Outils diagnostiques de la résistance : pratiques actuelles et perspectives
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- Danielle Croteau
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1 Outils diagnostiques de la résistance : pratiques actuelles et perspectives Pr Emmanuelle Cambau Laboratoire associé du centre National de Référence des Mycobactéries et résistance des mycobactéries aux antituberculeux Groupe Hospitalier Saint Louis-Lariboisière-Fernand Widal, AP-HP Université Paris Diderot
2 Prédiction clinique des méthodes de détection de la résistance TESTS IN VITRO Sensible Résistant Intermédiaire? Efficacité IN VIVO Guérison Echec On ne sait pas!
3 Diagnostic de la résistance aux antituberculeux Méthodes phénotypiques: Antibiogramme Mesure la croissance en présence d antibiotique Utilise la culture en milieu solide (LJ, 7H11) ou liquide (7H9, MGIT) => Lent : 2 à 6 semaines Détecte la résistance et la sensibilité Pour tous les antituberculeux connus Méthodes moléculaires : génotype de résistance Détecte des mutations de gènes, connues pour donner une résistance à l ATB considéré Utilise la PCR-séquence => Rapide (24h) Détecte la résistance (partiellement la sensibilité) Principaux antituberculeux
4 Méthodes moléculaires Rationnel de la méthode Connaître les gènes impliqués Connaitre les mutations responsables de la résistance Bonne concordance génotype/phénotype Choix des méthodes Faisable dans un laboratoire de diagnostic Délai pour le résultat (2h à plusieurs jours) «Accréditable» Détection / exhaustivité des mutations connues
5 Mutations rpob conférant dans la résistance à la rifampicine chez M. tuberculosis Mutations ponctuelles de rpob dans la région * de la sous-unité beta de l ARN polymérase Leu Gln Asp Ser His Ser Leu Pro Pourcentage des mutations Leu Pro Tyr Val Leu Tyr Asp Arg Leu Leu Trp parmi souches Rif-R 10% 35% 45% Pro *numérotation des codons utilisée chez E.coli Telenti 1993, Honore 1993, Williams 1994 et 1998, Musser 1995, 1998
6 Analyse des gènes de résistance aux antituberculeux : RESISTOME Antibiotique Rifampicine Isoniazide Ethionamide Ethambutol Pyrazinamide Streptomycin Amikacin Capreomycin Fluoroquinolones PAS Cyclosérine Linézolide Bedaquiline Gene principal rpob promoteur inha, katg codon 315 promoteur inha, etha embb codon 306 pnca (tout le gène) rpsl (43, 88), rrs region 530 rrs region 1401 and 1490 rrs region 1401 and 1490 gyra (codons 88 to 94)???? rrl atpe complément gene inha ethr? pyrazinamidase gidb tlya gyrb
7 Analyse des gènes de résistance aux antituberculeux : RESISTOME Antibiotique Rifampicine Isoniazide Ethionamide Ethambutol Pyrazinamide Cyclosérine Linézolide rpob promoteur inha, katg codon 315 promoteur inha, etha pnca (tout le gène)?? rrl complément gene InhA ethr? pyrazinamidase Streptomycin rpsl (43, 88), rrs region 530 gidb Détection d une souche Amikacin rrs region 1401 and 1490 Capreomycin rrs region 1401 and 1490 tlya MDR (R Rmp et R Inh) Fluoroquinolones gyra (codons 88 to 94) gyrb PAS?? Bedaquiline Gene principal embb codon 306 atpe
8 Analyse des gènes de résistance aux antituberculeux : RESISTOME Antibiotique Rifampicine Isoniazide Ethionamide Ethambutol Pyrazinamide Streptomycin Amikacine Capreomycin Fluoroquinolones PAS Cyclosérine Linézolide rpob promoteur inha, katg codon 315 promoteur inha, etha pnca (tout le gène) rrs region 1401 and 1490 rrs region 1401 and 1490 gyra (codons 88 to 94)???? rrl complément gene inha ethr pyrazinamidase gidb tlya gyrb (R Rmp + R Inh + RFq + RAga) atpe Bedaquiline Gene principal embb codon 306 rpsl (43, 88), rrs region 530 Détection d une souche XDR?
9 Méthode 1 : PCR puis hybridation inverse 2. PCR Multiplex =>fragments d ADN amplifiés 1. Bandelette préhybridée avec sondes oligonucléotidiques 3. hybridation ADN-ADN Bande positive La séquence du fragment de PCR est identique à celle de la sonde Bande négative La séquence du fragment de PCR est différente à celle de la sonde
10 InnoLiPA Rif TB (Innogenetics) Gène rpob => détection de la résistance à la rifampicine
11 Genotype MTBDRplus (Hain, Biocentric) Résistance à la Rifampicine Résistance à l isoniazide rpob katg codon315 promoteur inha
12 GenoType MTBDRsl (Hain, Biocentric) Résistance aux fluoroquinolones gyra Résistance aux aminosides Résistance à l éthambutol rrs embb
13 Méthode 2 : PCR en temps réel PCR Détection de mutations pendant l amplification (sondes, température de fusion, HRMA) Trousses Magicplex MDR-TB Real-time Detection (Seegene) Roche Light cycler BD max Technique «maison»
14 Gene Xpert MTB/RIF Cepheid (USA) gène rpob => résistance à la rifampicine méthode facilement praticable Résultat en 2 heures après réception au laboratoire Boehme CC et al. NEJM 2010
15 Fragmentation Méthode Next generation 3 : séquençage sequencing technologies d ADN Génome entier Tagging Amplification Sequencing Lomanet al Nat Rev Microbiol10: 599
16 Fragmentation Méthode Next generation 3: séquençage sequencing technologies d ADN Génome entier Ion Torrent Tagging Illumina sequencer Resistome (45 PCR) sequencing TB resistance project (Broad Institute) Genome sequencing services on the Web Amplification Sequencing Daum LT et al. 2012, Niemann et al. 2009, Comas I 2011, Liu cui Hua et al. 2012)
17 Sur quel échantillon va t-on appliquer la détection de la résistance? Culture de M. tuberculosis complex (> 10 8 bacilles/ml) Prélèvements baar pos (M+) (> 10 5 bacilles/ml) Prélèvements baar neg-cult pos (M0) (0 à 10 4 bacilles/ml) Taux de réussite du test (rendement): 100% culture vs. 80% prélèvement M+ vs < 50% prélèvement M0
18 Performances des méthodes moléculaires détectant la résistance % concordance pour la résistance à la rifampicine (marqueur de multi résistance) concordance moins bonne pour les autres antibiotiques: 50% (ethambutol), 70% (aminosides), 90% (fluoroquinolones) «Faux résistant» = Spécificité PCR<100%, mutations ne conférant pas de résistance, mutations compensatoires «Faux sensible» = mutations dans autre gène ou non détectée, hétérorésistance< 10% Traore 2000, Truffot 2002, Hillman 2005, Hillman 2007, Boehme 2010, Held 2010 Brossier 2006, Brossier 2010, Comas 2011
19 Proportions de résistants mutants au cours d un traitement par monothérapie Log % 50% R/S 1% R/S R/S Month1 Month2 Month3 0.1% Month4 Month5 Month6 Month7 Month % R/S R/S S R Susceptible Population Resistant mutant
20 Problème de l héterorésistance héteroresistance < 100% mutant resistant Sensibilité des méthodes génotypiques Allèle sauvage uniquement si mutant < 10% mélange génotypes S et R entre 10% et 100% Streicher EM 2012
21 Détection moléculaire de la résistance : indications? Cas avec ATCD de traitement (cas nés en France et à l étranger) Nouveaux cas importés de pays à forte prévalence de résistance Cas collectivité (risque de transmission) Nouveaux cas VIH+ A confirmer par antibiogramme
22 Objectifs pour les outils de détection moléculaire de la résistance Laboratories should aim to identify TB and rifampicin resistance in over 90% of cases directly from smear + sputum where resources are available for this rapidly within 1-2 days
23 Nous avons toujours besoin de méthodes phénotypiques (antibiogramme) pour donner la sensibilité d une souche et choisir le traitement pour le patient MDR
24 Mycobacterium tuberculosis complex = Pathogènes du groupe 3 Manipulation en NSB3 (P3) Surtout cultures de BK multi-résistant Arrêté CE 2005, Arrêté JO 2007, 2012
25 Antibiogramme par la méthode des proportions en LJ
26 Antibiogramme par la méthode des proportions en milieu liquide MGIT Témoin Strep S INH R Rif Eth S S
27 Antibiogramme en 3 dimensions en cours de développement Développé à partir de la Méthode TBExist en MGIT 960 (Becton-Dickinson) 1. Mesure de la CMI =>gamme de concentrations, détermination de niveaux de résistance 2. Mesure de la proportion de mutants résistants => plusieurs inoculums 3. Mesures dynamiques en fonction du temps : =>suivi de la croissance des témoins et des tubes avec antibiotiques
28 Stratégie opérationnelle pour la détection des cas de tuberculose MDR Labo J0-J1 Labo J10-J30 Microscopie : M+,M0 en cas de prélèvement M+ Amplification génique (PCR) + Détection de la résistance à la rifampicine si facteurs de risque Si mutation, appel CNR identification rapide des cultures positives tests de sensibilité ATB isoniazide et rifampicine si détection mutation rpob, envoi souche CNR CNR Génotypage type résistome (>10 gènes) Antibiogramme complet LJ + complement MGIT/Tbexist si besoin
29 Conclusions et perspectives Besoin d une détection moléculaire rapide et facile de la résistance à la rifampicine Besoin de résultats phénotypiques fiables pour tous les antituberculeux afin de construire le traitement des MDR Continuer à étudier la concordance génotypique / phénotypique pour chacun des ATTB
30 Informations complémentaires Centre National de Référence des Mycobactéries et résistance des mycobactéries aux antituberculeux (CNR MyRMA) : http//cnrmyctb.free.fr ECDC laboratory Handbook: ESCMID group on mycobacterial infections (ESGMYC):
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Mécanismes de la résistance aux médicaments chez Mycobacterium tuberculosis
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