SOLABIA SAS 29 RUE DELIZY PANTIN. NF VALIDATION Validation des méthodes alternatives d analyse Application à la microbiologie alimentaire

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1 ACCREDITATION N PORTEE DISPONIBLE SUR SOLABIA SAS 29 RUE DELIZY PANTIN NF VALIDATION Validation des méthodes alternatives d analyse Application à la microbiologie alimentaire Rapport de synthèse Validation EN ISO de la méthode COMPASS Agar pour la détection de spp. et de monocytogenes dans les produits d alimentation humaine et les échantillons de l environnement Méthode qualitative Ce rapport comprend 117 pages dont 12 annexes. La reproduction de ce rapport n est autorisée que sous sa forme intégrale. L accréditation du COFRAC atteste de la compétence du laboratoire pour les seuls essais couverts par l accréditation qui sont identifiés par le symbole. 30 janvier 2015 ADRIA DEVELOPPEMENT Creac h Gwen - F QUIMPER Cedex - Tél. (33) Fax (33) adria.developpement@adria.tm.fr - Site web : ASSOCIATION LOI DE N SIRET N EXISTENCE N TVA FR

2 Sommaire Rappel sur la méthode alternative Historique de la validation Protocole et principe de la méthode alternative Méthode de référence à laquelle la méthode alternative a été comparée Domaine d application demandé... 7 Principaux résultats obtenus lors de la validation initiale et des études de reconduction et d'extension Etude comparative des méthodes Etude de validation initiale (2002) Etude de spécificité (24 et 48 h) Limite de détection intrinsèque (24 h et 48 h) Limite de détection en matrices (24 h et 48 h) Etude de justesse Etude de reconduction (2007) Exactitude relative, spécificité relative et sensibilité relative Niveau de détection relatif Inclusivité / exclusivité Praticabilité Conclusion Etude d extension (2007) Protocole Résultats Conclusion Etude d extension (2011) Exactitude relative, spécificité relative et sensibilité relative Niveau de détection relatif Inclusivité - Exclusivité Conclusion Etude d extension (2013) Inclusivité et exclusivité Conclusion Etudes inter-laboratoires Etude de validation initiale (2002) Etude de reconduction (2007) Organisation de l étude Contrôle des paramètres expérimentaux Résultats des analyses Calculs Interprétation Conclusion...46 ADRIA Développement 2/ janvier 2015

3 Annexe 1 - Méthode COMPASS Agar 47 Annexe 2 - Méthode de référence NF EN ISO /A1 (février 2005) 49 Etude de reconduction (2007) Annexe 3 Souches utilisées et stress appliqués 50 Annexe 4 Résultats bruts de l exactitude relative 52 Annexe 5 Résultats bruts de l inclusivité et de l exclusivité 62 Etude d extension (2007) Annexe 6 Résultats bruts de l inclusivité et de l exclusivité 64 Etude d extension (2011) Annexe 7 Souches utilisées et stress appliqués 77 Annexe 8 Résultats de l exactitude relative 79 Annexe 9 - Résultats bruts de l inclusivité et l exclusivité 90 Etude d extension (2013) Annexe 10 - Résultats bruts de l inclusivité et l exclusivité 101 Etude de reconduction (2007) Annexe 11 - Degré d accord 115 Annexe 12 - Calcul de la concordance 117 ADRIA Développement 3/ janvier 2015

4 Avant Propos L ensemble des renseignements permettant de valider la garantie des analyses est tenu à la disposition de la Société SOLABIA. Les résultats sont synthétisés au sein de tableaux et interprétés selon la norme NF EN ISO Fabricant : SOLABIA Division Biokar Diagnostics Rue des Quarante Mines - BP BEAUVAIS Cedex Laboratoire expert : ADRIA Développement ZA Creac h Gwen QUIMPER Cedex Méthode à valider : COMPASS Agar avec incubation en 24 heures (recherche) Référentiel de validation : EN ISO (octobre 2003) : microbiologie des aliments - Protocole pour la validation des méthodes alternatives Méthode de référence : EN ISO /A1 (février 2005): Méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement de monocytogenes - Partie 1 : méthode de recherche - Amendement 1 : modification des milieux d'isolement, de la recherche de l'hémolyse et introduction de données de fidélité Etendue de la validation : Tous produits d alimentation humaine et échantillons de l environnement Organisme certificateur : AFNOR Certification Essai effectué sous le couvert de l accréditation ADRIA Développement 4/ janvier 2015

5 Rappel sur la méthode alternative 1 HISTORIQUE DE LA VALIDATION La méthode COMPASS Agar a été validée en 2002 pour la recherche des monocytogenes dans les produits d alimentation humaine et les échantillons de l environnement, avec deux références d attestation : BKR 23/1 09/02 pour la recherche en 48 h et BKR 23/2 11/02 pour la recherche en 24 h. En 2007, la méthode a fait l objet d une étude de reconduction et d extension pour une nouvelle option de confirmation : COMPASS L. mono Agar. La formulation de la gélose COMPASS Agar étant différente de celle de la gélose COMPASS L. mono Agar, une étude complète de validation a été réalisée selon le référentiel EN ISO Les deux attestations de validation précédemment citées ont alors été regroupées en une seule : BKR 23/02 11/02. La méthode a été reconduite en septembre 2010 sans essai complémentaire. En 2011, une étude d extension a été réalisée afin d étendre la détection de spp. ; l étude comparative des méthodes a été entièrement refaite. En 2013, une étude d extension a été effectuée afin d introduire une nouvelle option de confirmation, le bouillon CONFIRM L. mono basé sur la fermentation du rhamnose pour la recherche de monocytogenes par la méthode COMPASS Agar. La méthode COMPASS Agar a été reconduite en ADRIA Développement 5/ janvier 2015

6 2 PROTOCOLE ET PRINCIPE DE LA METHODE ALTERNATIVE SOLABIA COMPASS Agar est un milieu de culture gélosé. La méthode permet la détection de monocytogenes et des autres espèces appartenant au genre spp, après une seule étape d enrichissement sélectif, repiquage et incubation 24 heures des boîtes à 37 C (il est possible de prolonger l'incubation jusqu'à 48 heures). Les colonies caractéristiques de monocytogenes et certaines souches de ivanovii apparaissent bleu à bleu-vert, entourées d un halo opaque. Les autres espèces de forment des colonies bleues à bleu vert, sans halo. La confirmation est ensuite effectuée à partir des colonies caractéristiques isolées sur COMPASS Agar. La confirmation des échantillons positifs se fait de l une des manières suivantes : - monocytogenes : par les tests classiques décrits dans les méthodes normalisées par le CEN ou l ISO (en incluant l étape de purification) en repartant des colonies caractéristiques isolées sur COMPASS Agar, par la gélose CONFIRM' L.mono Agar, par le bouillon CONFIRM L. mono, en mettant en œuvre une autre méthode certifiée NF VALIDATION, de principe différent de celui de la méthode COMPASS Agar. Le protocole validé de la méthode utilisée devra être respecté dans son ensemble, c'est à dire que toutes les étapes antérieures à l'étape intermédiaire de laquelle on repart pour la confirmation doivent être communes aux deux méthodes. Les deux méthodes doivent donc avoir un tronc commun. - spp : par les tests classiques décrits dans les méthodes normalisées par le CEN ou l ISO, en incluant l étape de purification (par exemple, tests Gram et Catalase), en repartant des colonies caractéristiques isolées sur COMPASS Agar, ADRIA Développement 6/ janvier 2015

7 par piqûre sur PALCAM ou par micro-galerie d identification biochimique, à partir d une colonie isolée, en mettant en œuvre une autre méthode certifiée NF VALIDATION, de principe différent de celui de la méthode COMPASS Agar. Le protocole validé de la méthode utilisée devra être respecté dans son ensemble, c'est à dire que toutes les étapes antérieures à l'étape intermédiaire de laquelle on repart pour la confirmation doivent être communes aux deux méthodes. Les deux méthodes doivent donc avoir un tronc commun. Le protocole est donné en Annexe 1. 3 METHODE DE REFERENCE A LAQUELLE LA METHODE ALTERNATIVE A ETE COMPAREE La méthode de référence est la norme NF EN ISO /A1 (février 2005) : méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement de monocytogenes - Partie 1 : méthode de recherche. Le protocole est schématisé en Annexe 2. 4 DOMAINE D APPLICATION DEMANDE Tous produits d alimentation humaine Echantillons de l environnement Essai effectué sous le couvert de l accréditation ADRIA Développement 7/ janvier 2015

8 Principaux résultats obtenus lors de la validation initiale et des études de reconduction et d'extension 1 ETUDE COMPARATIVE DES METHODES 1.1 Etude de validation initiale (2002) Etude de spécificité (24 et 48 h) Au cours de la première validation AFNOR selon le référentiel AFNOR, 50 souches cibles et 30 souches non cibles avaient été testées. Toutes les souches de monocytogenes s étaient développées en 24 h et avaient montré des colonies caractéristiques. Toutes les souches négatives avaient donné : - soit une réaction non caractéristique (colonies bleues sans halo) après 24 h d incubation, - soit une réaction faiblement caractéristique pour L. ivanovii (colonies bleues avec halo) en 48 h - soit une absence de croissance Limite de détection intrinsèque (24 h et 48 h) Elle est de 100 bactéries/ml. ADRIA Développement 8/ janvier 2015

9 1.1.3 Limite de détection en matrices (24 h et 48 h) La limite de détection de la méthode se situe entre 1 et 10 bactéries/25 g. La limite de détection est équivalente à celle de la méthode de référence Etude de justesse - Méthode 24 h : l étude portait sur 481 échantillons dont 67 % étaient naturellement contaminés avec 173 produits positifs. Les résultats étaient les suivants : Tableau récapitulatif toutes catégories confondues Méthode NF EN ISO Méthode + - Total COMPASS L. mono Agar Total Méthode 48 h : l étude portait également sur 481 échantillons dont 67 % étaient naturellement contaminés. Les résultats étaient les suivants : Méthode NF EN ISO Méthode + - Total COMPASS L. mono Agar Total ADRIA Développement 9/ janvier 2015

10 1.2 Etude de reconduction (2007) Exactitude relative, spécificité relative et sensibilité relative L exactitude est l étroitesse de l accord entre le résultat d essai et la valeur de référence acceptée. La spécificité relative est définie comme le degré auquel la méthode est affectée (ou non) par les autres composants dans un échantillon en contenant plusieurs. C est la capacité de la méthode à mesurer avec exactitude un analyte donné, ou sa quantité, dans l échantillon sans qu il y ait d interférence avec les composants non ciblés, tels un effet de la matrice ou un bruit de fond. La sensibilité relative est définie comme la capacité de la méthode alternative à détecter deux quantités différentes d analyte qui ont été mesurées avec la méthode de référence en utilisant une matrice donnée sur toute l étendue de mesure. C est la variation de quantité minimale (accroissement de la concentration d analyte x) qui donne une variation significative du signal mesuré (réponse y). Nombre et nature des échantillons 334 échantillons ont été analysés au total. La répartition par catégorie est donnée dans le tableau ci-après : Catégories Types Positifs Négatifs Total (nombre) (nombre) (nombre) Produits carnés Volaille, porc, bœuf Produits laitiers Laits crus, fromages au lait cru, poudres de lait Produits de la mer Poissons fumés, poissons crus et fruits de mer, poissons cuisinés Végétaux et divers Végétaux cuisinés et assaisonnés, végétaux crus surgelés, divers Echantillons de l environnement Environnement salaison, pâtisserie, poissons et divers TOTAL ADRIA Développement 10/ janvier 2015

11 Contamination artificielle des échantillons Des contaminations artificielles ont été réalisées par des inoculations ou des contaminations croisées. Les souches utilisées, ainsi que les stress appliqués sont donnés en annexe échantillons ont été contaminés artificiellement dont 74 ont donné un résultat positif par l une ou l autre des méthodes. Les échantillons naturellement contaminés représentent donc 54,6 % des échantillons positifs. Protocoles de confirmation Les confirmations ont été réalisées par repiquage d une à cinq colonies suspectes à partir de gélose COMPASS Agar. Les protocoles décrits dans la méthode de référence ont été appliqués (Gram, catalase, hémolyse, CAMP Test et Galerie API ). Résultats des essais A+ = positifs confirmés A- = négatifs immédiats et négatifs après confirmation quand présomptifs positifs Tableau 1 - Couples de résultats des méthodes de référence et alternative Réponses Méthode alternative positive (A+) Méthode alternative négative (A-) Méthode de référence positive (R+) Accord positif (A+/R+) PA = 151 Déviation négative (A-/R+) ND = 7 Méthode de référence négative (R-) Déviation positive (R-/A+) PD = 2 Accord négatif (A-/R-) NA = 174 (PPNA = 3) Tableau 2 - Produits carnés Réponses Méthode de référence positive (R+) Méthode de référence négative (R-) Méthode alternative positive (A+) Méthode alternative négative (A-) Accord positif (A+/R+) PA = 29 Déviation négative (A-/R+) ND = 0 Déviation positive (R-/A+) PD = 0 Accord négatif (A-/R-) NA = 37 (PPNA = 1) ADRIA Développement 11/ janvier 2015

12 Tableau 3 - Produits laitiers Réponses Méthode de référence positive (R+) Méthode de référence négative (R-) Méthode alternative positive (A+) Méthode alternative négative (A-) Accord positif (A+/R+) PA = 30 Déviation négative (A-/R+) ND = 5 Déviation positive (R-/A+) PD = 1 Accord négatif (A-/R-) NA =31 (PPNA = 1) Tableau 4 - Produits de la mer Réponses Méthode de référence positive (R+) Méthode de référence négative (R-) Méthode alternative positive (A+) Méthode alternative négative (A-) Accord positif (A+/R+) PA = 34 Déviation négative (A-/R+) ND = 0 Déviation positive (R-/A+) PD = 0 Accord négatif (A-/R-) NA = 40 Tableau 5 - Végétaux et divers Réponses Méthode de référence positive (R+) Méthode de référence négative (R-) Méthode alternative positive (A+) Méthode alternative négative (A-) Accord positif (A+/R+) PA = 27 Déviation négative (A-/R+) ND = 2 Déviation positive (R-/A+) PD = 1 Accord négatif (A-/R-) NA = 33 (PPNA = 1) Tableau 6 - Echantillons de l environnement Réponses Méthode alternative positive (A+) Méthode alternative négative (A-) Méthode de référence positive (R+) Accord positif (A+/R+) PA =31 Déviation négative (A-/R+) ND = 0 Méthode de référence négative (R-) Déviation positive (R-/A+) PD = 0 Accord négatif (A-/R-) NA = 33 ADRIA Développement 12/ janvier 2015

13 Tableau 7 - Calcul de l exactitude relative (AC), de la sensibilité relative (SE) et de la spécificité relative (SP) PA = Accord positif (R+/A+) PD = déviation positive (R-/A+) NA = Accord négatif (R-/A-) ND = déviation négative (A-/R+) Exactitude Matrices PA NA ND PD N relative AC (%) [100x(PA+NA])/N] N+ PA + ND Sensibilité relative SE (%) [100xPA]/N+] N- NA + PD Spécificité relative SP (%) [100xNA]/N-] Produits carnés , , ,0 Produits laitiers , , ,9 Produits de la pêche , , ,0 Végétaux et divers , , ,1 Environnement , , ,0 TOTAL , , ,9 Les résultats bruts de l exactitude relative sont donnés en Annexe 4. Calcul de l exactitude relative (AC), de la sensibilité relative (SE) et de la spécificité relative (SP) Les valeurs en pourcentage calculées pour la méthode alternative sont les suivantes : Exactitude relative AC = 97,3 Spécificité relative SP = 98,9 Sensibilité relative SE = 95,6 La sensibilité des deux méthodes (recalculée en tenant compte des positifs supplémentaires confirmés de la méthode alternative) est la suivante : Méthode alternative Sensibilité ( PA PD) 95, 6 ( PA PD ND Méthode de référence ( PA ND) 98,8 ( PA PD ND Analyse des discordants Les 9 échantillons discordants sont répartis comme suit : ADRIA Développement 13/ janvier 2015

14 Produits laitiers (5) Echantillon 2710 (Fromage à raclette) Echantillon 178 (Poudre de lait écrémé) Echantillon 321 (Fromage non affiné au lait cru) Echantillon 334 (Brie de Meaux) Echantillon 368 (Fromage à pâte molle au lait cru) Produits végétaux et divers (2) Echantillon 73 (Carottes en rondelles) Echantillon 186 (Carottes en rondelles) 7 DEVIATIONS NEGATIVES Contamination (taux d inoculation/sac) Naturelle Artificielle (5) Naturelle Naturelle Naturelle Naturelle Artificielle (2) Commentaires La présence de monocytogenes n a été mise en évidence qu à partir des isolements issus du Fraser 1. La présence de monocytogenes a été mise en évidence dès les isolements issus du Fraser 1/2 par la méthode de référence. La présence de monocytogenes n a été mise en évidence qu à partir des isolements issus du Fraser 1 Produits laitiers (1) Echantillon 2603 (Fromage au lait cru) Produits végétaux et divers (1) Echantillon 2618 (Farine de blé noir) 2 DEVIATIONS POSITIVES Contamination Naturellement contaminé Naturellement contaminé Commentaires La présence de monocytogenes a été mise en évidence uniquement par la méthode alternative. Seuls des isolats spp autres que monocytogenes ont été mis en évidence par la méthode de référence. La présence de monocytogenes a été mise en évidence uniquement par la méthode alternative. Seuls des isolats spp autres que monocytogenes ont été mis en évidence par la méthode de référence. Le nombre de discordants entre la méthode de référence et la méthode alternative est de : Y = ND + PD = = 9 9 Y 11, m = 2 M = 1 m M : les deux méthodes ne sont pas différentes à = 0,05. L exactitude de la méthode COMPASS Agar est équivalente à celle de la méthode de référence. ADRIA Développement 14/ janvier 2015

15 1.2.2 Niveau de détection relatif Le niveau de détection relatif correspond au nombre le plus petit de microorganismes cultivables qu il est possible de détecter dans l échantillon, avec une probabilité de 50 %, à l aide des méthodes alternative et de référence. Matrices utilisées Cette étude a pour objectif de déterminer les quantités minimales de monocytogenes détectables dans la matrice alimentaire et de les comparer à celles obtenues par la méthode de référence. Les limites de détection seront définies par l analyse de cinq couples (matrice / souche) à quatre niveaux. Six réplicats de chaque condition seront réalisés. Les matrices testées sont les suivantes : - rillettes, inoculées par monocytogenes 1/2 V2/124 - saumon fumé, inoculé par monocytogenes 1/2a BR32, - végétaux crus, inoculés par monocytogenes 1/ /1410, - lait cru, inoculé par monocytogenes 4b 153, - eau de process, inoculée par monocytogenes 877/113 isolée d environnement. Protocole de contamination Six sachets de 25 g ont été préparés par matrice et par taux. Les sachets ont été inoculés individuellement par une suspension bactérienne. Les analyses ont été effectuées à la fois par la méthode de référence et la méthode alternative. Les matrices utilisées ont été analysées avant inoculation par la méthode EN ISO /A1 (2004), afin de s assurer de l absence d une contamination par monocytogenes des échantillons. Un dénombrement de la flore totale a également été réalisé sur chaque matrice. ADRIA Développement 15/ janvier 2015

16 Résultats Tableau 8 - Valeurs des niveaux de détection relatifs Couples (souche / matrice) Niveau de détection relatif (UFC / 25 g ou 25 ml) selon le test de Spearman-Kärber Méthode de référence Méthode alternative Rillettes / monocytogenes 1/2 V2/124 0,4 [0,1 ; 1,3] 0,4 [0,1 ; 1,3] Lait cru / monocytogenes 4b 153 0,6 [0,4 ; 0,9] 0,6 [0,4 ; 1,0] Saumon fumé / monocytogenes 1/2a BR32 0,4 [0,2 ; 1,1] 0,4 [0,2 ; 1,1] Haricot vert / monocytogenes 1/2 1011/1410 0,1 [0,1 ; 0,4] 0,1 [0,1 ; 0,4] Eau de process / monocytogenes 877/113 0,7 [0,5 ; 0,9] 0,7 [0,5 ; 0,9] Le niveau de détection relatif est compris entre 0,1 et 1,3 pour la méthode de référence et la méthode alternative. Les niveaux de détection de la méthode alternative sont similaires à ceux de la méthode de référence Inclusivité / exclusivité L inclusivité est la capacité de la méthode alternative à détecter l analyte cible à partir d un large éventail de souches. L exclusivité est l absence d interférences par un éventail approprié de souches non cibles de la méthode alternative. L objectif de l étude de spécificité est de vérifier que toutes les souches monocytogenes sont détectées par la méthode COMPASS Agar et qu il n y a pas de réaction croisée avec des souches autres que monocytogenes. Protocoles d essai - Protocole pour l inclusivité : Cinquante souches de monocytogenes ont été décongelées et mises en culture en bouillon cœur-cervelle à 37 C. Les souches ont été inoculées à un taux compris entre 10 et 100 cellules pour 225 ml en bouillon Fraser 1/2. Le protocole complet de la méthode COMPASS Agar a ensuite été appliqué. ADRIA Développement 16/ janvier 2015

17 - Protocole pour l exclusivité : Trente souches négatives ont été décongelées et mises en culture en bouillon cœur-cervelle à 37 C. Les souches ont ensuite été inoculées à un taux de 10 5 /225 ml en bouillon nutritif. Le protocole complet de la méthode alternative a ensuite été appliqué. Résultats Les résultats sont présentés en Annexe 5. - Inclusivité : Toutes les souches de monocytogenes testées ont donné des colonies caractéristiques bleues avec une auréole d opacification. - Exclusivité : Sur les trente souches testées, seules les souches L. ivanovii donnent des colonies bleues avec auréole d opacification après 24 h d incubation. On peut noter cependant que les auréoles sont plus petites que celles obtenues avec monocytogenes. La méthode COMPASS Agar est spécifique et sélective Praticabilité La praticabilité a été évaluée d après les treize critères définis dans les exigences relatives aux études de validation : 1. Mode de conditionnement des éléments de la méthode : Les boîtes sont conditionnées en coffret de 20 boîtes, conditionnées en deux sous-unités de 10 boîtes en film plastique. 2. Volume des réactifs : 19 ml par boîte de 90 mm de diamètre 3. Condition de stockage : La température de stockage est mentionnée sur le coffret ; elle est de 2 8 C. ADRIA Développement 17/ janvier 2015

18 4. Modalités d utilisation après première utilisation : Sans objet 5. Equipements ou locaux spécifiques nécessaires : La méthode ne nécessite pas de locaux spécifiques ; elle peut être mise en œuvre dans des locaux et équipements habituellement utilisés dans un laboratoire de microbiologie manipulant des germes pathogènes. 6. Réactifs prêts à l emploi ou à reconstituer : Sans objet 7. Durée de formation de l opérateur non initié à la méthode : Pour un technicien formé aux techniques de microbiologie, moins d une demi-journée est nécessaire pour se former à la méthode. 8. Temps de réel de manipulation et flexibilité de la technique ADRIA Développement 18/ janvier 2015 NF EN ISO Temps en minutes COMPASS Agar Nombre d échantillons Prélèvement et ajout du Fraser 1/ , ,5 Broyage 1,5 7,5 22,5 1,5 7,5 22,5 Repiquage en Fraser 1 0,83 4,38 11,85 Isolement O1/P1 1,65 8,75 24 Isolement COMPASS 0,83 4,38 11,85 Isolement O2/P2 1,65 8,75 24 Lecture O1/P1 1 4,4 15 Lecture COMPASS 1 4,4 10 Lecture O2/P2 1 4,4 15 Total pour des échantillons négatifs (sans colonies suspectes) 11,6 58,2 164,9 7,3 36,3 96,9 Total / échantillon négatif 11,6 11,6 11,0 7,3 7,3 6,5 Isolement sur gélose TSYEA 2 à Tests de confirmation (Hémolyse, CAMP, Gram, Catalase, sucres) Total pour des échantillons positifs ou présentant des colonies suspectes Total / échantillon positif ou présentant des colonies suspectes O1 / P1 = Ottaviani Agosti / Pacalm 8 à 15 31, ,6 122, ,3 59,3 134,9 22,6 à 32,6 24,6 22,9 14,3 11,9 9,0

19 Conclusion : Pour des échantillons négatifs, le temps nécessaire à l analyse par la méthode de référence est plus important que celui nécessaire pour la méthode COMPASS Agar pour des grandes séries. Dans le cas d échantillons positifs ou présentant des colonies suspectes, cette différence est augmentée. 9. Délai d obtention des résultats - Dans le cas où aucune colonie suspecte n est visible sur les milieux, les délais d obtention des résultats sont les suivants : Etape Méthode de référence NF EN ISO Méthode COMPASS Agar Enrichissement primaire Fraser 1/2 J0 J0 1er isolement sur gélose sélective J1 J1 Enrichissement secondaire Fraser 1 J1 2e isolement sur gélose sélective J3 Lecture 1er isolement J2 J3 J2 Lecture 2e isolement J4 J5 - Dans le cas où des colonies suspectes sont présentes sur les géloses sélectives, les délais d obtention des résultats sont donnés ci-après : Etape Méthode de référence NF EN ISO Méthode COMPASS Agar Enrichissement primaire Fraser 1/2 J0 J0 1er isolement sur gélose sélective J1 J1 Enrichissement secondaire Fraser 1 J1 2e isolement sur gélose sélective OAA / Palcam J3 Lecture 1er isolement J2 J3 J2 Repiquage colonies suspectes du 1er isolement sur TSYEA J2 J3 J2 Lecture 2e isolement J4 J5 Repiquage colonies suspectes du 2e isolement sur TSYEA J4 J5 Tests de confirmation (réalisation) J3 J6 J3 Tests de confirmation (lectures) J4 - J7 J4 (J8 J11 (1) ) (J8 (1) ) (1) : Dans le cas où les tests des sucres, selon le protocole de référence, sont réalisés en tubes. ADRIA Développement 19/ janvier 2015

20 Pour un résultat négatif (sans colonies suspectes), 5 jours sont nécessaires pour la méthode de référence contre 2 jours pour la méthode COMPASS Agar. Pour un échantillon positif ou présentant des colonies suspectes, un résultat présomptif à J2 et positif à J3 est obtenu pour la méthode COMPASS Agar. 10. Type de qualification de l opérateur : Elle est identique à celle nécessaire à la mise en œuvre de la méthode de référence NF EN ISO Etapes communes avec la méthode de référence : L étape d enrichissement primaire en Fraser 1/2 est commune avec la méthode de référence. 12. Traçabilité des résultats d analyses : La traçabilité des analyses et des résultats est celle habituellement appliquée en laboratoire, à savoir : la traçabilité des milieux utilisés, les visas des opérateurs, les dates d analyses et l enregistrement des résultats. Elle est la même que celle de la méthode de référence. 13. Maintenance par le laboratoire : Sans objet Conclusion L exactitude de la méthode COMPASS Agar est équivalente à la méthode de référence. Les niveaux de détection de la méthode alternative sont similaires à ceux de la méthode de référence La méthode COMPASS Agar est spécifique et sélective. La méthode COMPASS Agar offre une simplicité de manipulation et un gain de temps dans le délai d obtention des résultats. ADRIA Développement 20/ janvier 2015

21 1.3 Etude d extension (2007) 154 souches cibles et 108 souches non cibles ont été testées Protocole Le protocole est présenté ci-après : Décongélation en BHI 37 C - 24 h Souches non cibles Souches cibles Culture en BHI Culture en bouillon Fraser 1/2 37 C, 24 h 30 C, 24 h Isolement sur Isolement sur COMPASS TSAYE COMPASS TSAYE Agar Agar 37 C, 24 h 37 C, 24 h Strie sur CONFIRM L. mono Agar Strie sur CONFIRM L. mono Agar Lecture En cas de discordance avec le résultat attendu, le protocole de confirmation de la méthode de référence a été appliqué, c est-à-dire : Gram, Catalase, hémolyse, CAMP Test, fermentation du rhamnose et du xylose Résultats Souches cibles Les résultats sont présentés en Annexe 6. Sur 153 souches monocytogenes testées, 152 ADRIA Développement 21/ janvier 2015 ont donné une colonie caractéristique bleue avec auréole d opacification sur gélose COMPASS Agar. Toutes ces souches ont donné une réaction caractéristique sur CONFIRM L. mono Agar.

22 La souche monocytogenes 6072 ne s est pas développée sur COMPASS Agar à partir de Fraser 1/2. Une croissance a été obtenue sur CONFIRM L. mono Agar à partir d une colonie issue de TSYEA. Un halo d opacification a été obtenu avec un test Rhamnose négatif. Cette souche isolée sur ALOA et OCLA donne une réaction caractéristique. La souche donne un test Rhamnose positif en galerie API et en tube. L identification à l espèce monocytogenes a été confirmée Souches non cibles Au total, 106 souches ont été testées. 22 souches innocua testées ont donné des colonies non caractéristiques sur COMPASS Agar et sur CONFIRM L. mono Agar Sur 15 souches ivanovii testées, 14 ont donné des colonies bleues avec auréole sur COMPASS Agar. Ces souches donnent une réaction négative sur CONFIRM L. mono Agar (Rhamnose -), excepté les souches L. ivanovii Ad 616 qui donne une réaction Rhamnose faiblement positive et L. ivanovii Ad 648 qui donne une réaction caractéristique sur CONFIRM L. mono Agar. La souche ivanovii Ad 662 ne donne pas d auréole d opacification sur COMPASS Agar même après 48 heures d incubation. Cette souche ne se développe pas sur CONFIRM L. mono Agar. Les 9 souches seeligeri et 2 souches grayi testées donnent des réactions négatives, à la fois sur COMPASS Agar et sur CONFIRM L. mono Agar. Sur les 21 souches Bacillus cereus testées, 12 donnent une auréole d opacification sur COMPASS Agar avec ou sans croissance (5 souches). Le même phénomène est observé sur gélose CONFIRM L.mono, mais avec un test Rhamnose négatif. Les autres espèces de Bacillus testées ne donnent pas de réaction caractéristique, ni sur gélose COMPASS Agar, ni sur CONFIRM L. mono Agar. Il en est de même pour les souches Enterococcus, Lactococcus et Streptococcus testées, qui ne se développent pas ou ne présentent pas de réaction caractéristique sur COMPASS Agar. ADRIA Développement 22/ janvier 2015

23 1.3.3 Conclusion Inclusivité 152 souches sur 153 souches L. monocytogenes testées montrent une réaction caractéristique, à la fois sur COMPASS Agar et sur CONFIRM L. mono Agar Exclusivité Le test CONFIRM L. mono Agar permet d écarter toutes les souches de ivanovii ou de B. cereus ayant pu montrer une réaction plus ou moins caractéristique sur COMPASS Agar. 1.4 Etude d extension (2011) Exactitude relative, spécificité relative et sensibilité relative L exactitude est l étroitesse de l accord entre le résultat d essai et la valeur de référence acceptée. La spécificité relative est définie comme le degré auquel la méthode est affectée (ou non) par les autres composants dans un échantillon en contenant plusieurs. C est la capacité de la méthode à mesurer avec exactitude un analyte donné, ou sa quantité, dans l échantillon sans qu il y ait d interférence avec les composants non ciblés, tels un effet de la matrice ou un bruit de fond. La sensibilité relative est définie comme la capacité de la méthode alternative à détecter deux quantités différentes d analyte qui ont été mesurées avec la méthode de référence en utilisant une matrice donnée sur toute l étendue de mesure. C est la variation de quantité minimale (accroissement de la concentration d analyte x) qui donne une variation significative du signal mesuré (réponse y) Nombre et nature des échantillons 279 échantillons ont été analysés à la fois par la méthode de référence et la méthode COMPASS Agar. La répartition par catégorie est donnée dans le tableau ci-après : ADRIA Développement 23/ janvier 2015

24 Catégories Carnés Laitiers Produits de la pêche Végétaux Environnement Type spp Positifs spp autre que monocytogenes monocytogenes SOLABIA Négatifs Volaille porc Bœuf et divers Total Laits crus Fromages au lait cru Poudres de lait Total Crus Fumés Cuisinés Total Crus Surgelés Cuisinés Total Eaux de process Surfaces Poussières, eaux de lavage Total Total Total Contamination artificielle des échantillons Des contaminations artificielles ont été réalisées par des inoculations ou des contaminations croisées. 51 échantillons ont été inoculés par des souches stressées. 43 échantillons ont donné un résultat positif. 73,8 % d échantillons naturellement contaminés ont été analysés. Les stress appliqués et l évaluation des stress sont donnés en Annexe Protocoles de confirmation Les colonies typiques de spp. ont été confirmées par piqûre sur gélose Palcam et par réalisation d une galerie biochimique dans le cadre de l étude. ADRIA Développement 24/ janvier 2015

25 Résultats des essais Les interprétations ont été réalisées après 24 h et 48 h d incubation des boîtes. Tableau 9 - Couples de résultats des méthodes de référence et alternative - Tous produits Réponses Incubation 24 h Incubation 48 h Méthode alternative Positive (A+) Méthode alternative Négative (A-) Méthode de référence positive (R+) Accord positif (A+/R+) PA = 158 Déviation négative (A-/R+) ND = 4 (PPND = 1) Méthode de référence négative (R-) Déviation positive (R-/A+) PD =2 Accord négatif (A-/R-) NA = 115 (PPNA = 7) Méthode de référence positive (R+) Accord positif (A+/R+) PA = 160 Déviation négative (A-/R+) ND = 2 (PPND = 2) Méthode de référence négative (R-) Déviation positive (R-/A+) PD = 2 Accord négatif (A-/R-) NA = 115 (PPNA = 8) A+ = positifs confirmés A- = négatifs immédiats et négatifs après confirmation quand présomptifs positifs PA = accord positif NA = accord négatif PD = déviation positive ND = déviation négative PP = présumé positif non confirmé Tableau 10 - Produits carnés Réponses Incubation 24 h Incubation 48 h Méthode alternative Positive (A+) Méthode alternative Négative (A-) Méthode de référence positive (R+) Accord positif (A+/R+) PA = 31 Déviation négative (A-/R+) ND = 1 Méthode de référence négative (R-) Déviation positive (R-/A+) PD = 1 Accord négatif (A-/R-) NA = 21 (PPNA = 3) Méthode de référence positive (R+) Accord positif (A+/R+) PA = 32 Déviation négative (A-/R+) ND = 0 Tableau 11 - Produits laitiers Réponses Incubation 24 h Incubation 48 h Méthode alternative Positive (A+) Méthode alternative Négative (A-) Méthode de référence positive (R+) Accord positif (A+/R+) PA = 33 Déviation négative (A-/R+) ND = 1 (PPND = 1) Méthode de référence négative (R-) Déviation positive (R-/A+) PD = 1 Accord négatif (A-/R-) NA = 22 Méthode de référence positive (R+) Accord positif (A+/R+) PA = 33 Déviation négative (A-/R+) ND = 1 Méthode de référence négative (R-) Déviation positive (R-/A+) PD = 1 Accord négatif (A-/R-) NA = 21 (PPNA = 3) Méthode de référence négative (R-) Déviation positive (R-/A+) PD = 1 Accord négatif (A-/R-) NA = 22 (PPNA = 1) ADRIA Développement 25/ janvier 2015

26 Tableau 12 - Produits de la mer Réponses Incubation 24 h Incubation 48 h Méthode alternative Positive (A+) Méthode alternative Négative (A-) Méthode de référence positive (R+) Accord positif (A+/R+) PA = 36 Déviation négative (A-/R+) ND = 0 Méthode de référence négative (R-) Déviation positive (R-/A+) PD = 0 Accord négatif (A-/R-) NA = 14 (PPNA = 2) Méthode de référence positive (R+) Accord positif (A+/R+) PA = 36 Déviation négative (A-/R+) ND = 0 Méthode de référence négative (R-) Déviation positive (R-/A+) PD = 0 Accord négatif (A-/R-) NA = 14 (PPNA = 1) Tableau 13 - Végétaux Réponses Incubation 24 h Incubation 48 h Méthode alternative Positive (A+) Méthode alternative Négative (A-) Méthode de référence positive (R+) Accord positif (A+/R+) PA = 33 Déviation négative (A-/R+) ND = 1 Méthode de référence négative (R-) Déviation positive (R-/A+) PD = 0 Accord négatif (A-/R-) NA = 22 (PPNA = 2) Méthode de référence positive (R+) Accord positif (A+/R+) PA = 33 Déviation négative (A-/R+) ND = 1 (PPND = 1) Tableau 14 - Echantillons de l environnement Réponses Incubation 24 h Incubation 48 h Méthode alternative Positive (A+) Méthode alternative Négative (A-) Méthode de référence positive (R+) Accord positif (A+/R+) PA = 25 Déviation négative (A-/R+) ND = 1 Méthode de référence négative (R-) Déviation positive (R-/A+) PD = 0 Accord négatif (A-/R-) NA = 36 Méthode de référence positive (R+) Accord positif (A+/R+) PA = 26 Déviation négative (A-/R+) ND = 0 Méthode de référence négative (R-) Déviation positive (R-/A+) PD = 0 Accord négatif (A-/R-) NA = 22 (PPNA = 3) Méthode de référence négative (R-) Déviation positive (R-/A+) PD = 0 Accord négatif (A-/R-) NA = 36 ADRIA Développement 26/ janvier 2015

27 Calcul de l exactitude relative (AC), de la sensibilité relative (SE) et de la spécificité relative (SP) SOLABIA Tableau 15 - Calcul de l exactitude relative (AC), de la sensibilité relative (SE) et de la spécificité relative (SP) Matrices PA NA ND PD N Produits carnés Produits laitiers Produits de la pêche Incubation : 24 h Exactitude Relative AC (%) [100x(PA+NA])/N] N+ PA + ND Sensibilité relative SE (%) [100xPA]/N+] N- NA + PD Spécificité relative SP (%) [100xNA]/N-] , , , , , , , , ,0 Végétaux , , ,0 Environnement , , ,0 TOTAL , , ,3 Matrices PA NA ND PD N Produits carnés Produits laitiers Produits de l a pêche Incubation : 48 h Exactitude Relative AC (%) [100x(PA+NA])/N] N+ PA + ND Sensibilité relative SE (%) [100xPA]/N+] N- NA + PD Spécificité relative SP (%) [100xNA]/N-] , , , , , , , , ,0 Végétaux , , ,0 Environnement , , ,0 TOTAL , , ,3 PA = Accord positif (R+/A+) PD = déviation positive (R-/A+) NA = Accord négatif (R-/A-) ND = déviation négative (A-/R+) Les résultats bruts de l exactitude relative sont donnés en Annexe 8. ADRIA Développement 27/ janvier 2015

28 Les valeurs en pourcentage calculées pour la méthode alternative sont les suivantes : Incubation 24 h Incubation 48 h Exactitude relative 97,8 98,6 Spécificité relative 98,3 98,3 Sensibilité relative 97,5 98,8 La sensibilité des deux méthodes, en tenant compte des positifs supplémentaires obtenus pour la méthode alternative, est la suivante : Incubation 24 h Incubation 48 h Méthode alternative (SE) 97,6 98,8 Méthode de référence (SE) 98,8 98, Analyse des discordants Déviations négatives Après 24 h d incubation, 4 déviations négatives sont observées ; elles sont listées dans le tableau ci-après : N Produit Souches Résultat de la méthode de référence Résultats après éch. identifiées Fraser ½ Colonies suspectes Fraser 1 48 h d incubation 571 Nuggets de innocua dinde Tome au lait Inoculation par + cru innocua Colonies suspectes mais non confirmées Rouleau de pâte brisée monocytogenes Chiffonnette innocua Pour 2 de ces échantillons, la prolongation de l incubation des boîtes de COMPASS Agar jusqu à 48 h a permis de recouvrer les. ADRIA Développement 28/ janvier 2015

29 Déviations positives 2 déviations positives ont été observées pour les échantillons suivants : - échantillon n 433 (viande de bœuf) : échantillon naturellement contaminé par monocytogenes, - échantillon n 1338 (camembert au lait cru) : échantillon artificiellement contaminé par innocua. Tests statistiques selon l annexe F de la norme ISO Les résultats des tests statistiques observés pour une incubation de 24 h sont les suivants : Y = ND + PD = = 6 m = PD = 2 M = 0 m > M, les deux méthodes ne sont pas différentes à α < 0, Conservation des bouillons Fraser 1/2 72 h à 4 C 3 changements de résultats sont observés après stockage des bouillons Fraser 1/2 72 h à 4 C ; ils sont listés ci-après : N éch. Résultat de la méthode alternative Résultat de la Avant stockage Après stockage méthode de référence (PD) - (=) (=) - (ND) (PD) - (=) - L analyse des discordants devient donc : Y = ND + PD = = 5 Y < 6 Aucun test statistique n est disponible Les deux méthodes ne sont pas différentes à α < 0,05. ADRIA Développement 29/ janvier 2015

30 1.4.2 Niveau de détection relatif Le niveau de détection relatif correspond au nombre le plus petit de micro-organismes cultivables qu il est possible de détecter dans l échantillon, avec une probabilité de 50 %, à l aide des méthodes alternative et de référence Matrices utilisées Cette étude a pour objectif de déterminer les quantités minimales de monocytogenes détectables dans la matrice alimentaire et de les comparer à celles obtenues par la méthode de référence. Les limites de détection ont été définies par l analyse du couple (matrice / souche) à quatre niveaux. Six réplicats de chaque condition ont été réalisés. Les couples matrices / souches testés sont les suivantes : - saumon fumé inoculé par innocua 1, - fromage frais de chèvre inoculé par ivanovii Ad Protocole de contamination Six sachets de 25 g ont été préparés par matrice et par taux. Les sachets ont été inoculés individuellement par une suspension bactérienne. Les analyses ont été effectuées à la fois par la méthode de référence et la méthode alternative. Les matrices utilisées ont été analysées avant inoculation par la méthode EN ISO /A1 (2004), afin de s assurer de l absence d une contamination par monocytogenes des échantillons. Un dénombrement de la flore totale a également été réalisé sur chaque matrice. ADRIA Développement 30/ janvier 2015

31 Résultats Tableau 16 - Valeurs des niveaux de détection relatifs Couples (souche, matrice) Niveau de détection relatif (UFC / 25 g) selon le test de Spearman-Kärber 1 Méthode de référence Méthode alternative Saumon fumé / innocua 1 0,3 [0,2 ; 0,4] 0,3 [0,2 ; 0,4] Fromage frais de chèvre / ivanovii Ad 991 0,8 [0,5 ; 1,5] 0,8 [0,5 ; 1,5] Le niveau de détection relatif est compris entre 0,2 et 1,5 pour la méthode de référence et la méthode alternative. Le niveau de détection de la méthode alternative est identique à celui de la méthode de référence pour les deux couples matrice / souche testés Inclusivité - Exclusivité L objectif de l étude de spécificité est de vérifier que toutes les souches monocytogenes sont détectées par la méthode COMPASS Agar et qu il n y a pas de réaction croisée avec des souches autres que monocytogenes. Les résultats de l étude d extension réalisée en 2007 ont été repris : souches de monocytogene, 22 souches de Listerai innocua, 15 souches de ivanovii, 9 souches de seeligeri et enfin 25 souches de grayi avaient été testées en inclusivité. Une souche de ivanovii sps londoniensis a été testée afin de compléter l étude souches ont été testées en exclusivité. Les résultats sont présentés en Annexe 9. 1 "Hitchins A. Proposed Use of a 50 % Limit of Detection Value in Defining Uncertainty Limits in the Validation of Presence-Absence Microbial Detection Methods, Draft 10th December, 2003". ADRIA Développement 31/ janvier 2015

32 Inclusivité Pour rappel, lors des précédentes études de validation et d extension, 152 souches sur 153 souches L. monocytogenes ont donné des colonies caractéristiques sur COMPASS Agar. Une souche ( monocytogenes 6072) ne s est pas développée sur le milieu. Des essais réalisés sur cette même souche en 2011 ont mis en évidence une croissance très faible sur la gélose COMPASS Agar après 24 h d incubation (micro-colonies avec halo opaque important) et la présence de colonies caractéristiques après 48 h d incubation. Toutes les souches de spp. autres que monocytogenes ont donné des colonies caractéristiques bleues avec ou sans halo sur la gélose COMPASS Agar Exclusivité Aucune des souches testées n a donné de colonies caractéristiques sur gélose COMPASS Agar gélose. La méthode COMPASS Agar est spécifique et sélective Conclusion La méthode COMPASS Agar montre une étude d exactitude, de spécificité et de sensibilité relatives satisfaisante pour la recherche de spp. dans les échantillons d alimentation humaine et les échantillons d environnement. Les niveaux de détection de la méthode COMPASS Agar sont similaires à ceux de la méthode de référence. La méthode est sélective et spécifique. ADRIA Développement 32/ janvier 2015

33 1.5 Etude d extension (2013) En 2013, une étude d extension a été effectuée afin d introduire une nouvelle option de confirmation, le bouillon CONFIRM L. mono basé sur la fermentation du rhamnose pour la recherche de monocytogenes par la méthode COMPASS Agar. Cette option de confirmation avait déjà fait l objet d une extension de validation pour la méthode de dénombrement, avec des tests effectués pour 50 souches cibles et 30 souches non cibles. L étude a été complétée avec 100 souches cibles et 70 souches non cibles pour être conforme avec les règles techniques de l AFNOR. Le bouillon CONFIRM L.mono permet la mise en évidence de la fermentation du rhamnose, test positif pour monocytogenes et test négatif pour ivanovii. Le test positif apparaît sous la forme d une coloration jaune qui survient après incubation du bouillon pendant 6 à 24 h à 37 C ± 1 C Inclusivité et exclusivité Protocoles L objectif de l étude de spécificité est de vérifier que toutes les souches monocytogenes sont détectées par la méthode COMPASS Agar et qu il n y a pas de réaction croisée avec des souches autres que monocytogenes. L étude a donc été complétée en testant 100 souches cibles et 70 souches non cibles en appliquant le protocole suivant : ADRIA Développement 33/ janvier 2015

34 Décongélation en BHI 37 C 24 h Souches non cibles Souches cibles Culture en BHI 37 C ± 1 C, 24 h ± 2 h Culture en bouillon Fraser ½ 30 C ± 1 C, 24 h ± 2 h Isolement sur Isolement sur TSYEA COMPASS Agar TSYEA COMPASS Agar Incubation 37 C ± 1 C, 24 h ± 2 h Incubation 37 C ± 1 C, 24 h ± 2 h Repiquage d une colonie en bouillon CONFIRM L.mono Repiquage d une colonie en bouillon CONFIRM L.mono 37 C ± 1 C 6 h et 24 h 37 C ± 1 C 6 h et 24 h Lecture Résultat positif : virage au jaune du milieu Résultats Les résultats sont reportés en Annexe 10. Inclusivité Pour le test de confirmation CONFIRM L. mono, 145 souches ont donné un test positif (virage au jaune) après 6 h d incubation à 37 C. Pour les souches monocytogenes 7711/7516, A00C036, Ad 235, Ad 626 et A00C054, le virage d indicateur était plus faible (couleur brune) à 6 h. Pour 3 d entre elles, la poursuite de l incubation jusqu à 24 h a permis d obtenir un test positif. ADRIA Développement 34/ janvier 2015

35 Par contre, pour les souches monocytogenes 7711/7516 et A00C054, le test est resté douteux. Des résultats identiques ont été obtenus à partir de la gélose TSYEA. Exclusivité Sur les 70 souches testées, seules les 20 souches de ivanovii ont donné des colonies typiques avec halo sur gélose COMPASS Agar ; toutes ces souches ont donné un test de CONFIRM L. mono négatif (après 6 h et 24 d incubation). La méthode COMPASS Agar est spécifique et sélective Conclusion Le test CONFIRM L. mono apparaît spécifique et sélectif. En cas de réaction dite «douteuse» après 24 h, il est souhaitable de réaliser une simple galerie biochimique ou l ensemble des tests de confirmation de la méthode de référence ISO La méthode est sélective et spécifique. ADRIA Développement 35/ janvier 2015

36 2 ETUDES INTER-LABORATOIRES 2.1 Etude de validation initiale (2002) Les synthèses des résultats obtenus par les laboratoires collaborateurs sont présentées ci-après : - Méthode 24 h Taux de Nombre Nombre de Nombre Pourcentage Nombre total contamination d échantillons résultats de résultats de d échantillons (UFC/25 g) analysés négatifs positifs concordance , (21)* 95, , ,0 * Un laboratoire n a pas confirmé la présence de monocytogenes après réalisation des tests de confirmation sur les colonies suspectes obtenues sur COMPASS L. mono Agar pour un échantillon (Hémolyse -, CAMP -, Rhamnose +, Xylose -). Les tests d hémolyse et de CAMP ont été refaits sur les colonies par le laboratoire expert qui les a bien trouvés positifs. - Méthode 48 h Taux de Nombre Nombre de Nombre Pourcentage Nombre total contamination d échantillons résultats de résultats de d échantillons (UFC/25 g) analysés négatifs positifs concordance , (21)* 95, , ,0 * Un laboratoire n a pas confirmé la présence de monocytogenes après réalisation des tests de confirmation sur les colonies suspectes obtenues sur COMPASS L. mono Agar pour un échantillon (Hémolyse -, CAMP -, Rhamnose +, Xylose -). Les tests d hémolyse et de CAMP ont été refaits sur les colonies par le laboratoire expert qui les a bien trouvés positifs. ADRIA Développement 36/ janvier 2015

37 2.2 Etude de reconduction (2007) Les résultats de l ensemble des laboratoires participants ont été acquis après 24 h d incubation des géloses COMPASS Agar Organisation de l étude Quatorze colis ont été livrés mais seulement douze laboratoires ont participé à l étude. Du lait pasteurisé demi-écrémé a été inoculé par monocytogenes 4b 153. Les flacons de lait ont été inoculés individuellement à raison de 8 flacons par taux et par laboratoire, soit 24 flacons à analyser par laboratoire Modalités de préparation et de contamination des échantillons (y compris le niveau de contamination) Tous les échantillons ont été répartis par le laboratoire expert en flacons stériles, à raison de 25 ml par flacon, avant d être contaminés. Préparation des suspensions contaminantes Deux suspensions (125 cellules/ml et 25 cellules/ml) ont été préparées à partir d une culture d une nuit en bouillon BHI à 37 C selon le protocole décrit dans les exigences relatives aux études préliminaires et collaboratives des règles techniques de l AFNOR. Protocole de contamination des échantillons L inoculation au taux faible a été réalisée à l aide de 200 µl de la suspension à 25 cellules/ml et l inoculation à taux fort a été effectuée par 200 µl de la suspension à 125 cellules/ml. Après inoculation, les échantillons ont été homogénéisés et fermés hermétiquement par un parafilm, puis stockés au froid avant expédition. ADRIA Développement 37/ janvier 2015