DIAGNOSTIC PRÉNATAL NON INVASIF : LE SANG MATERNEL
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- Solange Sénéchal
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1 6 LE TEST
2 DIAGNOSTIC PRÉNATAL NON INVASIF : LE SANG MATERNEL Source : les cellules trophoblastiques Fetal cell Cell isolation Détection 5-6SA Disparition rapide après accouchement Pas de persistance après grossesse 7 Selon Bodurtha J, Strauss JF III. N Engl J Med 2012;366:64-73.
3 DIAGNOSTIC PRÉNATAL NON INVASIF ADN fœtal libre plasmatique 1997 Découverte ADN fœtal plasmatique 2001 Diagnostic de sexe fœtal 2002 Génotypage rhésus D? 2011 Test génétique non invasif de la trisomie 21 8
4 DIAGNOSTIC PRÉNATAL NON INVASIF : CHALLENGE LE «BACKGROUND» ADN MATERNEL Fraction fœtale : 5-10 % âge gestationnel body mass index BMI anomalie chromosomique chez le fœtus ethnie? Fetal cell Cell isolation ADN maternel ADN fœtal 9 Selon Bodurtha J, Strauss JF III. N Engl J Med 2012;366:64-73.
5 ANALYSE DE L ADN FŒTAL CIRCULANT : LE «BACKGROUND» ADN MATERNEL ADN fœtal ADN fœtal Analyse qualitative (Recherche de marqueurs fœtaux absents du génome maternel ) Détermination du sexe fœtal Génotypage RHD, Ce et Kell Achondroplasie, hypochondroplasie et nanisme thanatophore (de novo) Analyse quantitative (Marqueurs fœtaux spécifiques ou non) Aneuploïdies 10
6 ANALYSE QUANTITATIVE NON SPÉCIFIQUE! Challenge : exemple d un fœtus féminin 46,XX ADN fœtal 47,XX,+21 ADN fœtal 90 ADN maternel 10 ADN fœtal 21 ADN fœtal autre 90 ADN maternel 15 ADN fœtal 21 ADN fœtal autre Chromosome 21 : 1.35% -> 1.45% 11
7 DOSAGE CHROMOSOMIQUE FŒTAL! Quantification par «Massively Parallel Sequencing (MPS)» 18 patientes (terme médian: 18 semaines) Tous les cas (9) correctement identifiés 14 patientes (terme médian : 14 semaines) Tous les cas (9) correctement identifiés 12
8 SÉQUENÇAGE À HAUT DÉBIT : UNE RUPTURE TECHNOLOGIQUE Par run Séquençage SANGER Séquençage MPS Petit débit Séquençage MPS Haut débit Ratio Instrument ABI3130XL Illumina MiSeq Illumina 1500 Taille des fragments 500bp 27bp 27bp Durée 6h 5h 34h Nombre de reads millions (single reads 36bp) 1.5 milliards (single reads 27bp) Capacité 50KB ( ) 15GB (5 10+9) 300GB ( ) X 300 X Génome humain 3GB Exome humain 30MB AUDI A1 105CH ARIANE CH 13
9 ANALYSE QUANTITATIVE NON SPÉCIFIQUE! Concept Quantité attendue pour le chromosome 21 Chromosome 21 en excès Fan HC, Quake SR. Sensitivity of noninvasive prenatal detection of fetal aneuploidy from maternal plasma using shotgun sequencing is 14 limited only by counting statistics. PLoS One May 3;5(5):e10439
10 DOSAGE CHROMOSOMIQUE FŒTAL PAR MPS 1 Préparation de l échantillon Délai entre prélèvement sanguin et préparation du plasma Double centrifugation du plasma Extraction de l ADN plasmatique Purification compatible avec les réactions enzymatiques ultérieures (biais)! Stabiliser l ADN fœtal! Conserver la fraction fœtale! Enrichir en ADN fœtal 15 J0
11 DOSAGE CHROMOSOMIQUE FŒTAL PAR MPS 2 Séquençage (part 1) Préparation de la «librairie» Réparation des extrémités Adénylation des extrémités Ligation des adaptateurs (+index) Enrichissement de la «librairie»! Préparer les fragments d ADN à être séquencés 16 J1
12 DOSAGE CHROMOSOMIQUE FŒTAL PAR MPS 2 Séquençage (part 2) Qualification de la «librairie» Quantification de la «librairie» Normalisation de la «librairie» Multiplexage Hybridation sur flow cell Clusterisation! Traiter un grand nombre d échantillons! Transférer sur le support final de séquence 17 J2
13 J2 18
14 DOSAGE CHROMOSOMIQUE FŒTAL PAR MPS 2 Séquençage (part 3) Séquençage > 10 millions de cluster par ligne (X8 par flow cell) 300GB 19 J2 J5
15 DOSAGE CHROMOSOMIQUE FŒTAL PAR MPS 3 Analyse bioinformatique Par run machine >1 Terabyte! Transformer les images en séquence ADN! Analyser les séquences! Faire les calculs 20 J0 J5
16 DOSAGE CHROMOSOMIQUE FŒTAL PAR MPS TCCGCCCAGGCCATGAGGGACCTGGAAATGGCTGAT% x9 10+6/échantillon Calcul de la fraction chromosomique =% de l échantillon par rapport au total des chromosomes Calcul du Z-score =% sample-mean% référence/sd médiane% référence Interprétation 21
17 DOSAGE CHROMOSOMIQUE FŒTAL PAR MPS 21-3,00 0,00 3,00 6,00 9,00 12,00 15,00 18,00 21,00 24,00 27,00 30, ,00 0,00 3,00 6,00 9,00 12,00 15,00 18,00 21,00 24,00 27,00 30, ,00 0,00 3,00 6,00 9,00 12,00 15,00 18,00 21,00 24,00 27,00 30,00 22 Un Z-score de 3 signifie que la valeur mesurée est distante de 3 écarts-types de la valeur cible. La probabilité de trouver une valeur à l extérieur est de 0,17% pour une distribution normale. Si une valeur est à l extérieur, cela ne peut s expliquer par les simples fluctuations statistiques.
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