Sujet de thèse: Etude de la biodégradation d un insecticide persistant : la chlordécone (CLD).

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1 Référence CEA/Irtelis: SL-DSV Sujet de thèse: Etude de la biodégradation d un insecticide persistant : la chlordécone (CLD). Directeur de thèse : Denis Le Paslier, DR CNRS CEA/DSV/IG/ Genoscope & CNRS UMR8030 Laboratoire de Métagénomique des Procaryotes 2, rue Gaston Crémieux Evry cedex [email protected] Tel : Contacts: Denis Le Paslier ou Pierre-Loïc Saaidi (Maître de conférence, UEVE) [email protected] Université/Ecole Doctorale Université d Evry Val d Essonne / Des Génomes aux Organismes (GAO) Mots clefs : Chlordecone, Kepone, biodégradation, insecticide, chimie analytique, biocatalyse Résumé La chlordécone (CLD) est un pesticide organochloré massivement utilisé aux Antilles pour combattre le charançon du bananier. Des études ont montré que l'exposition continue à la CLD peut entraîner des lésions des reins, du système nerveux, des cancers et une stérilité masculine. La persistance de la CLD dans les sols (jardin familiaux par exemple) et sa présence dans les eaux (sources, rivières, mangroves etc.) pose de nombreux problèmes de santé publique et socioéconomiques. Afin d étudier la possible biodégradation de la CLD, des cultures microbiennes d enrichissement ont été initiées et analysées au cours du temps par des méthodes de biologie moléculaire, microbiologie et de chimie analytique. L analyse en GC-MS de certains de ces échantillons montre l apparition de plusieurs produits partiellement déchlorés probablement issus de la biodégradation de la CLD. La structure et les mécanismes de formation de ces métabolites ne sont pas encore établis. Les objectifs de ce sujet de thèse, réalisée dans un cadre pluridisciplinaire (biologie moléculaire, chimie, biochimie), sont triples : d une part, isoler et déterminer la structure des métabolites détectés, en les produisant par voie biologique et/ou chimique ; d autre part, étudier les mécanismes enzymatiques permettant leur formation et leur dégradation à l aide des outils analytiques GC-MS et LC-MS ; enfin, bénéficier de l expertise acquise au sein de l équipe pour étendre le projet de biodégradation aux autres polluants organochlorés de la même famille, le mirex et le kélévane, qui possèdent la même structure polycyclique perchlorée et relancer de nouvelles cultures microbiennes avec les métabolites isolés.

2 Summary Chlordecone (CLD), an organochlorine pesticide, was extensively used in the French West Indies to control the banana black weevil Cosmopolites sordidus. Previous studies have demonstrated that continuous exposure to CLD can lead to kidney damage, neurological dysfunctions, cancers and male infertility. Persistence of CLD in soils and water (mountain sources, rivers, mangroves etc.) causes global public health and socio-economic problems. In order to investigate the possible biodegradation of CLD, microbial enrichment cultures have been conducted and studied over a long period of time using molecular biology, microbiological and chemical analytical tools. GC-MS analysis of a number of cultures permitted the detection of newly appearing, partially dechlorinated derivatives, possibly coming from CLD biodegradation. Structures of these metabolites and mechanisms of their formation need to be established. This PhD research is part of an interdisciplinary project (molecular biology, chemistry, biochemistry, bioinformatics etc.) and has three main objectives: 1. Isolation and structural elucidation of the detected metabolites produced via biological and/or chemical processes; 2. Investigation of the degradative metabolism allowing their formation using GC-MS and LC-MS techniques; 3. Extension of the degradation project to two other pesticides, mirex and kelevan, possessing CLD s identical perchlorinated cage-structure and isolated metabolites. Projet de recherche Contexte Les conséquences de la pollution des sols et l'eau par les pesticides peuvent être extrêmement dommageables pour l'environnement et la santé humaine. La cyclodiène chlordécone (CLD) (1, 1a, 3, 3a, 4, 5, 5, 5a, 5b, 6-Décachlorooctahydro-1, 3, 4-méthéno-2H-cyclobuta[cd]pentalèn-2- one) est un organochloré synthétique (C 10 Cl 10 O), produit antiparasitaire qui a longtemps été utilisé en Martinique et en Guadeloupe pour lutter contre le charançon du bananier, Cosmopolites sorditus. Cet insecticide hydrophobe s adsorbe facilement sur les composants organiques du sol (Clostre et al., 2013 ; Woignier et al., 2013). La CLD est très peu biodisponible et très persistante dans les sols (de plusieurs décades à plusieurs siècles selon le type de sol) (Cabidoche et al., 2009). Le lessivage des sols des bananeraies est le vecteur principal du transfert de la chlordécone vers les ressources en eaux douce (sources, rivières) et marine (mangroves, estuaires). Depuis la découverte de la pollution des eaux en 1999, et l'identification de la CLD dans des racines de légumineuses en 2002, des évaluations de risque ont été entreprises avec la participation des autorités de santé publique. Un rapport parlementaire (2009) a été à l origine des plans chlordécone et , visant essentiellement à cartographier et quantifier la CLD dans les sols de la Guadeloupe et de la Martinique. La CLD a été classée par l'oms comme l'un des plus dangereux produits chimiques (UNEP, 2007). Des études ont montré que l'exposition continue à la CLD peut entraîner des lésions des reins, du système nerveux, des cancers et une stérilité masculine (ARTAC, 2007 ; Multignier et al., 2010 ; Boucher et al., 2013 ; Emeville et al., 2013). Depuis l arrêt de sa production puis de son interdiction il n'y a pratiquement pas eu de recherche concernant sa biodégradation. Les rares études publiées mettent en avant une possible diminution de la CLD dans des échantillons sans identifier

3 clairement les métabolites de dégradation associés (Orndorff & Colwell, 1980 ; George & Claxton, 1988 ; Jablonski et al., 1996 ; Fernandez-Bayo et al., 2013). Ce projet se propose de mener un ensemble d'études en vue d'obtenir une microflore capable de dégrader la CLD. L'objectif ultime est de caractériser chimiquement les produits de dégradation, d'isoler les bactéries effectuant la dégradation et de caractériser les enzymes impliquées. Résultats préliminaires Afin de tester la biodégradabilité de la CLD nous avons initié ces dernières années un certain nombre de cultures microbiennes anaérobies en présence de CLD. Les propriétés physicochimiques de la CLD et les doses massives employées (saturation) rendaient impossible sa quantification de façon fiable, le suivi de son éventuelle disparition ainsi que le suivi de la croissance bactérienne. Le développement de méthodes de chimie analytique (GC/MS) a permis de détecter de nombreux composés chlorés dérivés de la CLD dont certains n avaient jamais été mis en évidence jusque-là. L analyse fine des spectres de masse a rendu possible le classement des composés par nombre d atomes de chlore présents. Une base de données a ainsi été créée regroupant les composés par temps de rétention pour une méthode GC donnée et par nombre d atomes de chlore présents. De façon très intéressante, plusieurs cultures microbiennes inoculées avec des quantités plus faibles de CLD montrent l apparition et l accumulation de plusieurs de ces métabolites dont un nettement majoritaire (que nous avons appelé B) ainsi que la diminution (voire la quasi-disparition) du pic correspondant à la CLD. Ces cultures sont en cours d analyse par différentes méthodes (chimie, microbiologie et métagénomique). Programme de recherche Les travaux de recherche de cette thèse seront réalisés dans un cadre pluridisciplinaire : chimie, biochimie, microbiologie, génomique et bio-informatique. Les objectifs de ce sujet de thèse sont multiples : - poursuivre et compléter le travail de sélection des cultures microbiennes en élucidant la structure des métabolites de biodégradation de la CLD. - étudier les mécanismes enzymatiques impliqués en relation avec l analyse des métagénomes obtenus à partir de l ADN extrait de ces cultures d enrichissement. - bénéficier des cultures microbiennes sélectionnées et de l expertise acquise au sein de l équipe pour étendre le projet de biodégradation aux autres polluants organochlorés de la même famille, le mirex et le kelevan, possédant tous deux la même structure polycyclique perchlorée (fig. 1). Les métabolites chlorés seront produits et isolés à partir des cultures microbiennes selon les techniques de purification classiques de la chimie organique (extractions et chromatographies phase normale et/ou phase inverse). Le suivi des différentes étapes sera réalisé par analyse GC- MS et/ou LC-MS selon la nature des échantillons. En complément de la formule brute déterminée par spectrométrie de masse (MS), chaque métabolite sera étudié par résonance magnétique nucléaire (RMN) mono- et bidimensionnelle afin d élucider complètement sa structure. Les caractéristiques particulières de cette famille de composés, fortement chlorés et

4 polycycliques, pourrait en outre faciliter l obtention de monocristaux permettant alors de réaliser des études par diffraction des rayons X. Une étude des voies de fragmentation par MS des métabolites de structure connue permettra alors de prédire la structure des autres métabolites sur la base de leur spectre de masse. Tout comme la CLD au démarrage du projet, les métabolites produits seront à leur tour utilisés comme source de carbone et/ou d énergie dans de nouvelles cultures microbiennes. Une étude de la réactivité chimique de la CLD sera également engagée sur la base des données expérimentales déjà disponibles (Scherer et al ; Griffin et al ; Scherer, 1972) afin de mimer les activités enzymatiques et fournir des substrats aux enzymes de la voie. Figure 1 : structure de la chlordécone et de quelques dérivés connus La troisième partie du travail, menée en parallèle des deux premières, consistera à rechercher des cultures microbiennes capables de dégrader la CLD en présence de mirex et de kelevan. Bien que ce projet soit motivé par un but pratique, c'est un projet de recherche fondamentale préliminaire à de plus amples études sur la biorestauration des sols contaminés Références bibliographiques UNEP/POPS/POPRC.3/20/Ad.2. Programme des Nations Unies pour l'environnement. Comité d'étude des polluants organiques persistants. 2007, 15 pages. ARTAC. Rapport d'expertise et d'audit externe concernant la pollution par les pesticides en Martinique. Conséquences agrobiologiques, alimentaires et sanitaires et proposition d'un plan de sauvegarde en cinq points. Association pour la Recherche Thérapeutique Anti-Cancéreuse. 2007, 54 pages.

5 Rapport de l'office parlementaire d'évaluation des choix scientifiques et technologiques sur les impacts de l'utilisation de la chlordécone et des pesticides aux Antilles : bilan et perspectives d'évolution par Jean-Yves Le Déaut et Catherine Procaccia, 24 juin 2009, 223 pages. Boucher O, Simard MN, Muckle G, Rouget F, Kadhel P, Bataille H, Chajès V, Dallaire R, Monfort C, Thomé JP, Multigner L, Cordier S. Exposure to an organochlorine pesticide (chlordecone) and development of 18-month-old infants. Neurotoxicology Mar;35: Cabidoche YM, Achard R, Cattan P, Clermont-Dauphin C, Massat F, Sansoulet J. Long-term pollution by chlordecone of tropical volcanic soils in the French West Indies: a simple leaching model accounts for current residue. Environ Pollut May;157(5): Clostre F, Lesueur-Jannoyer M, Achard R, Letourmy P, Cabidoche YM, Cattan P. Decision support tool for soil sampling of heterogeneous pesticide (chlordecone) pollution. Environ Sci Pollut Res Int Sep 8. Emeville E, Giton F, Giusti A, Oliva A, Fiet J, Thomé JP, Blanchet P, Multigner L. Persistent organochlorine pollutants with endocrine activity and blood steroid hormone levels in middleaged men. PLoS One Jun 13;8(6):e Fernandez-Bayo J.D., Saison C., Voltz M., Disko U., Hofmann D., Berns A. E. Chlordecone fate and mineralisation in a tropical soil (andosol) microcosm under aerobic conditions. Sci Total Environ : George SE, Claxton LD. Biotransformation of chlordecone by Pseudomonas species. Xenobiotica Apr;18(4): Griffin GW, Price AK. Perchloro cage compounds. I. Structural studies J Org Chem : Jablonski P.E., Pheasant D.J., Ferry J.G. Conversion of kepone by Methanosarcina thermophila FEMS Microbiology Letters. 1996;139: Orndorff SA, Colwell RR. Microbial transformation of kepone. Appl Environ Microbiol Feb;39(2): Scherer KV, Ungefug GA, Lunt RL. Bridgehead reactivity in a perchlorinated cage compound. J Am Chem Soc (12): Scherer KV. Anionic fragmentation of a perchlorinated cage amine a remarkable rearrangement. Tet Lett :

6 Woignier T, Fernandes P, Soler A, Clostre F, Carles C, Rangon L, Lesueur-Jannoyer M. Soil microstructure and organic matter: Keys for chlordecone sequestration. J Hazard Mater Nov 15;262: