SNX1/2 est intéressant, car il pourrait montrer un rôle tumorigène des caspases. En effet, si ces protéines sont clivées afin d être inactivées, cela empêcherait de faire la dégradation des RTK et ils pourraient rester actifs plus longtemps, permettant à la cellule de croître de façon démesurée. Cela ouvre certaines questions, car le rôle des caspases dans le cancer a longtemps été considéré comme positif. Cela reste vrai lorsque les mécanismes 25

38 apoptotiques sont intacts. Dans ce cas, même si les caspases clivent certaines protéines résultantes dans des effets tumorigènes, si la cellule meurt suite à leur activation, aucun de ces effets n aura le temps d avoir d impacts. Or, dans un contexte de cancer où la cellule est très souvent résistante à l apoptose, ce clivage pourrait avoir des effets graves. Donc, il est crucial d identifier dans un contexte de résistance à l apoptose, quelles protéines sont clivées et quels sont les effets de ce clivage. Les substrats des caspases dans une cellule résistante à l apoptose n ont pas été décrits précédemment et c est notamment avec les techniques de spectrométrie de masse, expliquées plus haut, qu il serait possible de trouver de nouveaux substrats dans ce contexte. 1.7 Hypothèse et objectifs Les cellules cancéreuses sont souvent résistantes à l apoptose, car leurs mécanismes apoptotiques sont dysfonctionnels, empêchant la mort cellulaire et cela même si certaines caspases sont actives comme la caspase-8. Comme il a été démontré que la caspase-8 était non seulement active, mais surexprimée dans le cancer colorectal, il serait intéressant d identifier les substrats qu elle clive. En effet, il serait possible que les caspases initiatrices puissent cliver certains substrats et aggraver la progression du cancer ou augmenter la malignité de celui-ci dans un contexte de cancer résistant à l apoptose. Dans notre laboratoire, il a déjà été montré que la caspase-8 pouvait notamment cliver SNX1 et SNX2, toutes deux impliquées dans le recyclage et la dégradation de certains récepteurs comme les récepteurs tyrosine kinase (RTK), des récepteurs majeurs impliqués dans la pathogenèse du CCR. Notre laboratoire a aussi démontré que le clivage de ces protéines pourrait avoir des effets tumorigènes en augmentant la signalisation de certains RTK Hypothèse L hypothèse de recherche est que la caspase-8 clive des substrats qui similairement à SNX1 et SNX2, augmenteraient la tumorigénicité et le pouvoir métastatique des cellules cancéreuses résistantes à l apoptose. 26

39 1.7.2 Objectifs Pour vérifier cette hypothèse, je propose de : 1. Développer un modèle de cellules de CCR résistantes à l apoptose à partir de la lignée cellulaire HCT Caractériser les changements phénotypiques causés par la résistance à l apoptose dans ce modèle. 3. De tenter d identifier à l aide d approches protéomiques les substrats de la caspase-8 dans ce modèle de cellules HCT-116 résistantes à l apoptose. 27

40 MATÉRIEL ET MÉTHODES 2.1 Liste des anticorps utilisés Nom Compagnie Dilution utilisée Anti-actine monoclonal de souris #A3853 Sigma-Aldrich (Saint-Louis, MI, USA) 1 :5000 dans le BSA 3% Anti-BAK monoclonal de Cell Signaling (Danvers, MA, lapin #12105 USA) 1 :1000 Anti-BAX monoclonal de lapin #5023 Cell Signaling 1 :1000 Anti-CASP3 monoclonal de 1 :1000 dans PBS lait Cell Signaling souris #9668 5% Anti-CASP7 polyclonal de 1 :1000 dans PBS lait Cell Signaling lapin #9492 5% Anti-CASP8 monoclonal de 1 :1000 dans PBS lait Cell Signaling souris #9746 5% Anti-HA-probe monoclonal Santa Cruz Biotechnology de souris #12CA5 (Dallas, TX, USA) 1 :1000 Anti-HSP90 monoclonal de BD Transduction Laboratories souris # (San Diego, CA, USA) 1 : Anti-lapin lié à HRP #7074 Cell Signaling 1 :5000 dans PBS lait 5% Anti-PARP monoclonal de 1 :1000 dans PBS Cell Signaling lapin #9532 BSA 3% Anti-profiline 1 polyclonal Invitrogen (Waltham, MA, de lapin #PA USA) 0,5 g/ml Anti-profiline 2 polyclonal de lapin #PA Invitrogen 0,1-0,5 g/ml Anti-souris lié à HRP 1 :1000 dans PBS lait Cell Signaling #7076 5% 28

41 Tableau 1 : Anticorps utilisés. Ce tableau contient le nom de l anticorps, son type ainsi que de l espèce de provenance. On y trouve aussi la compagnie de provenance et la dilution utilisée pour les immunobuvardages. 2.2 Constructions plasmidiques et DsiRNA utilisés Nom du plasmide Plasmide de base Origine pcdna3/bclxl3ha pcdna3/3ha-xiap pcdna3 (Invitrogen) pcdna3 (Invitrogen) Stock général de plasmides du laboratoire Stock général de plasmides du laboratoire Tableau 2 : Plasmides utilisés. Ce tableau contient le nom des plasmides utilisés ainsi que la protéine qu ils permettent de produire (en gras), la compagnie ayant produit le plasmide de base et l origine de la construction plasmidique. Nom commercial du DsiRNA Nom utilisé dans le mémoire BAK BAK 1 BAK BAK 2 BAK BAK 3 BAX.13.1 BAX 1 BAX.13.2 BAX 2 BAX.13.3 BAX 3 CASP.13.2 C3 #2 CASP.13.3 C3 #3 Séquences des DsiRNA AGAUGGUCACCUUACCUCUGCAACC UCUCUACCAGUGGAAUGGAGACGUUGG CACCUCAACAUUGCAUGGUGCUAGT CCGUGGAGUUGUAACGUACCACGAUCA GAAUGCCUAUGAGUACUUCACCAAG CUCUUACGGAUACUCAUGAAGUGGUUC GAGUGGCAGCUGACAUGUUUUCUGA GGCUCACCGUCGACUGUACAAAAGACU GUGGGCAUUUUUCUUACUUUUGUAA UGCACCCGUAAAAAGAAUGAAAACAUU GCGUUUUCCUUACGUGUCUGAUCAA UACGCAAAAGGAAUGCACAGACUAGUU GGAAUUGAUGCGUGAUGUUUCUAAA CACCUUAACUACGCACUACAAAGAUUU UCUGUUGAAGUUUACAAUCAAAGGA AAAGACAACUUCAAAUGUUAGUUUCCU Tableau 3 : DsiRNA utilisés. Ce tableau contient le nom commercial et celui utilisé dans ce mémoire ainsi que la séquence des DsiRNA. Tous les DsiRNA ont été achetés chez Intergrated DNA Technologies (Coralville, IA, USA) 29

42 2.3 Culture cellulaire, transfections, invalidation génétique et traitements apoptotiques Les cellules HCT-116 ont été achetées d ATCC. Les cellules HCT-116 CASP7 KO étaient déjà disponibles dans le laboratoire et avaient été générées avec la technique du CRISPR/Cas9. Toutes les cellules utilisées ont été cultivées dans du milieu DMEM à 37 C avec 5% CO2. Au milieu DMEM furent ajoutés 10% de FBS, 2 mm de L-glutamine et 500 UI pénicilline/streptomycine. Tous ces produits proviennent de Wisent Inc (Saint-Bruno, Qc, Canada). La transfection des plasmides et de DsiRNA a été faite avec l aide de polyéthylèneimine (PEI) acheté de Polysciences (Warrington, PA, USA). Différentes quantités d ADN et de PEI furent testées et celle choisie fut 2 g d ADN pour 6 l de PEI, car elle donnait le meilleur pourcentage de transfection. Les cellules adhérées furent transfectées avec les plasmides et les cellules en suspension avec les DsiRNA. Les cellules transfectées ont été récoltées 48 h post-transfection. Le contrôle négatif utilisé pour les DsiRNA (NC-1 ; # ; Intergrated DNA Technologies) était un DsiRNA contre un ARNm qui n est pas présent chez l humain. L invalidation génique de la caspase-3 a été faite par l utilisation de la technique d édition génique CRISPR-Cas9 (U6-gRNA:CMV-eCas9-2a-tGFP; Sigma-Aldrich). La région ciblée par l ARN guide est ACCCGGGTTAACCGAAAGG et se trouve dans la région codante du gène de la caspase-3. Cinq µg du plasmide furent transfectés dans un pétri de 6 cm de cellules HCT-116 CASP7 KO confluentes avec 15 l de lipofectamine 2000 (# ; Invitrogen) selon les instructions du manufacturier. Le milieu fut changé 6 h après la transfection. Dans le plasmide se trouvait le gène GFP afin d identifier par fluorescence les cellules ayant reçu le plasmide. Quarante-huit h post-transfection, les cellules furent triées à la plateforme de cytométrie de l Université de Sherbrooke (BD FACS Aria III) en sélectionnant seulement les cellules fluorescentes. Le protocole fourni 30

43 par la plateforme fut utilisé en lui apportant certaines modifications; ce protocole peut être trouvé sur leur site internet ( consulté le 30 juin 2022). Les modifications apportées au protocole consistent à filtrer les cellules à travers un treillis de 40 m à trois reprises comparativement au protocole initial qui suggérait une seule filtration. L utilisation du FACS a permis de mettre une seule cellule par puis dans une plaque de 96 puits. Dans les puits où une seule cellule avait été mise en culture et avait formé une colonie, le puits fut récolté et l expression de la caspase-3 fut testée par immunobuvardage. Afin d induire la mort cellulaire par apoptose, deux composés ont été utilisés : le TRAIL (KillerTRAIL Soluble Protein #ALX C020; Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA) et la staurosporine (STS; # ; Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA). Une heure avant l ajout de TRAIL, le milieu fut changé pour du DMEM sans sérum. La STS a été ajoutée à du milieu de culture DMEM complet. 2.4 Extraits cellulaires Lors de la préparation d extraits cellulaires de cellules apoptotiques, le milieu de culture a été récolté et centrifugé à 2000 x g durant 5 minutes afin de récolter les cellules détachées. Pour tout autre extrait cellulaire, le milieu fut retiré et seules les cellules adhérées ont été récoltées par plusieurs lavages avec du PBS contenant 2 mm de EDTA/EGTA. Les cellules ont été récoltées et centrifugées 5 minutes à 2000 x g; les cellules ont été lavées au PBS et recentrifugées. Afin de lyser les cellules, du mripa (50 mm Tris, ph 7,4 ; 100 mm NaCl ; 1% NP-40 ; 0.5% acide déoxycolique ; et 0.1% SDS) a été ajouté et laissé en contact avec les cellules durant 30 minutes sur glace. À cette solution furent ajoutés des inhibiteurs de protéases (1 mm 1,10 σ-phénanthroline ; 10 μm 3,4- dichloroisocoumarin, 10 μm E-64 ; et 10 μm leupeptine). Le lysat cellulaire a ensuite été centrifugé à 4 C durant 15 minutes à x g et seulement le surnageant fut récolté et les protéines ont été dosées avec la trousse Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo FisherScientific ; Waltham, MA, USA) et, pour une même expérience, la concentration des différents échantillons a été égalisée en ajoutant du mripa. 31

44 2.5 Immunobuvardages Les extraits cellulaires ont été mélangés avec le tampon de chargement concentré à 3X (40% glycérol ; 0,485 M SDS ; et 1,45 mm de bleu de bromophénol) auquel a été ajouté du DTT pour avoir une concentration finale de 20 mm. Les échantillons ont ensuite été bouillis durant 3 minutes et mis sur gel SDS-PAGE d ammédiol à 12%. Ils ont été séparés à 30 ma durant 30 à 35 minutes (Bury, 1981). Les immunobuvardages visant à détecter la profiline 1/2 ont été faits à l aide de gels à 15%. Les protéines ont été transférées sur une membrane de PVDF (EDM Millipore ; Burlington, MA, USA) à 400 ma pendant 50 minutes dans 50 mm de N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid (CAPS), ph 11, et 10% méthanol. Les membranes ont été bloquées avec du PBS 0,1% Tween-20 et 5% de lait en poudre (Carnation) durant 30 minutes. À la suite du blocage, 3 courts lavages avec du PBS 0,1 % Tween-20 (tous les lavages ont été faits avec cette solution) ont été faits et les anticorps primaires ont ensuite pu être ajoutés (voir Tableau 1). Les anticorps primaires ont été incubés toute la nuit avec agitation et retirés par 3 cours lavages suivis de 3 lavages de 10 minutes avec agitation. Les anticorps secondaires couplés à la peroxidase du rainfort (HRP) ont ensuite été ajoutés et incubés durant 1 heure. Les mêmes lavages ont été faits que pour les anticorps primaires. Les membranes ont été révélées par l ajout du substrat de Luminata Crescendo (EDM Millipore). Dans le cas d un signal faible, le Clarity Max (Bio-Rad ; Hercules, CA, USA) a été utilisé pour sa plus grande sensibilité. La prise d images a été faite avec un système VersaDoc 4000mp (Bio-Rad) et les images ont été analysées à l aide du logiciel QuantityOne de la même compagnie. 2.6 Coloration à l annexine V et iodure de propidium (PI) Le test de coloration à l annexine V a été fait pour les cellules traitées avec TRAIL. Le milieu de culture ainsi que les cellules ont été récoltés à l aide de PBS contenant 2 mm de EDTA/EGTA. La concentration de cellules récoltées fut déterminée et corrigée à cellules/ml. Les cellules furent centrifugées à 700 x g durant 5 minutes, rincées au PBS et la même centrifugation fut répétée. Une fois le surnageant retiré, les solutions suivantes furent ajoutées : 500 l de tampon de liaison (10 mm HEPES, ph 7,0 ; 137 mm 32

45 NaCl ; et 2.5 mm CaCl2) auquel furent ajouté 1 l d Annexine-V (ANXA5-FITC Apoptosis Detection Reagent ; #ab14082; Abcam, Cambridge, Royaume-Uni) et 1 l de PI (#ab14083; Abcam). Le tout fut incubé durant 5 minutes à l abri de la lumière et analysé par cytométrie de flux (Guava EasyCyte mini; Millipore) grâce à un programme créé pour ce test et qui fut optimisé dans le laboratoire pour les cellules HCT Microscopie confocale Marquage des noyaux Les cellules ont été cultivées sur des lamelles couvertes de polylysine (#P6282; Sigma) dans une plaque de 12 puits et l apoptose a été induite avec différentes concentrations de TRAIL durant 2 h. Ce temps fut choisi afin d éviter que les cellules apoptotiques décollent et soient perdues. Elles ont ensuite été fixées pendant 30 minutes à l abri de la lumière avec une solution de paraformaldéhyde à 3% dans du PBS. Les lamelles ont été lavées 2 fois avec du PBS et 1 ml de NH4Cl a été ajouté durant 10 minutes pour neutraliser le paraformaldéhyde. Cette solution a été retirée et les cellules ont été perméabilisées avec 1 ml de PBS 0,1% TrintonX-100 pendant 10 minutes, suivi de 3 lavages avec du PBS avec 1% de sérum de chèvre. Le Hoescht (#H21486 ; Invitrogen) a été ajouté pour obtenir une dilution de 1:5000 dans la solution de blocage (PBS 10 % de sérum de chèvre). Les lamelles ont ensuite été montées sur des lames avec du Prolong Glass Antifade Mountant (Invitrogen). La microscopie confocale a été réalisée avec un LSM Olympus FV1000 et un laser diode avec une longueur d onde de 405 nm. 2.8 Test de vitesse de prolifération Dans des plaques de 12 puits, les cellules HCT-116 parentales ainsi que les cellules HCT- 116 CASP3/7 KO traitées ou non avec 10 ng/ml de TRAIL ont été mises en culture au nombre de cellules par puit. Par la suite, à chaque 24 h durant 120 h, 3 puits par conditions ont été récoltés par trypsinisation et du bleu de trypan (# EL ; Wisent) fût ajouté à une dilution de 1:2. Les cellules ont été comptées à l aide d un hémocytomètre et le nombre de cellules fut déterminé en tenant compte des différents volumes utilisés 33

46 pour diluer les cellules. Le temps de doublement fut déterminé avec le logiciel GrapPad Prism. 2.9 Test de vitesse de migration Dans une plaque de 6 puits, les cellules HCT-116 parentales ainsi que les cellules HCT- 116 CASP3/7 KO traitées ou non avec 10 ng/ml de TRAIL ont été mises en cultures 24 h avant le début de l expérience afin qu elles soient confluentes. Le lendemain, avec un embout de pipette de 2 l, une coupure ( scratch ) a été faite au centre de chaque puits. Les cellules ont été lavées au PBS et du milieu de culture DMEM contenant 1% de FBS a été ajouté. Cette quantité plus faible de FBS vise à réduire la croissance des cellules afin d observer la migration et non une combinaison de prolifération cellulaire et de migration. Les boîtes de Pétri ont été marquées d un trait avec une lame de rasoir afin d identifier une zone précise de la coupure et prendre les photos au même endroit. À la suite de la coupure et les deux jours suivants, une photo a été prise au même endroit et à la même heure afin d analyser la fermeture de la coupure par la migration des cellules. L aire de la coupure a été déterminée avec le logiciel ImageJ Spectrométrie de masse L analyse de spectrométrie de masse des échantillons utilisant la technique SILAC (stable isotope labeling by amino acids in cell culture) a été faite à la plateforme de protéomique de l Université de Sherbrooke. L analyse des échantillons TAILS a été faite à l Université de Calgary en collaboration avec le laboratoire du Professeur Antoine Dufour. Dans la technique SILAC, deux milieux de culture différents ont été utilisés, soient le milieu isotopique léger (R0K0) et le milieu isotopique moyen (R6K4, +10 Da), tous deux provenant de la plateforme de protéomique de l Université de Sherbrooke. La différence isotopique des acides aminés leur donne des masses différentes et permet au spectromètre de masse de distinguer la provenance des échantillons. Les cellules ont été passées quatre fois dans leur milieu respectif afin que les acides aminés non marqués des cellules soient 34

47 remplacés par ceux du milieu SILAC. Les cellules ont été récoltées, lysées (20 mm PIPES, 20 mm KCl, 2 mm MgCl2 (ph 7.4) et 2 mm DTT) et leur cytosol isolé par centrifugation à x g durant 30 minutes (Denault et Salvesen, 2008). Les protéines ont été précipitées sur glace durant 5 minutes avec une solution de 10% TCA et 50% acétone et centrifugées à x g pendant 3 minutes. Le précipité a été lavé deux fois à l acétone 80%. Les étapes suivantes ont été faites sous la supervision de Dominique Lévesque (plateforme de protéomique de l Université de Sherbrooke). Les protéines ont été solubilisées dans une solution de 8 M d urée et 10 mm HEPES, ph 7,5. La concentration protéique a été faite à l aide de la trousse Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo FisherScientific). Les protéines ont été réduites avec l ajout de DTT à 5 mm et l échantillon a été bouilli durant 2 minutes et incubé à température pièce (TP) pendant 30 minutes. Ensuite, du chloroacétamide (7,5 mm de concentration finale) a été ajouté et incubé durant 20 minutes à TP. La concentration d urée a été réduite à 2 M par l ajout d une solution de 50 mm NH4HCO3 et l échantillon a ensuite été traité 16 heures avec 1 g de trypsine à 30 C. L échantillon a finalement été acidifié avec l acide trifluoroacétique à 0,2%. Les échantillons ont été purifiés à l aide de mini colonnes de chromatographie de type ZipTip C18. Les échantillons SILAC ont été séparés par HPLC (Dionex Ultimate 3000 Binary RSLCnano; ThermoFisher) et ont été analysés par spectrométrie de masse en tandem (quadrupole Orbitrap; ThermoFisher) (Chauvin et al., 2022). Pour les échantillons TAILS, les cellules ont été récoltées à l aide d un grattoir et elles ont été centrifugées à 2000 x g durant 5 minutes. Les cellules ont été lavées 2 fois avec du PBS et ont été envoyées au laboratoire du Professeur Antoine Dufour à l Université de Calgary où ils furent analysés selon des méthodes précédemment établies (Kleifeld et al., 2011). Les échantillons TAILS ont été analysés avec un Orbitrap Fusion Lumos Tribid (ThermoFisher Scientific). Pour les deux approches protéomiques, les résultats ont été analysés avec MaxQuant pour obtenir une liste des protéines identifiées à partir des peptides présents dans l échantillon. Les échantillons TAILS ont subi une deuxième analyse avec TopFinder 4.0 qui est un 35

48 outil d analyse pour les peptides N-terminaux. TopFinder permet notamment de montrer les acides aminés présents au site de clivage, une information très importante pour identifier des substrats (Fortelny et al., 2015). RÉSULTATS 3.1 Cellules HCT-116 résistantes à l apoptose Diminution de BAK et BAX par l utilisation de DsiRNA Puisque le projet consistait à trouver de nouveaux substrats de la caspase-8 dans des cellules du cancer colorectal résistantes à l apoptose, la première étape du projet a été de rendre une lignée cellulaire résistante. Pour ce faire, nous avons choisi de travailler avec la lignée cellulaire HCT-116, car ce sont des cellules du cancer colorectal faciles d utilisation et relativement stables génétiquement. Les cellules HCT-116 sont des cellules de type II, donc, elles doivent utiliser la voie intrinsèque de l apoptose afin d initier ce processus (Özören et El-Deiry, 2002). Comme BAK et BAX sont deux protéines essentielles dans ce processus en permettant le relâchement du cytochrome c et de SMAC, réduire leur expression devrait permettre d induire une bonne résistance à l apoptose. De plus, il a été démontré que la répression de leur expression causait une résistance face à la mort cellulaire par apoptose (Wang et Youle, 2012). Avec ces informations, la première approche que nous avons tentée fut donc de diminuer l expression des protéines BAK et BAX avec l utilisation de Dicer-substrate smallinterfering RNA (DsiRNA). L un des avantages d utiliser les DsiRNA à la place des plus traditionnels sirna est qu ils possèdent généralement une meilleure efficacité et moins d effets hors cibles (off target) (Raja et al., 2019). Une fois dans la cellule, il sera transformé en sirna et permettra la dégradation des ARNm ciblés. Cette dégradation peut mener à une diminution presque complète de l expression de la protéine correspondante (Raja et al., 2019). 36

49 A B Figure 6 : Niveaux d expression des protéines BAK et BAX dans les HCT-116 transfectées Les cellules HCT-116 adhérées au pétri ont été transfectées avec différents DsiRNA afin d obtenir la plus grande diminution des protéines BAK (25 kda) et BAX (20 kda). Le niveau d expression de (A) BAK et BAX (B) 48 h post-transfection a été mesuré par immunobuvardage. La quantification de la protéine a été obtenue par densitométrie en comparant le contrôle de chargement, ici HSP90, avec la protéine mesurée et normalisée avec l échantillon DsiRNA contrôle. Afin d obtenir la meilleure diminution des protéines BAK et BAX, trois DsiRNA contre chacune ont été testés afin de déterminer lequel était le plus efficace. Comme le montre la Figure 6A, bien que les DsiRNA BAK 1 et BAK 2 aient donné une bonne réduction de l expression de BAK, ce sont étonnamment les DsiRNA contre BAX 2 et 3 qui ont procuré la plus grande diminution. Pour la protéine BAX (Figure 6B), les DsiRNA BAX 2 et BAX 3 se sont aussi avérés les plus efficaces. Ces résultats sont surprenants considérant que l expression de BAX n est pas connue pour moduler celle de BAK (McLean et al., 2009). À la suite de ces observations, nous avons choisi de seulement 37

50 continuer avec les DsiRNA contre BAX pour diminuer l expression les deux protéines. Cependant, nous voulions la plus grande diminution possible de ces protéines et le niveau résiduel fut jugé trop grand pour induire une résistance satisfaisante face à l apoptose. A B Figure 7 : Niveaux d expression des protéines BAK et BAX dans les HCT-116 transfectées Les cellules HCT-116 en suspension ont été transfectées avec différents DsiRNA afin d obtenir la plus grande diminution des protéines BAK (25 kda) et BAX (20 kda). Le niveau d expression de (A) BAK et BAX (B) 48 h post-transfection a été mesuré par immunobuvardage. La quantification de la protéine a été obtenue par densitométrie en comparant le contrôle de chargement, ici HSP90, avec la protéine mesurée et normalisée avec l échantillon DsiRNA contrôle. Pour obtenir une plus grande diminution de l expression de BAK et BAX, plusieurs conditions dans la méthode de transfection ont été testées, incluant l agent de transfection et le temps de transfection, les quantités d ADN ainsi que le nombre de transfections. Le seul changement ayant eu un impact important sur l expression des protéines fut de transfecter les cellules lorsqu elles étaient en suspension. La Figure 7 montre que la transfection des cellules en suspension a grandement favorisé la diminution de 38

51 l expression des protéines BAK et BAX comparativement aux résultats de la figure précédente. Outre le DsiRNA BAX 3 qui semble n avoir aucun effet sur l expression de BAX, toutes les autres combinaisons ont permis de presque complètement éliminer l expression des protéines BAK et BAX. La quantification des résultats montre une diminution de BAX d au moins 75% et presque complète pour la protéine BAK avec la combinaison de BAX Cependant, la combinaison BAX fut choisie pour poursuivre puisqu elle était la meilleure pour obtenir la plus grande diminution des deux protéines simultanément. Comme la diminution obtenue était presque complète, nous avons testé la résistance à l apoptose induite par la diminution de ces deux protéines. Afin d induire l apoptose, le ligand TRAIL fut utilisé, car il permet de déclencher l apoptose par la voie extrinsèque de manière rapide. Puisque les cellules HCT-116 sont des cellules de type II, elles devront aussi utiliser la voie intrinsèque (Özören et El-Deiry, 2002). Les caspases exécutrices clivent PARP-1 et génèrent un fragment de 89 kda; l apparition de ce fragment est un test couramment utilisé pour montrer la présence d apoptose. Il est aussi souhaitable d observer une diminution de la forme complète de PARP-1 (114 kda) qui devrait être concomitante à l apparition de la forme clivée (Mullen, 2004). Comme il est possible de la voir à la Figure 8, les conditions de transfection qui ont réduit l expression des protéines BAK et BAX ne semblent pas avoir conféré de résistance à l apoptose puisqu un clivage efficace de PARP-1 est observé même pour les cellules dont l expression de BAX et BAK a été réduite. En effet, la forme pleine longueur de PARP-1 disparaît au même rythme chez les cellules contrôles que chez les cellules transfectées et la forme clivée augmente inversement. De plus, la quantification de cette dernière montre des patrons similaires pour les deux conditions. Ces observations nous permettent de dire que la diminution des protéines BAK et BAX par l utilisation de DsiRNA ne semble pas suffisante pour induire une résistance à l apoptose. 39

52 Figure 8 : Résistance à l apoptose par l observation du clivage de PARP-1 dans les cellules HCT-116 transfectées exposées au TRAIL Les cellules HCT-116 transfectées avec des DsiRNA afin de diminuer les protéines BAK et BAX ont été traitées avec différentes concentrations de TRAIL durant 4 h. Le fragment clivé de PARP-1 a été observé par immunobuvardage et quantifié par densitométrie puis normalisé avec le contrôle de chargement, ici l actine. 3.2 Cellules HCT-116 résistantes à l apoptose Augmentation des protéines BCL- XL et XIAP par l utilisation de plasmides Comme il n a pas été possible d observer une résistance à l apoptose avec la première approche, nous avons ciblé d autres protéines clés dans la régulation de l apoptose. Comparativement à la méthode précédente où nous tentions de diminuer des protéines pro-apoptotiques, ici nous tentions d augmenter des protéines anti-apoptotiques. Comme les cellules HCT-116 sont des cellules de type II, l augmentation de BCL-XL et de XIAP simultanément devrait stopper le processus d apoptose. Un niveau plus élevé de BCL-XL 40

53 permettra d augmenter ses effets inhibiteurs sur les protéines pro-apoptotiques BAK et BAX et la surexpression de XIAP, protéine clé dans l établissement du type II, inhibera plus efficacement les caspases exécutrices 3 et 7, ainsi que la caspase-9 de la voie intrinsèque, nous conférant une résistance à l apoptose qui devrait être robuste (Shahar et Larisch, 2020). Il fut d abord important de tester différentes conditions de transfection afin de maximiser l expression des protéines. Ici (Figure 9), bien que seulement le JetPrime ainsi que le PEI soient présentés, plusieurs autres agents de transfection furent testés. Il s est avéré que ce sont les agents présentés qui permettent d avoir le plus haut niveau d expression pour ces protéines. Il est possible de voir dans le puits 9 de la Figure 9 que le PEI et 2 g d ADN permettent d avoir la meilleure expression de BCL-XL. XIAP semble être exprimé moins fortement et de façon similaire entre les différentes conditions. Comme le but était de transfecter les deux plasmides simultanément dans les cellules, le PEI fut choisi, car il est le meilleur pour BCL-XL et le choix de l agent ne semble pas influencer le niveau de XIAP. Ici, bien que le niveau de XIAP exprimé semble plutôt faible, l immunobuvardage ne nous montre pas les protéines endogènes de la cellule. La combinaison des protéines endogènes et de celles surexprimées devrait être suffisante pour induire une résistance à l apoptose. Cette résistance fut évaluée en suivant le même protocole que pour l Objectif 3.1 (Figure 10). Nous avons voulu comparer la résistance obtenue de cette façon avec celle obtenue par l utilisation des DsiRNA contre BAX. Cependant, nous n avons pas observé de diminution importante du fragment clivé de PARP-1 lorsqu on compare les cellules contrôles aux cellules transfectées. 41

54 BCL-XL s Figure 9 : Transfection des cellules HCT-116 afin de surexprimer les protéines BCL- XL et XIAP Deux types d agents de transfection ont été testés afin de maximiser l expression de BCL- XL et XIAP. Les cellules adhérées ont été transfectées et furent récoltées 48 h posttransfection. Les protéines observées par immunobuvardage sont celles générées à la suite de la transfection, car elles possèdent un épitope HA. Les conditions choisies pour transfecter chaque plasmide sont représentées par les rectangles rouges dans le tableau. 42

55 Figure 10 : Résistance à l apoptose par l observation du clivage in cellulo de PARP- 1 dans les cellules HCT-116 surexprimant BCL-XL et XIAP exposées au TRAIL Les cellules furent transfectées avec les DsiRNA contre BAX ou avec des plasmides pour augmenter l expression de BCL-XL et de XIAP. Les cellules HCT-116 transfectées ont été traitées au TRAIL durant 6 h. Le fragment clivé de PARP-1 a été observé par immunobuvardage et quantifié par densitométrie puis normalisé avec le contrôle de chargement, ici l actine. 3.3 Cellules HCT-116 résistantes à l apoptose Diminuer l expression des caspases exécutrices La modulation des protéines régulant l apoptose ne nous a pas permis d induire une résistance à l apoptose. Nous avons donc choisi de diminuer, voir même complètement retirer les caspases exécutrices, celles responsables du clivage de plusieurs substrats clés nécessaire au déroulement de l apoptose. En empêchant leur activation, une résistance à l apoptose devrait être obtenue en permettant toujours l activation des caspases initiatrices. 43

56 Nous possédions déjà des cellules HCT-116 CASP7 KO et il a d abord fallu vérifier par immunobuvardage que la caspase-7 était belle et bien absente (Figure 11A). Nous avons testé si l invalidation génique de cette caspase était suffisante pour procurer une résistance à l apoptose. Dans ce test, les HCT-116 qui n avaient subi aucune modification génique [cellules parentales (CP)] furent comparées aux cellules HCT-116 CASP7 KO. Comme montré à la Figure 11B, l invalidation seule de la caspase-7 n est pas suffisante pour induire une résistance à l apoptose. En effet, il n est pas possible d observer une diminution évidente du fragment clivé de PARP-1 entre les CP et les celles n exprimant pas la caspase-7 pour une même concentration de TRAIL. La quantification de cette analyse confirme bien ce résultat. A B Figure 11 : Résistance à l apoptose par l observation du clivage in cellulo de PARP- 1 dans les cellules HCT-116 CASP7 KO exposées au TRAIL (A) Le niveau d expression de la caspase-7 a été mesuré par immunobuvardage dans les cellules HCT-116 CP et CASP7 KO. La flèche noire pointe la caspase-7. (B) Les cellules HCT-116 CP et CASP7 KO ont été traitées avec différentes concentrations de TRAIL durant 4 h. Les extraits cellulaires ont été analysés par immunobuvardage avec les anticorps indiqués. Le fragment clivé de PARP-1 fut quantifié par densitométrie et normalisé avec le contrôle de chargement, ici l actine. 44

57 Puisque la délétion de la caspase-7 ne semblait pas être suffisante, nous avons voulu réduire l expression de la caspase-3 dans les cellules HCT-116 CASP7 KO. Pour y arriver, nous avons utilisé des DsiRNA qui ont été transfectés lorsque les cellules étaient toujours en suspension comme pour les résultats présentés à la Figure 7. À la suite de plusieurs essais de transfection, une diminution quasi complète de la caspase-3 a été obtenue en utilisant un seul ou une combinaison de DsiRNA contre la caspase-3 (Figure 12). Considérant que la caspase-7 était absente et que l activation de la caspase-6 est faite par la caspase-3, une résistance à l apoptose robuste est attendue. Figure 12 : Niveau d expression de la caspase-3 dans les cellules HCT-116 CASP7 KO transfectées Les cellules HCT-116 CASP7 KO ont été transfectées en suspension avec des DsiRNA contre la caspase-3. Les niveaux d expression ont été mesurés par immunobuvardage, quantifiés par densitométrie et normalisés avec le contrôle de chargement, ici HSP90. Afin d évaluer la résistance à l apoptose suite à la répression de l expression de la caspase-3, le TRAIL fut utilisé (Figure 13). Bien que l expression de la caspase-3 ait été grandement réduite, aucune résistance marquée à l apoptose n a pu être observée. Le fragment clivé de PARP-1 était présent à des niveaux similaires entre les différentes cellules et la quantification nous montre qu il n y a pas eu de diminution de ce fragment. 45

58 Figure 13 : Résistance à l apoptose par l observation du clivage de PARP-1 dans les cellules HCT-116 CASP7 KO transfectées exposées au TRAIL Les cellules HCT-116 CASP7 KO ont été transfectées avec des DsiRNA contre la caspase-3. L apoptose fut induite avec différentes concentrations de TRAIL durant 8 h. Le fragment clivé de PARP-1 a été observé par immunobuvardage, quantifié par densitométrie et normalisé avec le contrôle de chargement, ici l actine. Afin de surmonter l incapacité à induire une résistante à l apoptose, nous avons complètement retiré la caspase-3 des cellules HCT-116 CASP7 KO en utilisant la technique d édition génique CRISPR/Cas9. De plus, comme la caspase-6 est activée par la caspase-3, l absence de la caspase-3 devrait empêcher son activation ; donc, aucune activité des caspases exécutrices ne devrait être présente (Slee et al., 2001). Plusieurs clones ont été obtenus et la présence de la caspase-3 fut évaluée par immunobuvardage (Figure 14). Le clone A2 a été choisi, car aucune bande correspondant à la caspase-3 (32 kda) n est observée. 46

59 Figure 14 : Validation de l absence de la caspase-3 dans des clones de cellules HCT- 116 CASP7 KO CRISPR/Cas9 Les cellules furent transfectées avec un plasmide comportant tous les éléments nécessaires à l édition du gène CASP3. Des clones furent isolés par cytométrie de flux et l expression de la caspase-3 fut analysée par immunobuvardage avec la protéine HSP90 comme contrôle de chargement. Comme une lignée stable de cellules HCT-116 CASP3/7 KO a été établit, il était maintenant possible d évaluer sa résistance à l apoptose. Pour ce faire, l apoptose a été induite dans les CP ainsi que dans les cellules KO; cette fois-ci, jusqu à 300 ng/ml de TRAIL fut utilisé dans ces essais. L invalidation des deux caspases exécutrices cause une résistance à l apoptose franche (Figure 15). En effet, les CP montrent le clivage de PARP-1 à partir d une dose de 10 ng/ml et plus de 50% de clivage de PARP-1 est observée à 30 ng/ml. Comparativement aux cellules CP, les cellules HCT-116 CASP3/7 KO n ont montré quasiment aucun clivage de PARP-1. Même à la concentration de TRAIL de 300 ng/ml, un très faible clivage de PARP-1 est observé ce qui est mit en évidence par la quantification de l intensité de la bande clivée. La différence entre les deux lignées cellulaires est frappante et montre bel et bien qu une résistance robuste à l apoptose a été induite. 3.4 Résistance à l apoptose induite dans les HCT-116 CASP3/7 KO Marquage à l annexine-v et au PI Bien que l observation du clivage de PARP-1 soit un test couramment utilisé et reconnu, il était important de démontrer cette résistance en testant différents aspects clés de l apoptose. L un de ceux-ci est l exposition du PtdSer sur le feuillet externe de la 47

60 membrane plasmique qui est possible de marquer avec l annexine V, ici couplée au fluorophore FITC. Figure 15 : Résistance à l apoptose par l observation du clivage in cellulo de PARP- 1 dans les cellules HCT-116 CASP3/7 KO exposées au TRAIL Les CP et les cellules HCT-116 CASP3/7 KO ont été traitées avec différentes concentrations de TRAIL durant 6 h afin d induire l apoptose. Le fragment clivé de PARP-1 a été observé par immunobuvardage, quantifié par densitométrie puis normalisé avec le contrôle de chargement, ici l actine. Les cellules traitées au TRAIL ont été marquées avec l annexine-v couplée au FITC qui marque les PtdSer et le PI. Les différentes populations cellulaires ont ensuite été analysées par cytométrie de flux. Ici, seulement la quantification des cellules apoptotiques est présentée; dans cette population de cellules se trouvent les cellules annexine V+/PI- (apoptose précoce) ou annexine V+/PI+. 48

61 A B Figure 16 : Résistance à l apoptose par le marquage avec annexine-v et PI pour quantifier le pourcentage de cellules apoptotiques (A) Résultats représentatif d analyse de cytométrie en flux de CP et cellules HCT-116 CASP3/7 KO traitées ou non avec 300 ng/ml de TRAIL. (B) Les cellules ont été traitées avec différentes concentrations de TRAIL durant 4 h afin d induire l apoptose puis analysées. Les cellules apoptotiques représentent les cellules annexine V+/PI- ou annexine V+/PI+ (les deux quadrants de droite). Les cellules contrôles n ont reçu aucun 49

62 marquage. n=3. Les étoiles représentent la valeur-p (Student s t test) en comparant la moyenne des deux populations. *** P < et **** P < (apoptose tardive). Pour les cellules HCT-116 CASP3/7 KO, le pourcentage de cellules apoptotiques était faible considérant qu il est le même entre les cellules traitées avec 300 ng/ml de TRAIL et celles non traitées. Au contraire, les CP montrent un pourcentage croissant de cellules apoptotiques pour arriver à 89 % pour les concentrations supérieures de TRAIL. La différence de cellules apoptotiques entre les deux lignées cellulaires montre encore une fois que les cellules HCT-116 CASP3/7 KO sont résistances à l apoptose (Figure 16). 3.5 Résistance à l apoptose induite dans les HCT-116 CASP3/7 KO Marquage des noyaux et visualisation par microscopie confocale Nous avons aussi évalué la condensation de la chromatine et la fragmentation nucléaire (Häcker, 2000), deux phénotypes importants survenant durant l apoptose. Pour ce faire, la microscopie confocale fut choisie comme méthode d imagerie afin de visualiser ces changements morpho-nucléaires ; le marquage de l ADN avec le Hoechst permet de bien visualiser le noyau et les changements qu il subit (Crowley et al., 2016). Cette méthode devrait permettre de montrer une diminution importante de la taille du noyau ainsi que l apparition de plusieurs petites vésicules montrant la condensation de la chromatine. Les CP ont montrées, à partir de 100 ng/ml de TRAIL, une diminution importante du volume du noyau ainsi que la fragmentation de celui-ci (Figure 17). Cependant, les cellules HCT-116 CASP3/7 KO ne montrent aucun changement, peu importe la concentration de TRAIL utilisée. Cette absence de changement montre, une fois de plus, que ces cellules sont résistantes à l apoptose. 50

63 CASP3/7 KO 100 m Figure 17 : Résistance à l apoptose par le marquage des noyaux Images de microscopie confocale de CP ainsi que de cellules HCT-116 CASP3/7 KO où l apoptose a été induite avec différentes concentrations de TRAIL. Le marquage des noyaux a été fait par l utilisation de Hoechst (bleu) qui marque l ADN des cellules. 51

64 À la suite des multiples tests afin de démontrer la résistance à l apoptose, les cellules HCT-116 CASP3/7 KO sont un modèle idéal pour étudier les substrats des caspases initiatrices dans un contexte de résistance à l apoptose. 3.6 Caractérisation des cellules HCT-116 CASP3/7 KO Tester la capacité d activation de la caspase-8 Bien que ce soient les caspases exécutrices 3 et 7 qui ont été retirées et qu il y ait peu de chance que cela affecte l activité de la caspase-8, nous avons tout de même vérifié qu elle soit toujours activable. À la Figure 18, il est possible d observer par immunobuvardage sa forme pleine longueur représentée par deux bandes de 53 et 55 kda (Scaffidi et al., 1997). Ces deux bandes sont dues aux deux isoformes de la caspase-8 présentes chez l humain. L anticorps utilisé reconnaît la grande sous-unité. Donc, il est possible d observer la première étape du clivage où la petite sous-unité est retirée (10kDa), créant une paire de bandes de 41 et 43 kda contenant le domaine N-terminal et la grande sous-unité. Aussi, il est possible d observer la grande sous-unité seule ce qui montre qu il y a présence de la caspase-8 tests Figure 18 : Validation de l activation de la caspase-8 L apoptose a été induite dans les CP est les cellules HCT-116 CASP3/7 KO avec différentes concentrations de TRAIL durant 5 h. Les différentes formes de la caspase-8 ont été observées par immunobuvardage avec la protéine HSP90 comme contrôle de chargement. 52

65 active, car pour former un dimère, elle doit la détacher de la petite sous-unité et du DNT. La présence seule de la grande sous-unité indique qu il y a eu clivage et qu il a donc eu formation d un dimère actif. La Figure 18 permet donc d observer que dans les cellules HCT-116 CASP3/7 KO, la caspase-8 est toujours activable. 3.7 Caractérisation des cellules HCT-116 CASP3/7 KO Vitesse de prolifération Une fois qu une lignée cellulaire résistante à l apoptose fut établie, il était important d en faire la caractérisation. Nous avons déjà établi que l édition génique des cellules nous a permis d altérer les mécanismes apoptotiques, mais nous ne savions pas si d autres processus cellulaires avaient été affectés. Ceci est important, car nous utiliserons ce modèle pour étudier l impact du clivage de certaines protéines par la caspase-8 dans un contexte de cancer et nous voulions regarder si ce clivage pouvait impacter certaines caractéristiques affectées par le cancer comme la vitesse de prolifération. Cette caractérisation permettra de différencier les impacts que les protéines clivées auront de ceux causés par l édition génique des caspases 3 et 7. La Figure 19 montre qu entre les CP et les cellules HCT-116 CASP3/7 KO, aucune différence importante n est observée quant à l allure de la courbe de croissance. Nous observons en effet des temps de doublement (TD) similaire, soit 19,8 h pour les CP et 19,3 h pour les cellules HCT-116 CASP3/7 KO. Les cellules doubles KO ont aussi été mises en présence d une quantité faible de TRAIL (10 ng/ml) afin de voir si dans un contexte de résistance à l apoptose, l activation de la caspase-8 pouvait stimuler la prolifération. Ces cellules traitées voient leur TD grandement augmenté, soit à 36,5 h. Ici, la concentration faible de TRAIL de 10 ng/ml fut choisie, car c est la seule pour laquelle les cellules survivaient sur la durée complète du temps du test. Il est donc possible de dire que la délétion des caspases exécutrices ne semble pas modifier la vitesse de prolifération et qu un traitement à faible concentration de TRAIL des cellules résistantes à l apoptose est suffisant pour grandement réduire cette vitesse. Les raisons derrière ce phénomène seront expliquées en plus amble détails dans la discussion. 53

66 3.8 Caractérisation des HCT-116 CASP3/7 KO Vitesse de migration Une autre caractéristique importante à évaluer est la vitesse de migration des cellules puisqu il s agit aussi d une caractéristique importante des cellules cancéreuses (Li et al., 2013). Il est recommandé d utiliser un agent stoppant le cycle cellulaire dans un test de migration cellulaire, mais puisque les CP et les cellules HCT-116 CASP3/7 KO se divisent à des vitesses très similaires, il est donc possible de simplement réduire le FBS à * Figure 19 : Essais de prolifération Des CP ainsi que des cellules HCT-116 CASP3/7 KO traitées ou non avec du TRAIL (10 ng/ml) ont été misent en culture au nombre de cellules par puits. À chaque 24 h, trois puits furent récoltés et les cellules ont été comptées. Le temps de doublement (TD) a pu être déterminé pour chaque condition afin de comparer leur vitesse de prolifération. n=4. Les étoiles représentent la valeur-p (two-way ANOVA). * P < %, ce qui permet de limiter la prolifération et d observer principalement la migration. Comme le montre la Figure 20, nous avons établi une zone exempte de cellules en grattant avec un embout de pipette. Cette expérience comprenait les CP et les cellules HCT-116 CASP3/7 KO traitées (10 ng/ml) ou non avec du TRAIL. Entre les trois conditions, aucune différence dans la vitesse de migration cellulaire n a été observée (Figure 21). Vingt-quatre heures après la rayure, celle-ci s était refermée d environ 40% uniformément dans les trois conditions. À 48 h, les trois conditions ont montré un ralentissement dans leur vitesse de migration. Les CP ainsi que les cellules CASP3/7 KO 54

67 non traitées ont refermé 20 % additionnel de la rayure donnant une fermeture finale de près de 60%. En comparaison, les cellules traitées avec TRAIL ont eu une fermeture 0 72 h Figure 20 : Essai de migration Voici un exemple d une rayure qui a été faite dans un pétri de cellules confluentes CP. La même morphologie était observée dans les cellules HCT-116 CASP3/7 KO et la coupure était faite de la même façon. Les cellules ont été cultivées dans du milieu réduit en FBS (1%). Les deux images représentent le même endroit du pétri et montrent la migration des cellules en 72 h. NS NS Figure 21 : Essais de migration Des CP ainsi que des cellules HCT-116 CASP3/7 KO traitées ou non avec du TRAIL ont été misent en culture et incubées jusqu à confluence. Deux rayures ont été faites par condition et l aire de cette rayure fut déterminée pour établir le pourcentage de fermeture de celle-ci. n=3. NS = non significatif. 55

68 finale d environ 50%, ce qui ne représente pas une différence qui est franche, lorsque comparée avec les cellules non traitées. Le retrait des caspases ou le traitement au TRAIL ne semblent donc pas avoir d effet sur la vitesse de migration des cellules. 3.9 Identification des substrats de la caspase-8 dans les HCT-116 CASP3/7 KO - SILAC La première technique utilisée pour l identification des substrats est le SILAC. Bien que cette méthode ne soit pas particulièrement adaptée pour les protéases, nous l avons utilisée initialement pour une raison de proximité, car nous pouvions rapidement mettre au point les conditions expérimentales et faire l analyse des résultats à la plateforme de protéomique du département d immunologie et de biologie cellulaire de l Université de Sherbrooke. Substrat potentiel de la caspase-8 Figure 22 : Schéma expérimental de l approche SILAC Les cellules HCT-116 CASP3/7 KO ont été cultivées dans deux milieux de culture isotopique différents (léger : R0K0 ; médium : R6K4). L apoptose a été induite dans les cellules misent en culture dans le milieu médium. Les cellules des deux conditions ont été récoltées et lysées. Les deux échantillons ont été mélangés et digérés à la trypsine pour ensuite être analysés par spectrométrie de masse tandem. Figure réalisée avec BioRender.com. 56

69 Dans l approche SILAC, seulement les cellules HCT-116 CASP3/7 KO ont été utilisées (Figure 22). L apoptose a été induite avec 100 ng/ml de TRAIL durant 3 heures dans les cellules qui ont été cultivées dans le milieu médium (R6K4) et celles qui ont été cultivées dans le milieu léger (R0K0) n ont subi aucun traitement. Les cellules ont ensuite été récoltées et analysées par spectrométrie de masse tandem. Si la présence d un peptide n est pas influencée par l apoptose, il possédera un ratio médium/léger égal à 1 et ne sera pas considéré comme un substrat potentiel. Les peptides ayant des ratios plus grands ou plus petits que 1 montrent qu il y est possible que l activité des caspases module la présence de ceux-ci. Les peptides avec un ratio médium/léger supérieur à 1 peuvent provenir de potentiels substrats de la caspase-8, car ils sont plus abondants dans les cellules traitées avec le TRAIL. Comme ces peptides n'existeraient pas en l absence de l activité des caspases, cela explique qu ils se trouvent majoritairement dans l échantillon traité au TRAIL. Les peptides avec un ratio inférieur à 1 peuvent être dus à l activité des caspases qui, en clivant une protéine, empêche la formation d un peptide précédemment identifié et génèrent des peptides qui ne sont pas détectables en protéomique. Figure 23 : Schéma à l échelle des différentes classes de peptides détectés en spectrométrie de masse SILAC L analyse de spectrométrie de masse a permis d identifier peptides et 5293 de ceux-ci avaient un ratio MÉDIUM/LÉGER > 1. Parmi ces derniers, 11 possèdent un résidu aspartate (D) en P1. 57

70 Tableau 4 : Protéines identifiées avec l approche SILAC qui possèdent un site de clivage suivant un résidu aspartate Ratio MÉDIUM/LÉGER normalisé Nom du gène 4,04 KMT2D 1,67 TRIM10 Nom de la protéine Histone-lysine N- methyltransferase 2D Tripartite motifcontaining protein 10 Site de clivage AAKD-L DEFD-L 1,39 ACTA2 Actine alpha 2 ELPD-G 1,38 GAPDH Glycéraldéhyde- 3-phosphate déshydrogénase VIHD-N 1,38 VIRD-S 1,28 PFN1 Profiline-1 LLQD-G 1,19 RAB1A 1,18 CAND1 1,14 SULT1A 3 1,11 LHPP 1,02 CSNK2 A1 Ras-related protein Rab-1A Cullin-associated NEDD8- dissociated protein 1 Sulfotransférase 1A1 Phospholysine phosphohistidine pyrophosphate phosphatase Sous-unité de la caséine kinase II EFAD-S LKID-A FDAD-Y VIAD-A EALD-F Fonction de la protéine Remodelage de la chromatine Différenciation des cellules sanguines Structure et mouvement cellulaire Participe à la glycolyse Lie l actine et module le cytosquelette Trafic membranaire intracellulaire Ubiquitine des protéines Sulfonation des protéines Hydrolyse divers substrats possédant un diphosphate Cycle cellulaire et infection virale Localisation cellulaire Noyau Cytoplasme Cytosquelette Cytosol, cytosquelette et noyau Cytoplasme et cytosquelette Cytosol, endosome, Golgi et membrane plasmique Cytoplasme et noyau Cytoplasme Cytoplasme et noyau Noyau Les informations sur la fonction et la localisation proviennent d UniProt ( Les sites de clivage en gras sont ceux qui correspondent le mieux au site de clivage préférentiel de la caspase-8. L analyse de spectrométrie de masse nous a permis d obtenir peptides. De ceuxci, 5293 peptides avaient un ratio médium/léger supérieur à 1 et 11 de ces peptides possèdent un résidu aspartate en P1, mais seulement 4 possèdent un site de clivage susceptible d être clivé par la caspase-8 (Figure 23). Parmi ces 4 peptides, deux provenaient de la même protéine, la profiline-1 (PFN-1) et montraient certains des ratios les plus élevés, quoi qu en deçà du seuil généralement utilisé de 1,5. La profiline-1 était 58

71 la seule à posséder en P1 les acides aminés préférentiels à cette position, soit la glycine, alanine et sérine (Stennicke et al., 2000). De plus, cette protéine a été identifiée avec deux peptides, augmentant la certitude qu elle avait été réellement observée et n était pas simplement un artéfact (Tableau 4). C est pour toutes ces raisons que nous avons testé s il était possible d observer le clivage de la profiline-1 in cellulo (Figure 24). Pour ce faire, l apoptose fut induite de deux façons, soit le TRAIL et la staurosporine (STS), un inhibiteur non sélectif des protéines kinases. Afin d affirmer qu il y avait bien le clivage de la profiline-1, l observation d un fragment de clivage est importante. Puisque les deux sites de clivages identifiés se trouvent au centre de la protéine, un anticorps reconnaissant l extrémité C-terminal fut choisi. Cependant, il fut impossible d observer le fragment clivé, autant dans les cellules traitées au TRAIL qu à la STS. A B Figure 24 : Validation in cellulo du clivage de PFN1 Les CP et cellules HCT-116 CASP3/7 KO ont été traitées avec différentes concentrations de STS durant 24 h (A) ou avec différentes concentration de TRAIL durant 6 h (B) afin d induire l apoptose. Pour chaque condition, la profiline-1 a été détectée par immunobuvardage avec la protéine HSP90 comme contrôle de chargement. Bien qu il n ait pas été possible d observer le fragment clivé de la profiline-1, il était intéressant d investiguer la profiline-2 (PFN-2) qui possède les mêmes sites de clivage que ceux identifiés par spectrométrie de masse pour la profiline-1. Les mêmes tests d apoptose ont été faits et comme il est possible de le voir à la Figure 25, le traitement à la STS semble réduire le niveau de la profiline-2, mais il n a pas été possible d observer le fragment clivé. Les cellules traitées au TRAIL n ont pas montré de diminution importante de la profiline-2 ni l apparition d un fragment clivé. 59

72 A B Figure 25 : Validation in cellulo du clivage de PFN2 Les CP et les cellules HCT-116 CASP3/7 KO ont été traitées avec différentes concentrations (A) de STS durant 24 h ou (B) de TRAIL durant 6 h afin d induire l apoptose. Pour chaque condition, la profiline-2 a été détectée par immunobuvardage avec la protéine HSP90 comme contrôle de chargement Identification des substrats de la caspase-8 dans les HCT-116 CASP3/7 KO TAILS Comme mentionné précédemment, la méthode SILAC n est pas optimale pour identifier des substrats de protéases. Pour y remédier, nous avons utilisé la technique TAILS (Figure 26). L un des deux pétris a été traité durant 3 h avec 100 ng/ml de TRAIL. Une fois récoltées les cellules furent analysées dans le laboratoire du Professeur Antoine Dufour (Université de Calgary). Les protéines ont été extraites et l échantillon apoptotique a été traité avec du formaldéhyde léger ([ 12 C]H2-formaldéhyde) et lourd ([ 13 C]H2-formaldéhyde) pour l échantillon des cellules non apoptotiques. Les deux échantillons ont été joints, puis digérés à la trypsine qui génère de nouvelles amines primaires qui lieront un polymère d aldéhyde; les peptides générés par le clivage avant la digestion à la trypsine ont des amines primaires bloquées par le formaldéhyde. Cette étape permet d enrichir négativement les peptides provenant des peptides N-terminaux naturels ou générés par protéolyse, permettant de grandement décomplexifier un échantillon. 60

73 Figure 26 : Schéma expérimental de l approche TAILS Des cellules HCT-116 CASP3/7 KO traitées ou non avec 100 ng/ml de TRAIL durant 3 h ont été récoltées et analysées. Se référer au texte pour l explication plus détaillée. Les peptides jaunes sont ceux générés par l activité des caspases. Figure réalisée avec BioRender.com. 61

74 Tableau 5 : Protéines identifiées avec l approche TAILS qui possédaient un ratio LÉGER/MÉDIUM > 1,5 Essai #1 Essai #2 Nom de la protéine Alpha-1,3-mannosylglycoprotein 4-beta-Nacetylglucosaminyltrans ferase (MGAT4A) Tubulin beta-6 chain (TUBB6) Histone H2A type 1-J (H2AC14) Interferon epsilon (IFNE) N-glycosylase/DNA lyase (OGG1) Serine/threonineprotein phosphatase 6 regulatory subunit 1 (PPP6R1) Ratio LÉGER/ MÉDIUM normalisé 129,9 117,2 52,9 43,2 Fonction de la protéine Transport du glucose Composante des microtubules Participe à la condensation de l ADN en chromatine Lutte contre les infections 26,3 Répare l ADN 17,9 Dystroglycan 1 (DAG1) 16 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A0 (HNRNPA0) THO complex subunit 4 (ALYREF) Putative ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 41 (USP41) Forkhead box protein J3 (FOXJ3) Heat shock protein HSP 90-beta (HSP90AB1) Sous-unité régulatrice de PP6 Composante de la membrane 15,4 Lie l ARNm 14,4 14,2 13,4 9,9 TGF 9 Ras GTPase-activatinglike protein IQGAP1 PDZ domain-containing protein 2 (PDZD2) 6,2 6,1 Exporte l ARNm du noyau Hydrolyse des liens peptidiques Régule les fibres musculaires Protéine chaperon Routage intracellulaire Assemblage du cytosquelette d actine Adhésion cellulaire Nom de la protéine Ubiquitin-conjugating enzyme E2 variant 2 (UBE2V2) IQ domain-containing protein C (IQCC) Ratio LÉGER/ MÉDIUM normalisé 478,6 Histone H2A.V 94,6 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A0 (HNRNPA0) Tubulin beta-6 chain (TUBB6) 60S ribosomal protein L29 (RLP29) Gem-associated protein 7 (GEMIN7) Serine/threonine-protein phosphatase PP1-beta catalytic subunit (PPP1CB) Heat shock protein HSP 90-beta (HSP90AB1) Heat shock 70 kda protein 6 (HSPA6) Tubulin beta-6 chain (TUBB6) THUMP domaincontaining protein 1 (THUMPD1) T-complex protein 1 subunit epsilon (CCT5) Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 (HNRNPA1) Fonction de la protéine Module la transcription de certains gènes 155,7 - Remplace l histone H2A dans certains nucléosomes 57,7 Lie l ARNm 25,6 23,8 22,6 14,7 9,9 9,5 7,6 6,4 5,5 4,8 Annexin A2 (ANXA2) 4,4 Composante des microtubules Composante de la grande sous-unité du ribosome Épissage de l ARNm Division cellulaire et métabolisme Protéine chaperon Protéine chaperon Composante des microtubules Lie l ARNt et aide à son acétylation Protéine chaperon Transport l ARN du noyau au cytoplasme Liaison membranaire KRBA1 6,1 Régulateur de transcription Adenylate kinase 2 (AK2) 4,2 Métabolisme de l AMP 62

75 Zinc finger protein 175 (ZNF175) Mitochondrial import inner membrane translocase subunit Tim8 B (TIMM8B) Adenylate kinase 2 (AK2) 5,1 4,7 4,1 Diminue l expression des certains récepteurs chémokines Transporte certaines protéines dans la mitochondrie Métabolisme de l AMP Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1 (HNRNPA2B1) Probable ATPdependent RNA helicase DDX17 4,1 3,4 Aide au transport de l ARN Déroule et modifie l ARN Les informations sur la fonction des protéines proviennent d UniProt ( Les protéines en gras sont des substrats potentiels des caspases déjà répertoriés par Degrabase (Crawford et al., 2013). Tableau 6 : Protéines identifiées avec l approche TAILS qui possédaient un ratio LÉGER/MÉDIUM < 0,5 Essai #1 Essai #2 Nom de la protéine THO complex subunit 4 (ALYREF) Ratio LÉGER/ MÉDIUM normalisé 0,182 Sorbitol dehydrogenase 0,162 Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1 (HNRNPA2B1) Acyl-protein thioesterase 2 (LYPLA2) 0,035 0,014 Fonction de la protéine Exporte l ARNm nucléaire Métabolisme du sorbitol Déroule et modifie l ARN Hydrolyse les acides gras Nom de la protéine Ratio LÉGER/ MÉDIUM normalisé NAD kinase 0,496 Ral GTPaseactivating protein subunit alpha-2 (RALGAPA2) Adenylate kinase 2 (AK2) 0,397 0,337 Frizzled-8 (FZD8) 0,083 Ras-related protein Rab-40C 0,027 Fonction de la protéine Métabolisme de l ATP Sous-unité catalytique du complexe RalGAP Métabolisme de l AMP Récepteurs des protéines Wnt Sous-unité de l ubiquitine E3 Les informations sur la fonction des protéines proviennent d UniProt ( Les protéines en gras sont des substrats potentiels des caspases déjà répertoriés par Degrabase (Crawford et al., 2013). La première analyse TAILS a identifié en pretails (analyse faite avant l enrichissement négatif des peptides de clivages) 9746 peptides. Le TAILS a condensé ce nombre à 436 peptides, mais aucun de ceux-ci ne possédait un résidu aspartate en P1. Le Tableau 5 montre les peptides qui ont augmenté à la suite de l induction de l apoptose et le Tableau 6 montre les protéines qui ont diminué. Plusieurs de ces protéines sont identifiées dans la 63

76 base de données Degrabase (Crawford et al., 2013) comme des substrats potentiels des caspases. Par contre, aucun de ceux-ci n est un substrat connu de la caspase-8. De ces peptides, 35 correspondaient à l extrémité N-terminale usuelle d une protéine. Comme ces résultats suggèrent qu aucun peptide n ait été généré par l activité des caspases et que cela était surprenant, nous avons réanalysé ces mêmes échantillons une seconde fois, sans avoir plus de succès (Figure 27). Nous attendons présentement d autres résultats de TAILS avec de nouveaux échantillons. Figure 27 : Schéma à l échelle des différentes classes de peptides détectés en spectrométrie de masse TAILS Les échantillons ont été analysés à deux reprises et ont permis d obtenir en pretails 9746 et 9495 peptides, respectivement. De ces analyses, il y a eu 436 et 306 peptides d identifiés à la suite de l enrichissement TAILS, mais aucun de ceux-ci ne possédait un résidu aspartate en P1. 64