Épreuve E3 unité U31. Coefficient 3 ; durée 3 heures. Biochimie et technologie d'analyse LES PROTEINES

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1 Épreuve E3 unité U31 Coefficient 3 ; durée 3 heures Biochimie et technologie d'analyse LES PROTEINES Calculatrice et dictionnaire Anglais Français autorisés 1. Structures des protéines (11 points) 1.1. Définir en 2 lignes maximum pour chaque définition : structure primaire, puis structure secondaire, puis structure tertiaire et enfin structure quaternaire d'une protéine Décrire la "liaison peptidique". Quelles sont les autres liaisons covalentes que l'on peut trouver à l'intérieur des protéines? 1.3. Le prion est un agent infectieux contenant au moins une protéine, la protéine PrP sc variant anormal et pathologique d'une protéine cellulaire normale PrP c. Des prions extraits de fractions cérébrales d'animaux malades, ont été purifiés et traités par les réactifs ci-dessous : (a) l'urée ; (b) le dodécyl sulfate de sodium ; (c) des protéases dont la trypsine ; (d) des nucléases ; (e) du 2-mercapto-éthanol Exposer l'action de chacun des réactifs (a) à (e) sur une structure protéique. Le 2-mercapto-éthanol n'a aucune action sur la protéine PrP : interpréter ce résultat La protéine PrP existe sous deux formes (cf document 1 fig A et B) Commenter chacune des figures A et B en précisant ce que représentent les symboles de ces schémas. Décrire en vous aidant de schémas, l'hélice α et le feuillet plissé β. Quel est le principal type de liaison stabilisatrice de ces motifs (représentation schématique exigée)? 2. Étude d'un coenzyme : le NAD + (5 points) 2.1. Donner le schéma structural du NAD Quel est son mode d'action et dans quel type de réaction est-il impliqué? 2.3. Quelles sont les propriétés spectrales de ce coenzyme? Citer des applications analytiques de ces propriétés. 3. Effet d'un inhibiteur (10 points) En étudiant l'effet d'un inhibiteur sur la vitesse d'une réaction enzymatique à un seul substrat, on a mesuré les vitesses initiales de la réaction en fonction de la concentration en substrat initial, en absence et en présence de l'inhibiteur. Fanny Demay BTS BioAnalyses & Contrôles 1/7

2 Les résultats sont résumés dans le tableau suivant : Concentration en v i en µmol/l/min substrat en mmol/l concentration de l'inhibiteur (mmol/l) 0 0,5 0,05 0,33 0,20 0,10 0,50 0,33 0,20 0,67 0,50 0,40 0,80 0,67 0,50 0,83 0,71 Burk Donner l'équation de Michaélis. En déduire l'équation des doubles inverses de Lineweaver et 3.2. A l'aide d'une représentation graphique de votre choix, déterminer le type d'inhibition. En déduire la relation permettant de calculer la valeur du K i en fonction de la concentration en inhibiteur. Donner une définition de K i Calculer par régression linéaire les valeurs de V m, K M, sans et avec inhibiteur. Calculer la valeur de la constante d'inhibition K i. 4. Immobilisation d'une enzyme (5 points) Pour une utilisation en production industrielle une enzyme est immobilisée. Citer et décrire brièvement, les principales méthodes d'immobilisation des enzymes. Quelles sont les modifications prévisibles des propriétés de l'enzyme après immobilisation? 5. Détermination de la masse molaire des protéines (4 points) Citer et décrire en 2 lignes maximum, les différentes techniques de détermination de la masse molaire des protéines (indiquer l'ordre de grandeur de la précision de chaque méthode) 6. Électrophorèse des protéines (17 points) 6.1. Donner le principe général de la méthode d'électrophorèse des protéines en conditions non dénaturantes ; préciser en particulier quels seront les critères de séparation des protéines et les rôles du tampon Donner le principe général de la méthode d'électrophorèse des protéines en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) ; préciser en particulier quels seront les critères de séparation des protéines et les rôles des constituants du tampon de charge : SDS, glycérol et 2-mercapto-éthanol SDS PAGE Donner les propriétés du gel de polyacrylamide : constituants, obtention, différentes réticulations ; préciser le rôle et fonctionnement du gel de concentration (stacking gel) et du gel de migration (running gel) Faire un schéma de principe commenté du montage utilisé pour réaliser une électrophorèse SDS PAGE ; préciser en particulier les bornes et le sens de migration Cette technique est utilisée dans le kit Prionics AG de recherche du prion pathologique (document 2) pour effectuer un contrôle de la masse molaire. Fanny Demay BTS BioAnalyses & Contrôles 2/7

3 Dans ce kit 2 enzymes sont utilisées. A quelle classe appartiennent elles? Décrire sommairement les réactions catalysées Dans le but de contrôler la pureté d'échantillons de protéines du Prion (PrP), extraits de fractions cérébrales d'animaux malades, une expérience de détermination de masse molaire est réalisée (document 3). Attribuer chaque marqueur à la bande correspondante de la piste 1 (justifier la réponse). Décrire le principe de détermination de la masse molaire des protéines par cette technique. Calculer la masse molaire de la protéine du puit n 2 (justifier la réponse). 7. Purification d'une enzyme : (8 points) Un extrait cellulaire C d'un volume total de 50 ml contient 28 mg de protéine par ml dont l'enzyme d'intérêt E. 10 µl de cet extrait C catalysent la transformation de 0,70 µmol de substrat en 5 min, dans des conditions standard de ph, de température et à concentration saturante de substrat pendant la durée de la mesure Calculer l'activité spécifique de l'extrait C en U/mg de protéine et l'activité totale en U, sachant que 1 unité (U) d'enzyme E est définie comme la quantité d'enzyme catalysant la transformation d'une micromole de substrat par minute dans les conditions opératoires L'extrait cellulaire est fractionné par précipitation au sulfate d'ammonium. On recueille la fraction F1, précipitée entre 20 et 40% de saturation. Cette fraction F1 est redissoute dans un volume minimal ; le volume de F1 est de 10 ml et contient 43 mg par ml de protéine. 10µL de F1 catalysent la transformation de 1,30 µmol de substrat en 2 min Donner le principe et l'intérêt de la précipitation au sulfate d'ammonium. Que signifie «précipitée entre 20 et 40% de saturation»? Calculer l'activité spécifique de l'extrait F1 en U/mg de protéine et l'activité totale en U Définir le taux de purification (ou enrichissement) et le rendement lors d'une purification. Calculer le taux de purification (ou enrichissement) et le rendement de l'étape décrite Citer d'autres procédés de purification applicables pour améliorer l'enrichissement. Remarque : chaque calcul sera justifié par l'écriture d'une formule littérale commentée. Fanny Demay BTS BioAnalyses & Contrôles 3/7

4 Document 1 Représentation schématique de la protéine PrP. Fanny Demay BTS BioAnalyses & Contrôles 4/7

5 Document 2 Matériel inclus dans le kit Matériel inclus et protocole simplifié (kit Prionics AG) 1. Concentré de tampon d'homogénéisation. Tampon de charge. (5 fois concentré, à diluer avant l'emploi). Un flacon contient 200 ml de solution tampon d'homogénéisation. Diluer avec de l'eau ultra pure dans un volume final de 1 litre. Un flacon contient 25mL de tampon de charge gel SDS polyacrylamide (PAGE). 2. Concentré de tampon blocage PVDF. 6. Échantillon de contrôle moléculaire. (5 fois concentré, à diluer avant l'emploi). Un flacon contient 100 ml de solution concentrée de PVP, remplaçant la caséine du lait. Diluer le tampon de blocage avec de l'eau ultra pure dans un volume final de 0,5 litre. 3. Tampon de digestion. 7. 1er anticorps (6H4). Un tube de 4 ml de tampon de digestion. A +4 C, le tampon de digestion est stable pendant 12 mois. 4. Protéinase K. 8. 2e anticorps-ap. Un tube de 4 ml de protéinase K. A stocker à +4 C, il est préférable de faire des aliquotes et de les stocker à -20 C. En tube de 200µL il est composé de PrP normal non-digéré et de marqueurs moléculaire 97,0 ; 66,0 ; 45,0 ; 30,0 ; 20,1 ; 14,4 kd) inclus dans du tampon de charge. Un tube contient 30µL d'anticorps monoclonal anti- PrP (IgGi anti-prp de souris) à concentration de 2 mg/ml. A diluer à 1:5 000 en tampon de blocage PVDF. Un tube contient 30µL à 0.3 mg/ml d'igg-ap de chèvre (conjugué avec une phosphatase alcaline contre le premier anticorps). A diluera 1:5 000 avec du TBST. 5. Digestion stop. 10. Concentré de tampon de luminescence. (Pefabloc SC). Un tube de 4 ml de solution qui bloque l'activité protéolytique de la protéinase K. A stocker à +4 C. (10 fois concentré, à diluer avant l'emploi). Un flacon contient 27 ml de tampon concentré de luminescence concentré. Diluer ce tampon avec de l'eau ultra pure dans un volume final de 270 ml. Fanny Demay BTS BioAnalyses & Contrôles 5/7

6 Homogénéisation et Digestion des échantillons Document 2 (suite) 1. Homogénéisation Couper et peser un échantillon de moelle (0,4 0,8g) Diluer 10X grâce au tampon d'homogénéisation (p/v), ex: 5 ml pour 0.5g de tissu et homogénéiser 1 min avec de l'homogénéisateur OMNI. Prélever deux fois 1 ml par homogénat et déposer dans la plaque matrice (on travaille en doublon) 2. Digestion Déposer 10µL de tampon de digestion dans chaque puits de la plaque de digestion Transférer 100µL d'homogénat de la plaque matrice à la plaque de digestion Ajouter 10µL de protéinase K, bien homogénéiser Digérer 40 min à 47 C (Afficher 50 C au bloc chauffant) Stopper la réaction avec 10µL de solution stop Électrophorèse en gel Étapes préliminaires 3. Dénaturation des échantillons 4. Dépôt des échantillons Préparer les gels NuPAGE. Chauffer le contrôle moléculaire à 65 C durant 2 min. Ajouter 100µL de tampon de charge aux échantillons digérés, bien homogénéiser et chauffer 5 min à 96 C. Les échantillons chauffés peuvent être congelés et conservés à -20 C. Déposer 10µL de l'échantillon de contrôle dans le premier puits du gel Déposer 10µL d'échantillon à la pipette multicanaux Remplir la cuve d'électrophorèse avec de la solution tampon de migration Ajouter 500µL d'antioxydant, mais seulement dans la cuve INTÉRIEURE 5. Électrophorèse Faire migrer à 150V pendant 1 heure Hybridation Étapes préliminaires 6. Réalisation du sandwich de transfert 7. Transfert des protéines 8. Coloration des protéines Détection immuologique Laver la membrane PVDF (la tremper quelques secondes dans du méthanol), puis équilibrer durant 15 min dans du tampon de transfert Remplir l'unité de transfert avec du tampon de transfert réfrigéré Dans la cassette de transfert placer une éponge, du papier Whatman puis la membrane. Ouvrir l'enveloppe des gels, en retirer les gels et les placer sur la membrane. Recouvrir les gels avec du papier Whatman, et de la deuxième éponge. Fermer la cassette de transfert et la placer dans la cuve de transfert. Mettre sous tension de 150V durant 1 heure à +4 C. Attention au sens de transfert Reprendre la membrane et vérifier le transfert en colorant les protéines liées à la membrane PVDF au Ponceau S durant 2 min Repérer la position des puits et des marqueurs moléculaires Rincer la membrane avec du TBST jusqu'à disparition de la couleur rouge 9. Incuber la membrane dans env. 50 ml de tampon blocage PVDF durant 0,5-1 heure à température ambiante. 10. Diluer le 1er anticorps dans 50 ml de tampon blocage PVDF (1 : 5 000), verser sur à la membrane et incuber 1-2 heures à température ambiante (ou 12-18h à +4 C) Laver la membrane 4 fois 5-10min avec du TBST 11. Diluer le 2e anticorps-ap, (IgG de chèvre anti-souris associé à une phosphatase alcaline) dans 50 ml de TBST (1 : 5 000), verser sur la membrane et incuber 0,5-1 heure à température ambiante Laver la membrane 4 fois 5 10 min avec du TBST 12. Équilibrer la membrane durant 5 min dans du tampon de luminescence Diluer 100µL de CDP-Star (50x) dans 5 ml de tampon de luminescence Éliminer l'excédent de liquide sur membrane en l'égouttant Répartir le ddp-staftsur la membrane et incuber 5 min à température ambiante Éliminer l'excédent de liquide avec un Kleenex doux, couvrir la membrane avec une feuille de film alimentaire Exposer un HyperFilm ECL à la membrane durant 1 min, développer le film. Plusieurs expositions sont possibles pour optimiser la révélation. Fanny Demay BTS BioAnalyses & Contrôles 6/7

7 Document 3 Électrophorèse des protéines L'électrophorèse de deux échantillons, provenant du même animal, a été réalisée à ph 7 sur gel de polyacrylamide à 10% en milieu SDS. Chaque échantillon renferme 0,25µg de protéine dans 0,1 ml de tampon Le premier échantillon après traitement à la protéinase K a été déposé dans le puits n 2. Le second (non traité à la protéinase K) a été déposé dans le puits n 3. Les marqueurs de masse moléculaire (puits n 1) utilisés sont les suivants : Masse molaire log (masse molaire) Alpha lactalbumine 14,4 kdaltons 4,158 inhibiteur trypsique 20,1 kdaltons 4,303 anhydrase carbonique 29 kdaltons 4,462 ovalbumine 45 kdaltons 4,653 sérum albumine 66 kdaltons 4,820 phosphorylase b 97,4 kdaltons 4,989 β-galactosidase 116 kdaltons 5,064 Borne (-) Puit n 1 Puit n 2 Puit n 3 (a) (b) (c) (d) (e) (f) (g) Borne (+) Électrophorèse des protéines : migration une heure à 150 V ; coloration au bleu de Coomassie R 250. Fanny Demay BTS BioAnalyses & Contrôles 7/7